人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗及其製備方法
2023-06-18 17:26:16 1
專利名稱：：人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及生物工程領域，具體地是涉及由人胚肺成纖維細胞製備的乙型腦炎滅活疫苗和減毒活疫苗，及其製備工藝。
背景技術：
：乙型腦炎是一種由中樞神經系統急性病毒感染導致的傳染性疾病，簡稱乙腦，由乙腦病毒引起，其發病年齡以IO歲以下兒童為主。乙腦傳染源是被感染的人或動物，再通過蚊蟲的叮咬進而傳播給其他人或動物，豬與蚊被認為是該病毒的主要長期儲存宿主和擴散宿主。乙腦在流行地區年發病率高達10-100/10萬，近30億人口生活在乙型腦炎流行區，主要包括東南亞及西太平洋地區，此地區每年新生兒超過7000萬。乙腦在亞洲每年至少引起50000臨床病例和10000例病死，約85%病例發生在15歲以下兒童，IO歲以下兒童易產生嚴重後遺症，如失語、癱瘓、精神異常、痴呆、肢體彎曲畸形、扭轉痙攣等。最近幾十年中，乙型腦炎的數起暴發流行越來越向曾經是非流行的地區擴大，同時伴隨很高的病死率和嚴重的持久性神經系統後遺症，因而在亞洲很多國家和地區，乙腦成為嚴重的公共健康問題。中國乙型腦炎的流行具有明顯的季節性特點，多發於夏、秋季節，90%病例發生於7、8、9三個月。流行性乙型腦炎病毒(JapaneseBEncephalitisVirus,JEV)簡稱乙腦病毒，屬黃病毒科黃病毒屬。病毒顆粒呈二十面體對稱結構，直徑45-50nm，病毒顆粒由核心、包膜和刺突組成。基因為正鏈單股RNA，RNA包被於多肽的衣殼C中，組成病毒顆粒的核心。其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白prM/M。目前還沒有治療乙型腦炎的特效藥物，從環境方面控制其傳播的效果不理想。乙型腦炎疫苗的免疫接種是控制乙型腦炎疾病最為經濟有效地措施。預防乙型腦炎對於保護兒童健康更是顯得極為重要。我4國規定15歲以下未成年人可免費接種乙腦疫苗，接種乙腦疫苗後，人群的保護率可達90%以上。由於乙型腦炎疫苗基礎免疫始於6月齡的健康嬰幼兒，對疫苗的首要要求就是要保證疫苗有足夠的安全性。目前世界上應用較多的主要有三種乙腦疫苗，第一種是以日本為代表的用感染乙腦病毒的小白鼠腦組織製備的純化乙腦滅活疫苗以及中國生產的原代地鼠腎細胞培養的乙腦滅活疫苗，這類滅活疫苗免疫原性弱，需多次接種，造成疫苗中殘存的動物組織外源物質不可避免地帶入人體，是多見過敏反應的重要原因，例如，經鼠腦組織培養的滅活疫苗以疼痛、發紅、腫脹的局部副反應約為20%，包括頭疼、發熱、肌痛、不適和胃腸道症狀的全身性反應為10~30%，而由原代地鼠腎細胞培養的滅活疫苗超過38'C的發熱高達12。/。，在減少牛血清殘留量後，超過38。C的發熱減至6%;第二種是原代地鼠腎乙腦減毒疫苗，疫苗的細胞基質也來源於普通級動物，無法保證不攜帶外源因子。減毒活疫苗雖然可以減少多次接種引發的過敏反應，但有報導稱減毒疫苗病毒在有免疫功能障礙的動物體內可增殖，並引起死亡，在接種免疫功能障礙者時，有可能造成安全性問題。其次，活疫苗因存在諸多問題而尚未得到WHO的認可，因其有可能導致嚴重的潛在病毒汙染問題；第三種是北京生物製品研究所以Vero細胞為培養基質生產的凍幹乙腦純化滅活疫苗，這種疫苗已在中國境內投入使用，雖避免了上述疫苗缺陷，在安全性上有顯著提高，但Vero細胞超過232代次後在裸鼠體內有致瘤現象，因此，美國FDA要求用Vero細胞生產的疫苗，生產過程中要有去除細胞的工藝，必須要保證成品中無殘餘細胞成分。現正在開發研究的新型乙腦疫苗有美國和韓國合作的狗腎減毒活疫苗，這種疫苗仍使用動物細胞系，也不能避免帶入動物組織外源物質，仍存在安全性問題。源於人體組織的人胚肺成纖維細胞來源清楚，包括捐獻者的年齡、性別、種族、地域、體能及健康狀況、細胞直接來源的組織或器官、細胞世代數等。人胚肺成纖維細胞系經過數十年研究，其生長特性、遺傳穩定的特性、外源因子(細菌、真菌、支原體及病毒)汙染檢查、致腫瘤陰性等特徵被充分驗證。更為重要的是人胚肺成纖維細胞本身源於人體細胞，當用於疫苗製造時人胚肺成纖維細胞的殘餘成分不會成為超敏反應原，基本不會引起接種者超敏反應。因此，從質量控制以及安全性角度看，相較於鼠腦組織、原代地鼠腎細胞和Vero細胞系等外源細胞系，人胚肺成纖維細胞沒有潛在的不安全隱患，是製備疫苗理想的細胞系。現在已經有越來越多利用人胚肺成纖維細胞製備的疫苗面市，例如用MRC-5或WI-38細胞系製備的風疹病毒疫苗、用MRC-5細胞系製備的A肝病毒疫苗、用FrhL-2細胞系製備的輪狀病毒疫苗、用MRC-5細胞製備的水痘病毒疫苗，還有就是國際上公認的金標準狂犬病疫苗就是用人胚肺成纖維細胞培養的疫苗。因此，用人胚肺成纖維細胞製備乙腦疫苗能夠顯著的提高現行乙型腦炎病毒疫苗的質量，有利於質量控制。但常用的乙型腦炎毒株P3株、SA14-14-2株和Nakayama株等對人胚肺成纖維細胞不敏感，因此，乙腦疫苗長期以來都無法使用人胚肺成纖維細胞生產。目前還未見關於系統的利用人胚肺成纖維細胞生產乙型腦炎疫苗的報導。如何進一步增強乙腦疫苗免疫效果，提高使用安全性，就成為現有技術中急需解決的技術難題。
發明內容本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種抗原純度高、免疫效果好、安全性高的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗。本發明的另一個目的是提供了一種適合大規模工業化生產且可滿足國內外市場對乙腦疫苗需求的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗及其製備方法。為實現本發明的第一個目的，本發明的技術方案是該人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗在製備過程中病毒培養所用的細胞系是人胚肺成纖維細胞。公知，源於人體組織的人胚肺成纖維細胞來源清楚，包括捐獻者的年齡、性別、種族、地域、體能及健康狀況、細胞直接來源的組織或器官、細胞世代數等。人胚肺成纖維細胞系經過數十年研究，其生長特性、遺傳穩定的特性、外源因子(細菌、真菌、支原體及病毒)汙染檢査、致腫瘤陰性等特徵被充分驗證。更為重要的是人胚肺成纖維細胞本身源於人體細胞，當用於疫苗製造時人胚肺成纖維細胞的殘餘成分不會成為超敏反應原，基本不會引起接種者超敏反應。因此，從質量控制以及安全性角度看，相較於鼠腦組織、原代地鼠腎細胞和Vero細胞系等外源細胞系，人胚肺成纖維細胞沒有潛在的不安全隱患，是製備疫苗理想的細胞系。本發明通過採用因此人胚肺成纖維細胞作為疫苗製備的病毒培養所用的細胞系，顯著的提高現行乙型腦炎病毒疫苗的質量和安全性，有利於質量控制。進一步設置是所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗為乙型腦炎滅活病毒疫苗或乙型腦炎減毒活疫苗。進一步設置是所述人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗在製備過程中病毒培養所用的人胚肺成纖維細胞包括但不僅限於人胚肺成纖維細胞系WI-38、KMB17、IMR-卯、MRC-5和2BS。首先建立人胚肺成纖維細胞種子庫和工作庫，並對細胞庫細胞進行系統檢定。在製備疫苗之前，需先進行細胞的復甦、培養和擴增，使細胞量達到生產需要。細胞復甦、培養和擴增所使用的細胞培養液可選擇199培養液或MEM培養液，MEM培養液的使用效果比較理想。細胞培養液中所含小牛血清的體積分數比為8。/。-10y。，使用碳酸氫鈉調細胞培養液PH到7.08.0之間，同時在細胞培養液中加入適量慶大黴素，以防止細菌汙染。在35"C-37t:下對細胞進行培養擴增。由於本發明中人胚肺成纖維細胞為附著依賴性細胞，細胞在培養過程需附著一定載體生長，則本發明中細胞的培養方式可以釆用轉瓶培養，也可以使用微載體反應器培養。人胚肺成纖維細胞在微載體反應器中培養時，微載體使用量為27g/L，轉速為30~55轉/分鐘，可選擇的微載體有GE公司的Cytodexl、2、3型，經試驗證明Cytodex2效果較滿意。在細胞培養過程中，細胞的分種率可以按照生產量需要調整，一般為1:21:10。進一步設置是本發明中接種於人胚肺成纖維細胞的乙型腦炎病毒包括用於製備乙腦滅活疫苗的P3株和Nakayama株、以及用於製備乙腦減毒活疫苗的SA14-14-2株。分別對不同毒株建立毒種庫，分為主種子庫和工作種子庫，並進行檢定。毒種製備均採用接種病毒於人胚肺成纖維細胞的方法。本發明中在生長成片的人胚肺成纖維細胞上接種乙腦病毒(包括P3株、Nakayama株和SA14-14-2株)前，應先用平衡鹽溶液如Earle氏液等衝洗細胞表面，去除殘留牛血清後，在已生長成片的人胚肺成纖維細胞上接種乙腦病毒及加入細胞維持液，維持液中加入0.2%0.5%的人血白蛋白對病毒生長有利。其中病毒接種率MOI範圍在0.10.0001之間均可，實驗表明，接種率在0.001時，相同培養時間內病毒滴度最高，效果較好。經34天培養後，即可收穫病毒液。乙腦病毒在人胚肺成纖維細胞上的生長繁殖可維持較長時間，因此病毒收穫可採取多次收取方式，一般2~3天可收穫一次。對收穫的病毒液需及時測定病毒滴度，要求每批所獲病毒滴度均應在107』pfU/ml以上，只有高滴度的病毒液才能保證疫苗效力。病毒滴定方法最好採用公知的蝕斑法。為實現本發明的第二個目的，本發明的技術方案是包括以下步驟(1)採用人胚肺成纖維細胞作為疫苗製備的病毒培養所用的細胞系；(2)人胚肺成纖維細胞的復甦、培養、擴增；(3)在人胚肺成纖維細胞上接種乙腦病毒毒種；(4)收穫病毒液；(5)澄清超濾濃縮；(6)疫苗純化；(7)稀釋分裝並加入保護劑後凍幹製成純化疫苗。上述步驟(1)與步驟(2)中人胚肺成纖維細胞的復甦和培養擴增所使用的細胞培養液為199培養液或MEM培養液，細胞培養液中牛血清含量的體積分數比8%-10%，且該細胞的培養方式採用轉瓶培養或使用微載體反應器培養。以人胚肺成纖維細胞製備的生物製品安全性的關鍵指標是殘餘牛血清含量。按中國藥典2005版有關生物製品的規程要求，疫苗的牛血清殘留量必須小於50ng/ml。經反覆實驗研究，本發明中提出的疫苗純化是通過柱層析方法來實現的。純化疫苗過程是首先將濃縮疫苗經離子交換柱層析除去部分雜蛋白，再經凝膠過濾柱層析進一步去除殘留雜質。本發明的純化工藝中優選的離子交換柱有DEAE-SepharoseFF等，選擇性的吸附濃縮疫苗疫苗液中的雜蛋白；而凝膠過濾層析是層析技術中最簡單，條件最溫和，對保持生物大分子活性最有利的方法，適合分離分子量懸殊的物質，乙腦病毒的分子量在400萬以上，與疫苗中的雜蛋白分子量相差較大，故使用凝膠柱層析可以非常方便有效地去除濃縮疫苗中殘留的小分子雜質，該凝膠過濾柱可以是SepharoseCL-6B、Sepharose4FF、SphacrylS-500HR柱或其他凝膠，檢測結果表明，經兩步層析柱純化後，疫苗總蛋白含量減少約99%以上，牛血清殘餘量也符合中國藥典2005版有關生物製品的規程要求。層析後的疫苗純化液再經過超濾濃縮，使最終純化疫苗與粗疫苗相比濃縮倍數達到40~80倍即可。以上所述乙腦純化疫苗方法均包括由P3株、SA14-14-2株和Nakayama株生產的乙腦滅活疫苗和乙腦減毒活疫苗。進一步設置是所述的步驟(4)與步驟(5)之間還進行了病毒液滅活操作以製備乙腦滅活疫苗。經過病毒液滅活操作可以制的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎滅活疫苗，用於製備乙腦滅活疫苗的乙腦病毒收穫病毒液的滅活採用P-丙內酯為滅活劑，所述的滅活後的粗疫苗需要進行濃縮提純製備成為純疫苗製品，本發明中選用超濾濃縮的方法對得到的粗疫苗進行濃縮，一般是用截留10萬30萬分子量的超濾器濃縮疫苗，濃縮至20倍以上，然後對濃縮液進行純化，而製備乙腦減毒活疫苗的乙腦病毒收穫病毒液即為減毒活疫苗粗疫苗。進一步設置是所述的步驟(1)病毒培養所用的人胚肺成纖維細胞包括但不僅限於細胞系WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5和2BS。進一步設置是疫苗的純化通過柱層析法來實現。製備工藝中所涉及的滅活疫苗包括但不僅限於由乙型腦炎病毒P3株製備，減毒活疫苗包括但不僅限於由乙型腦炎病毒SA14-14-株製備。以人胚肺成纖維細胞製備的生物製品安全性的關鍵指標是殘餘牛血清含量。按中國藥典2005版有關生物製品的規程要求，疫苗的牛血清殘留量必須小於50ng/ml。經反覆實驗研究，本發明中提出的疫苗純化是通過柱層析方法來實現的。純化疫苗過程是首先將濃縮疫苗經離子交換柱層析除去部分雜蛋白，再經凝膠過濾柱層析進一步去除殘留雜質。本發明的純化工藝中優選的離子交換柱有DEAE-SepharoseFF等，選擇性的吸附濃縮疫苗疫苗液中的雜蛋白；而凝膠過濾層析是層析技術中最簡單，條件最溫和，對保持生物大分子活性最有利的方法，適合分離分子量懸殊的物質，乙腦病毒的分子量在400萬以上，與疫苗中的雜蛋白分子量相差較大，故使用凝膠柱層析可以非常方便有效地去除濃縮疫苗中殘留的小分子雜質，該凝膠過濾柱可以是SepharoseCL-6B、Sepharose4FF、SphacrylS-500HR柱或其他凝膠，檢測結果表明，經兩步層析柱純化後，疫苗總蛋白含量減少約99%以上，牛血清殘餘量也符合中國藥典2005版有關生物製品的規程要求。層析後的疫苗純化液再經過超濾濃縮，使最終純化疫苗與粗疫苗相比濃縮倍數達到40-80倍即可。以上所述乙腦純化疫苗方法均包括由P3株和Nakayama株生產的乙腦滅活疫苗、以及SA14-14-2株生產的乙腦減毒活疫苗。純化疫苗在最終凍幹製成成品之前，需加入保護劑，該保護劑可以有多種選擇，如人白蛋白保護劑與麥芽糖、人白蛋白保護劑與蔗糖等。本發明與現有技術相比，具有以下優勢(1)人源胚肺成纖維細胞已被證明不含任何汙染因子和致瘤性，作為疫苗生產基質，顯著優於現行疫苗使用的地鼠腎細胞和Vero細胞。人胚肺成纖維細胞在疫苗生產中已成功使用，並己有多種疫苗產品面市，足以證明其安全有效性。與原代細胞相比，人胚肺成纖維細胞能夠充分鑑定和標準化，可實現細胞種子庫系統，建立的細胞庫可用於多年生產，有利於質量控制。(2)本發明製備工藝中所使用的乙腦疫苗毒種為利用人胚肺成纖維細胞培養的毒種，從根本上更新了以往乙腦疫苗生產中使用鼠腦組織培養毒種的方法，從而徹底避免外源因子的汙染，也保證了所生產乙腦疫苗的安全性。(3)疫苗經本發明所述工藝中的純化步驟提純純化後，抗原活性明顯提高，可獲得雜蛋白減少99%以上的精製品，是具備免疫原性的安全有效的乙腦滅活疫苗。(4)本發明所提供的製備方法科學合理，產量高，安全有效，能夠滿足國內外乙腦疫苗市場的需要。下面結合說明書附圖和具體實施方式，對本發明做進一步介紹。圖l本發明具體具體實施方式工藝流程圖。具體實施例方式下面參照附圖1，對本發明的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗及其製備方法做進一步闡述。實施例l使用復甦的人胚肺成纖維細胞WI-38，細胞營養液為MEM培養液，其中含有8-10。/。小牛血清和24-32U/ml的慶大黴素，調PH至7.0-7.2,之後用15L轉瓶37"C培養成緻密單層後按照1:8分種率擴增，擴增到生產批量時，經過6天後，細胞長成緻密單層，棄去細胞營養液，用PH7.0-7.4的Earle氏液衝洗細胞面，接種人胚肺成纖維細胞乙腦病毒強毒株P3毒種，使用P3株在WI-38細胞上傳代的第3代工作毒種(P3V3)，毒種濃度MOI0.001，細胞維持液為含0.2。/。(w/w)人白蛋白的MEM液其PH為7.4-7.6，33。C下培養，24h後換以新鮮細胞維持液繼續培養48-72h，開始收穫病毒，收穫病毒液取樣進行病毒滴度和無菌試驗，要求收穫病毒液的病毒滴度達到lO^pfu/ml以上；合併病毒液加入e-丙內酯(終濃度為1:4000)後，置於2-8°C，24-48h滅活病毒，之後37'C水解2h，得疫苗原液，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液。濃縮疫苗過離子交換柱DEAE-S印haroseFF和凝膠過濾柱S印harose4FF，經二步驟柱層析後，得到純化滅活疫苗，加入保護劑後凍幹製成純化疫苗成品，經檢定疫苗效力超過中國乙腦疫苗參考品和日本乙腦疫苗參考品，其它各項檢定均符合WHO有關該疫苗要求。實施例2使用復甦的人胚肺成纖維細胞MRC-5，細胞濃度為10s個/ml，使用5g/L的Cytodex2在50L的生物反應器內培養，工作體積40L，轉速40~45轉/分鐘，溶氧25~50%。細胞營養液使用含8%-10%小牛血清和24-32U/ml慶大黴素的MEM培養液，PH7.0-7.2，培養溫度37°C。隨時觀察細胞生長情況，根據細胞生長情況反應器自動補液調整培養液PH，連續培養6天，直到細胞密度達到W個/ml時，用Earle氏液洗滌2次後，加入不含小牛血清、含0.2。/。(w/w)人白蛋白的MEM液，PH7.4-7.6。之後接種人胚肺成纖維細胞乙腦病毒弱毒株SA14-14-2毒種，使用SA14-14-2株在MRC-5細胞上傳代的第3代工作毒種，毒種濃度MOI0.001，病毒培養溫度33-35。C。24h(時間)後換以新鮮的細胞維持液，並於種毒後72-96h開始收穫病毒，其病毒滴度可達10"pfu/ml，收穫後的病毒合併液即為疫苗原液。用截留30萬分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液，濃縮疫苗過離子交換柱DEAE-S印haroseFF和凝膠過濾柱S印harose4FF，經二步驟柱層析後，得到純化減毒活疫苗，加入保護劑後凍幹製成純化疫苗成品，其各項檢定均符合WHO有關該疫苗要求。乙腦疫苗免疫原性試驗取體重10-12g清潔級昆明種小鼠，將按實施例1和實施例2方法製備的的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎滅活疫苗、人胚肺成纖維細胞乙型腦炎減毒活疫苗、以及常規的地鼠腎細胞滅活疫苗、地鼠腎細胞減毒活疫苗和Vero細胞滅活疫苗進行皮下免疫0.lml，或腹腔0.5ml，活疫苗免疫l次，死疫苗免疫2次，間隔7天，首次免疫後14天分別以適當稀釋的P3或Nak株腦內或腹腔攻擊，腦內攻擊注射病毒液0.03ml;腹腔攻擊注射0.3ml，同時以稀釋液腦內注射0.03ml攻擊的病毒感染量於相同體重健康小鼠腦內接種，測定病毒滴度(LD50),攻擊後小鼠觀察14天，根據動物死亡數計算保護力。表l不同疫苗免疫小鼠對腹腔攻擊的保護效果不同毒株攻擊保護~~疫苗免疫途徑免疫針次d:iP3Nak注存活動物數/試驗動物數從表1可看出，以皮下途徑免疫後，活苗對P3和Nak株均獲得完全保護，而死苗對P3和Nak株的保護效力分別達到60%70%和50%;而以腹腔途徑免疫後，活苗仍能夠使小鼠對P3和Nak株獲得完全保護，而死苗對P3和Nak株的保護效力較皮下接種略有升高，其對P3株的保護效力為80%90%，對Nak株的保護效力為60。/,80%。表2不同疫苗免疫小鼠對腦內攻擊的保護效果r^T^~不同毒株攻擊保護免疫途徑免疫針次、TP3N;27/105/10110/1010/1026/105/10110/1010/1029/108/10110/1010/1028/106/10110/1010/1029/10詣-2/102/10104.7107'3人胚肺細胞滅活疫苗人胚肺細胞減毒活疫苗地鼠腎細胞滅活疫苗地鼠腎細胞減毒活疫苗人胚肺細胞滅活疫苗人胚肺細胞減毒活疫苗地鼠腎細胞滅活疫苗地鼠腎細胞減毒活疫苗Vero細胞滅活疫苗未免疫對照人胚肺細胞滅活疫苗人胚肺細胞減毒活疫苗地鼠腎細胞滅活疫苗地鼠腎細胞減毒活疫苗人胚肺細胞滅活疫苗人胚肺細胞減毒活疫苗地鼠腎細胞滅活疫苗地鼠腎細胞減毒活疫苗Vero細胞滅活疫苗未免疫對照攻擊病毒量(LD50/0.03ml)ooooooooooooooooo下下下下腔腔腔腔腔皮皮皮皮腹腹腹腹腹下下下下腔腔腔腔腔皮皮皮皮腹腹腹腹腹tableseeoriginaldocumentpage16表2的數據顯示，經皮下途徑免疫後，活苗對P3株的保護率為80%,對Nak株的保護率為40n/。60n/。，而死苗對兩種毒株基本沒有保護效力；以腹腔注射免疫後，活苗對P3株的保護率為70。/。80。/。，對Nak株為50%60%，死苗對P3株僅有輕度保護力，對Nak株無保護效力。試驗結果初步表明，按本發明方法製備的人胚肺細胞滅活乙腦疫苗和減毒活疫苗免疫原性等同或略高於其他方法生產的乙腦疫苗。中和試驗從乙腦疫苗免疫原性試驗中各免疫組小鼠於攻擊前任取5隻從眼眶取血混合分離血清，每份血清分別用P3或Nak株在BHK-21細胞上加甲基纖維素營養覆蓋物作空斑減少中和試驗，中和抗體滴度按減少50%空斑數的血清最高稀釋度2倍計算(中和試驗時各血清稀釋度均加等量病毒液)。_表3不同疫苗免疫後攻擊前體內血清中和抗體與攻擊後保護力的關係_tableseeoriginaldocumentpage16從表3中可看出，用活苗免疫小鼠，無論是皮下或腹腔途徑都表現出較好的抗體應答，滴度均有l:10~1:40，一般免疫小鼠達到l:10的抗體滴度即被認為有保護效力。而滅活苗的抗體滴度只能達到1:5~1:10，明顯低於活苗免疫的效力。活疫苗的中和抗體滴度雖然不高，但與死苗相比有很強的抗乙腦強毒感染保護作用，對小鼠不致死，對豚鼠不產生病毒血症，這些都與乙腦活疫苗免疫後引發細胞免疫作用有重要關係，因此乙腦或疫苗免疫效果不能單以中和抗體水平為依據。實驗結果表明，按本發明說明書製備的人胚肺細胞滅活疫苗和減毒活疫苗的中和抗體滴度和保護效力與現在國內市場上流行使用的乙腦疫苗相比沒有差別，但本發明所述的乙腦疫苗由於採用無外源因子過敏原的人胚肺成纖維細胞生產，與其他乙腦疫苗相比在安全性上有明顯優勢。權利要求1、一種人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗，其特徵在於該疫苗在製備過程中病毒培養所用的細胞系是人胚肺成纖維細胞。2、根據權利要求1所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗，其特徵在於所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗為乙型腦炎滅活病毒疫苗或乙型腦炎減毒活疫苗。3、根據權利要求1或2所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗，其特徵在於所述人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗在製備過程中病毒培養所用的人胚肺成纖維細胞包括但不僅限於人胚肺成纖維細胞系WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5和2BS。4、根據權利要求3所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗，其特徵在於還包括有保護劑，該保護劑為包括人白蛋白保護劑與麥芽糖組合或人白蛋白保護劑與蔗糖組合。5、一種人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)採用人胚肺成纖維細胞作為疫苗製備的病毒培養所用的細胞系；(2)人胚肺成纖維細胞的復甦、培養、擴增；(3)在人胚肺成纖維細胞上接種乙腦病毒毒種；(4)收穫病毒液；(5)澄清超濾濃縮；(6)疫苗純化；(7)稀釋分裝並加入保護劑後凍幹製成純化疫苗。6、根據權利要求5所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於所述步驟(l)人胚肺成纖維細胞復甦、培養和擴增所使用的細胞培養液為199培養液或MEM培養液，細胞培養液中所含牛血清的體積分數比為8%-10%、慶大黴素24-32U/ml，並調PH至7.0-7.2，其培養溫度為35-37。C。7、根據權利要求6所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於所述步驟(2)接種人胚肺成纖維細胞乙腦毒種，其毒種濃度MOI為0.1-0.0001，細胞維持液為含0.2%(w/w)人白蛋白的MEM液，其PH為7.4-7.6，並置於31-33。C下培養，24h-36h後換以新鮮細胞維持液繼續培養48-72h。8、根據權利要求7所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於所述的步驟(3)要求收穫病毒液的病毒滴度達到107.0pfu/ml以上。9、根據權利要求8所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於所述的步驟(4)與步驟(5)之間還進行了病毒液滅活操作以製備乙型腦炎滅活疫苗。10、根據權利要求5或6或7或8所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於病毒培養所用的人胚肺成纖維細胞包括但不僅限於細胞系WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5禾f]2BS。11、根據權利要求IO所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於所述步驟(6)疫苗的純化通過柱層析法來實現。12、根據權利要求9所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於步驟(1)中人胚肺成纖維細胞的培養方式為採用轉瓶培養或微載體反應器培養。13、根據權利要求IO所述的人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法，其特徵在於步驟(3)中所接種的病毒株為適用於製備滅活疫苗的乙型腦炎病毒P3株或適用於製備減毒活疫苗的乙型腦炎病毒SA14-14畫2株。全文摘要本發明公開了一種人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗及其製備方法，包括人胚肺成纖維細胞的培養擴增，馴化接種乙腦病毒P3株、SA14-14-2株或Nakayama株適應人胚肺成纖維細胞，在人胚肺成纖維細胞上製備乙腦病毒毒種，其中乙腦滅活疫苗還包括收穫病毒，病毒滅活，濃縮和純化等步驟，而減毒活疫苗還包括收穫病毒，濃縮和純化等步驟。這兩種乙型腦炎疫苗由於使用健康的人源胚肺成纖維細胞製備，不含任何外源汙染因子和致瘤性，經純化處理後疫苗純度高，具有免疫效果好、安全性高的優點，本發明所述人胚肺成纖維細胞乙型腦炎疫苗的製備方法是適合大規模工業化生產且可滿足國內外市場對乙腦疫苗需求的製備工藝。文檔編號A61P31/14GK101524536SQ20091010351公開日2009年9月9日申請日期2009年3月26日優先權日2009年3月26日發明者朱文漓,勇蔡申請人:成都康華生物製品有限公司