性病的集成診斷晶片及其製備方法
2023-06-18 12:52:51 2
專利名稱：性病的集成診斷晶片及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種性病的集成診斷晶片以及這種晶片的製備方法。
性病是一種發病率較高，對人類健康危害極大的傳染性疾病，常見的如淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等，更有部分癌症也是由性傳播疾病引起。引起性病的病原微生物常見的包括淋球菌、梅毒螺旋體、單純皰疹病毒、乳頭瘤病毒、一些真菌、支原體、衣原體等類型，病原種類多，難以診斷和判定，故對它們的快速、有效的診斷對性病的監控、預防和治療極為重要。為此，各國投入了大量的經費和人力進行這方面的研究，並且發展了一些診斷性病病原的物理、化學方法，物理方法一般是經過取樣，實驗室培養後鏡檢，程序複雜。常見的化學方法有ELISA測抗原或抗體，PCR測抗原基因等。但傳統的免疫學方法都是首先將純化的抗原或抗體與酶或其它標記物結合，再加相應的底物通過顯色或特殊的儀器來測定其相應的抗原或抗體，這些方法化學計量關係較複雜，染料著色的程度和部位很難控制，操作煩瑣，導致假陽性假陰性較多，成本也較高PCR方法由於符合率差等原因已被國家暫時取消。而且，所有這些方法都還有一大缺陷，就是效率低，一次只能測一種病原或幾次才能鑑定出一種病原。而現實的情況是病人往往感染了幾種病原，多種性病病原都能感染人體。傳統的方法針對有限的幾種病原進行檢測，末免帶有盲目性。為此，急需發展一種標準化的程序和方法能夠一次性地診斷出受染微生物的種類和受染程度，便於正確、快速地採取治療措施。
基因(或DNA)晶片技術的出現，使這道難題迎刃而解。基因晶片技術是一項可與計算機晶片技術媲美、具有劃時代意義的革命性技術。基因晶片實質上是一種高密度的寡聚核苷酸(DNA探針)陣列，它採用在位組合化學、合成化學和微電子晶片的光刻技術，或者利用其它方法將大量特定序列的DNA探針有序地固定在玻璃或矽襯底上，它已能實現在1萬平方釐米見方玻璃上固定40餘萬個寡聚核苷酸片段，每種探針的空間尺度可達10-20微米，在與待測樣品DNA作用後，DNA晶片即可檢測到大量相應的生命信息，用於基因識別、鑑定，以及基因突變和基因表達等。到目前為止，DNA晶片技術的出現不過幾年時間，主要在兩個方面進行了研究，一是用大量寡核苷酸探針來測定基因序列，使破解人類DNA編碼的速度達到常規方法的25倍；二是開發了檢測癌症患者P53基因突變的晶片。
本發明的目的在於提供一種性病的集成診斷晶片以及這種晶片的製備方法，利用這種晶片可對淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等傳染性性病原微生物進行集成診斷，一次操作就可方便、快速、準確地完成上述幾種性病的檢測以及各自的感染程度等。
本發明的目的是這樣實現的本發明的性病集成診斷晶片是在玻璃或矽片上固定有淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具有診斷意義的特徵基因(單鏈)，或者固定用於PCR擴增這八種性病病原的引物。這八種性病原的分子生物學研究在國內外已有大量的報導，具有診斷意義的特徵基因的序列已公布，這些特徵基因(或其引物)可直接購買，也可利用分子生物學的基因操作實驗技術提取。
首先將病人血清、黏膜或尿樣中病原微生物的DNA提取出來作為模版，參照公布的基因序列設計引物，PCR或RT-PCR擴增目的基因，然後克隆到質粒載體上在大腸桿菌中擴增，酶切、純化提取得到所需的特徵基因。
玻璃或矽片先經過表面設計規劃基因(探針、引物)分布，採用微電子光刻技術將表面刻製成所需的微坑陣列。
具體的技術方案如下一種性病集成診斷晶片，它是在玻璃或矽片上光刻有微坑陣列，這些陣列分為八個區域，依次在這些微坑中固定有淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因，或者是用於擴增它們的引物。
製備上述性病集成診斷晶片的方法先將玻璃或矽片採用微電子光刻成微坑陣列；用表面鍵合偶聯活化劑對其進行活化處理，活化試劑為親水性矽烷化試劑等。處理條件為常溫，0.5～2.5小時。
依次將淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因或其引物轉移到八個區域的微坑陣列中；用偶聯劑經偶聯反應將這些特徵基因或其引物固定在晶片上；即得到本發明的性病集成診斷晶片。
基因或其引物固定時偶聯反應條件為偶聯劑(0.5～1.5％)+2-[N-嗎啉]乙磺酸溶液，室溫下12～36小時。
所用的偶聯劑可為水溶性碳二亞胺、N-羥基瑚珀醯亞胺、或WOODWARD試劑等。
所得到的性病集成診斷晶片可採用電化學標記、化學發光標記、螢光標記等方法加以檢驗，標記試劑可為苄基紫晶、水溶性卟林、溴化乙啶、丫啶橙、螢光素。用電化學方法、雷射誘導螢光/電荷耦合器件(CCD)配套診斷晶片的臨床檢測。
採用本發明的上述技術方案具有如下特點利用本發明的性病集成診斷晶片可通過一種材料、一次反應就能完成上述八種性病的檢測診斷。而傳統方法檢測一種性病需要多次不同的反應才能確定。
利用本發明的性病集成診斷晶片進行性病診斷的準確率、符合率可達到98％以上，既可做到定性檢測，也可做到定量檢測。
本發明的性病集成診斷晶片的製造成本低，診斷時每檢測的費用不高於傳統方法的單項檢測的費用。
近年來，性病在我國的流行已成為一個突出的社會問題，發病人數年年上升，發病地區也在不斷擴大，對這類疾病的及時監控、預防和診斷極其重要，因此本發明應用前景廣闊，具有極大的社會效率和經濟效率。
以下結合具體的實施例對本發明的技術方案作進一步的說明實施例一種性病集成診斷晶片，它是在玻璃或矽片上光刻有微坑陣列，這些陣列分為八個區域，依次在這些微坑中固定有淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因。
製備上述性病集成診斷晶片的方法先將玻璃或矽片採用微電子光刻成微坑陣列；用表面鍵合耦聯活化劑對其進行活化處理，活化條件為用親水性矽烷化試劑常溫下處理2小時。依次將淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因轉移到八個不同區域的微坑陣列中，用交聯劑經耦聯反應將這些特徵基因或其引物固定在晶片上即得到本發明的性病集成診斷晶片。
所用的交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。
偶聯反應條件為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1％)+2-[N-嗎啉]乙磺酸溶液(pH6.5)，室溫下24小時。
權利要求
1.一種性病集成診斷晶片，其特徵在於它是在玻璃或矽片上光刻有微坑陣列，這些點陣分為八個區域，依次在這些微坑中固定有淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因或其引物。
2.一種製備權利要求1所述的性病集成診斷晶片的方法，其特徵在於先將玻璃或矽片採用微電子光刻成微坑陣列；用表面鍵合偶聯活化劑對其進行活化處理，活化條件為依次將淋病、梅毒、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因或其引物轉移到八個區域的微坑陣列中，用偶聯劑經偶聯反應將這些特徵基因或其引物固定在晶片上，即得到本發明的性病集成診斷晶片。
3.按權利要求2所述的性病集成診斷晶片的方法，其特徵在於所述的偶聯反應條件為0.5～1.5％偶聯劑+2-[N-嗎啉]乙磺酸溶液，室溫下12～36小時。
4.按權利要求2所述的性病集成診斷晶片的方法，其特徵在於所述的偶聯劑為水溶性碳二亞胺、N-羥基瑚珀醯亞胺或WOODWARD試劑。
全文摘要
本發明公開了一種性病的集成診斷晶片以及這種晶片的製備方法,它是在玻璃或矽片上光刻有微坑陣列,這些陣列分為八個區域,依次在這些微坑中固定有淋病、梅素、尖銳溼疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特徵基因或其引物。這種晶片對性病的及時監控、預防和診斷極其重要,診斷操作簡單、快速,而且準確率高,因此應用前景廣闊,具有極大的社會效益和經濟效率。
文檔編號G01N33/48GK1271098SQ9911644
公開日2000年10月25日 申請日期1999年4月20日 優先權日1999年4月20日
發明者王業富, 龐代文 申請人:武漢大學