細菌(柔膜細菌)汙染的改良檢測的製作方法

2023-06-19 06:06:06

專利名稱：細菌(柔膜細菌)汙染的改良檢測的製作方法
細菌(柔膜細菌)汙染的改良檢測本發明提供了通過抑制非特異性擴增產物改良的基於PCR的靶序列擴增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴增汙染物的核酸的引物對。當對懷疑包含汙染物的來自第二種生物的DNA實施相同的基於PCR的擴增反應時，當第一種生物的基因組DNA的量存在於擴增反應中時，汙染物的檢測靈敏度和特異性增強。
背景技術：
支原體屬(Mycoplasma)是屬於缺乏細胞壁的柔膜體綱的細菌屬。沒有細胞壁， 支原體屬細菌不受靶向原核細胞壁合成的許多常見抗生素影響，所述抗生素例如青黴素或其他β-內醯胺抗生素。存在超過100種公認的支原體屬物種，柔膜體綱(Mollicutes) 中的幾個屬之一。柔膜細菌是人、其他動物(包括昆蟲)和植物的寄生蟲或共生體；支原體屬通過定義被限定於脊椎動物宿主。膽固醇是支原體屬以及柔膜細菌(mollicutes)的某些其他屬的物種生長所需的。它們的最佳生長溫度通常是其宿主的溫度，如果是溫血的 (warmbodied)(例如在人中37°C )，或環境溫度，如果宿主不能調節其自身內部溫度。16S 核糖體RNA序列的分析以及基因含量強烈暗示柔膜細菌包括支原體與系統樹的乳桿菌屬 (Lactobacillus)或梭菌屬(Clostridium)分支(在嚴格意義上厚壁菌門(Firmicutes)) 緊密相關。支原體屬物種通常在研究實驗室中作為細胞培養中的汙染物發現。支原體細胞培養汙染可以由於來自個體的汙染或汙染的細胞培養基成分而發生。支原體細胞物理上是很小的-小於ι μ m-並且它們因此難以用常規顯微鏡檢測。支原體可以誘導細胞改變，包括染色體畸變、代謝和細胞生長中的改變。嚴重支原體感染具有破壞細胞系的潛力。支原體還涉及作為許多疾病中的病原體。肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae) 是社區獲得性肺炎的主要成因劑。螺原體屬(Spiroplasma)物種通過分子和血清學研究近期已與傳播性海綿狀腦病(TSEs)關聯(Bastian, F. 0. , J Neuropathol Exp Neurol 64(2005)833-838)。然而， 螺原體屬物種與TSh的關係仍是有爭議的，例如考慮到檢測受綿羊瘋癢病感染的倉鼠腦中螺原體的任何足跡的rRNA種類的參與者不知情研究的失敗(Alexeeva，〗.，等人，J Clin Microbiol 44 0006)91-97)。然而，在考慮中的TSh包括綿羊中的綿羊瘋癢病、鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)和人中的克雅氏病。顱內接種到綿羊和山羊內的從受綿羊瘋癢病侵襲的綿羊腦和受CWD侵襲的鹿腦中分離的螺旋體屬物種誘導非常類似這些動物中的天然TSE 的海綿狀腦病。這些數據明確顯示螺原體與TSE相關。顯示螺原體屬細菌在含胚卵中生長且可以在此類培養系統中傳代(Bastian， F. 0.，等人，Journal of Medical Microbiology 56(2007) 1235-1242) 含胚卵在疫苗生產中起主要作用。例如，針對流行性感冒的人疫苗已可用幾乎60 年，並且直到最近，幾乎完全由在9到11天齡的含胚雞卵的尿囊腔中生長的病毒進行製備。 因此，螺原體的致病性潛力使得柔膜體綱病原體的檢測成為用於確保由含胚卵製備的任何產物的安全的首要重要的工具。此外，在生物藥物生產、細胞療法和組織工程過程中支原體汙染的可能性尤其是主要問題。由全世界的藥典和藥物管理機構要求的常規檢測法使用在培養基上的生長，以鑑定汙染生物。這些基於培養的技術要求長時間以達到結果。此外，某些支原體屬物種的培養可能是不可能或不可靠的。因此，需要改良且特別是更快速和可靠的微生物測定。Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193 公開了用於中國倉鼠卵巢細胞培養的支原體測試的PCR法。測試的原理是首先分離來自細胞培養(細胞和上清液) 的基因組DNA，並且其次使用對於支原體屬物種的16S-rRNA基因中的區域特異的引物和分離的DNA作為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)。在陽性結果的情況下，形成且檢測到對應於靶向區域的擴增產物。當未形成擴增產物時，獲得陰性結果。在該方法中使用的引物是先前公開的通用支原體引物(Wong-Lee，J.G.和 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture "in !Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ(編輯),Washington, DC, American Society for Microbiology (1993) 257J60)。Eldering，J. A.，等人(同上)的方法是測定最佳化的結果且組合了改善支原體檢測的靈敏度和特異性的6個要素(1)用於與支原體基因組的擴增物比較具有不同大小的PCR產物的陽性對照質粒，(2)從懷疑被支原體細菌汙染的細胞培養中分離的DNA的純化和濃縮，(3)熱啟動Taq DNA聚合酶的使用，⑷其中應用從70到60°C的退火溫度梯度的所謂降落PCR技術的使用，(5)PCR試劑的淨化，和(6)專用設備和材料的使用。值得注意的是，關於所述最佳化PCR法的要素2，作者選擇用於DNA純化和濃縮的方法，其包括步驟(a)裂解細胞培養(細胞和培養基)，和(b)用乙醇沉澱來自裂解物的DNA 且分離沉澱的DNA。進一步公開的是此類沉澱法比使用旋轉柱的用於DNA純化的可替代方法具有優勢。旋轉柱一般含有具有二氧化矽表面的過濾材料。例如通過離心，通過使緩衝液經過旋轉柱，使溶解於任選還含有醇的高鹽和/或離液緩衝液中的DNA與過濾材料結合。在後續步驟中，DNA可以使用非離液低鹽緩衝液或純水從過濾材料中洗脫。在最佳化研究中，獲得與可能存在於旋轉柱中的痕量汙染物一致的結果。當柱與CHO基因組DNA接觸時，從旋轉柱中去除痕量汙染物。CHO基因組DNA的可能作用描述為用於汙染物的載體的那種作用。基於Eldering，J. Α.，等人(同上)的發現和其中公開的工作流程，Roche Applied Science (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)已進一步最佳化且開發了 MYC0T00L測試試劑盒。使用測試試劑盒進行的測定提供了用於細胞和無細胞系統的高度靈敏的支原體測定。MYC0T00L特別涉及藥物質量控制。先前研究涉及來自16S rRNA基因特異性引物的PCR生成的人工產物(Osborne， C. Α.，等人，FEMS Microbiology Letters 248(2005) 183-187) 得出結論使用特定引物對生成的人工產物可以通過使用用於擴增反應的不同引物來避免。本發明的發明人已發現其中MYC0T00L測定的PCR產生可以是人工產物的片段的偶然情況(參見實施例)。注意到Eldering，J. Α.，等人(同上)的最佳化測定以及特別是其中使用的引物基本上構成用於柔膜細菌的極佳檢測系統的事實，本發明的目的是改善 PCR方法，從而使得無關擴增物的出現降到最低。特別地達到這種預期效應而不改變引物的序列。
發明概述根據本發明，一個或多個上述目的通過本發明的實施方案滿足。本發明的第一個方面是用於測定具有生物學材料的液體樣品中細菌汙染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步驟(a)處理樣品且純化來自經處理的樣品的核酸，隨後為(b)形成用於基於PCR的擴增反應的組合物(反應混合物)，該組合物包括-根據SEQ IDNO 1的第一種引物、-根據SEQ ID NO 2的第二種引物，和_步驟(a)的純化核酸或其測量的部分作為模板；隨後為(c)用步驟(b)的組合物進行聚合酶鏈式反應 (PCR)；隨後為(d)檢測擴增的靶序列的存在或不存在，由此其中所述擴增的靶序列的存在指示樣品中細菌汙染物的存在，並且所述擴增的靶序列的不存在指示樣品中細菌汙染物的不存在；改良的特徵在於相對於樣品的體積，將來自CHO細胞的預定量的DNA加入(i)樣品、或(ii)步驟(a)的經處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的純化核酸、或(iv)步驟(b)的組合物中，由此所加入的來自CHO細胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴增。 本發明的第二個方面是包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細胞的DNA的組合物。本發明的第三個方面是組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細胞的DNA。本發明的第四個方面是根據本發明的組合物在用於擴增來自從樣品中分離的DNA的原核汙染物的DNA的方法中的用途，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液。本發明的第五個方面是試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii) 以預定濃度的來自CHO細胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNA，和(iii)根據SEQ IDNO 1的第一種引物和根據SEQ ID NO :2的第二種引物。本發明的第六個方面是用於進行聚合酶鏈式反應(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有範圍為約IOObp-約1500bp大小的特異性擴增產物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR 中形成來自第一種模板的特異性擴增產物，所述PCR在預定條件(R)下在具有預定組合物的反應混合物(Q)進行，並且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，並且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件 (R)下在反應混合物⑴)中不形成來自第二種模板的擴增產物，其中在所述第二種模板中， 不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，該改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA ； (c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ； (d)在所述反應混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(c)的所述第三種模板、和(b)的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進行PCR;其中非特異性PCR擴增產物的形成被抑制。發明詳述在本發明的說明書中，某些術語以特定含義使用，或首次得到定義。為了本發明的目的，使用的術語通過其領域公認的定義進行定義，當存在此類情況時，除這些定義與下文所述的定義衝突或部分衝突外。在定義中衝突的情況下，術語的含義首先通過下文所述的任何定義進行定義。術語「包含」在本發明的說明書和權利要求中用於意指「包括但不一定限於」。
冠詞「a」和「an」在本文中用於指冠詞的一個或超過一個(即至少一個)語法目標。例如，「微生物」意指一種微生物或超過一種微生物。當指定數值範圍例如濃度範圍時，範圍可以通過單詞「在......之間」指示，隨後
為第一個值Ii1、單詞「和」和第二個值n2。此外，指定範圍可以通過表達「在Ii1-Ii2的範圍中」 指示。如果沒有另外說明，那麼當指示指定範圍時，指定範圍的較低邊界應理解為該值等於或高於第一個值。指定範圍的較高邊界應理解為該值等於或小於第二個值」。因此，在指定範圍中的值χ通過Ii1彡χ彡n2給出。此外，應當理解與數值η組合的術語「約」指示在通過該值的數值士5%給出的間隔中的值X，即η-ο. 05*η彡χ彡η+0. 05*η。在與數值η組合的術語「約」描述本發明的一個優選實施方案的情況下，如果沒有另外說明，那麼η的值是最優選的。如本文使用的，術語「樣品」指複雜樣品，更優選生物學樣品，即具有生物學材料的樣品。樣品可以含有希望與生物學材料中包含的核酸分離的多種有機和無機化合物。術語 「樣品」還涵蓋含有衍生自其他來源的核酸的水溶液，例如來自化學或酶促反應混合物，或來自生物學樣品材料的先前純化。從其中純化核酸的術語生物學樣品涵蓋包含病毒或細菌細胞的樣品，以及來自多細胞生物的分離細胞例如人和動物細胞，以及組織的原始培養物和細胞系的培養物，以及其上清液和衝洗。本發明還涵蓋生物學樣品例如來自人或動物體的流體。特別地，樣品可以是全血、血液血清、血液血漿、大腦流體、唾液、糞便、活組織檢查標本、骨髓、經口衝洗、組織、尿及其混合物。根據本發明，優選樣品是「液體樣品」，即樣品處於流動狀態，並且樣品流體包含水和生物學材料。生物學材料優選包含細胞或細胞組分。非常優選的，根據本發明的液體樣品選自細胞培養上清液、培養細胞的懸液和羊膜液。更加優選的，羊膜液來自含胚禽類卵。為了本發明的目的，與「液體樣品」組合的術語「處理」或「經處理的」含義是通過加入一種或多種化合物，並且使一種或多種化合物與液體樣品混合來處理樣品，從而得到 「經處理的樣品」。可以用於此類處理的優選化合物選自去垢劑、表面活性劑、有機溶劑、離液劑、蛋白酶和核酸酶抑制備物。根據本發明的「離液劑」是擾亂液態水的有序結構的任何化學物質。離液劑還促進蛋白質的解摺疊、延伸和解離(Dandliker，W.，B.和de Saussure, V. , A. , In :The Chemistry of Biosurfaces, Hair, Μ. , L.,編輯，Marcel Dekker, Inc. New York (1971)第 18 頁)。根據本發明的優選經處理的樣品是裂解物。「裂解物，，或「裂解樣品」可以得自包含細胞(a comprising cells)，優選微生物細胞，和非常優選的細菌細胞，其中存在的細胞的大量部分的結構完整性被破壞。為此，如果存在，那麼細胞壁必須被破壞。為了釋放被破壞的細菌細胞的內容物，用某些試劑處理材料，以崩解、使得多孔、溶解、降解或變性微生物細胞的細胞壁。此外，細胞膜必須被破壞。為了釋放細胞、組織或更一般地來自生物學樣品中包含的顆粒的內容物，材料可以用酶或用化學製品進行處理，溶解、降解或變性此類生物的細胞壁和細胞膜。在任何此類情況下，裂解(「裂解的」)過程還將破壞細菌汙染物的結構完整性，從而釋放汙染物的核酸。對於裂解過程，當核酸在該過程中釋放時，通常使用離液劑例如胍鹽和/或陰離子、陽離子、兩性離子或非離子型去汙劑。使用快速降解具有溶核活性的酶和其他不需要的蛋白質的蛋白酶也是有利的。在殘留微粒即在裂解過程後樣品材料的未溶解物質的情況下，粒性物質可以與裂解物分開，以導致澄清的裂解物。這可以例如通過過濾或離心完成。 因此，術語「裂解物」涵蓋澄清裂解液。來自經處理的樣品的「核酸的純化」可以使用其為標準技術的廣泛多樣的方法完成。這些可以包括例如使用醇從水溶液中沉澱核酸(用乙醇或異丙醇的沉澱是本領域眾所周知的)和沉澱物的分離。其他方法包括核酸吸附到固相(例如具有氧化表面例如二氧化矽)上，分離固相，隨後為從固相中洗脫核酸。「聚合酶鏈式反應」(「PCR」)是用於擴增特定靶DNA序列的單個或少數拷貝跨越幾個數量級的技術，其中生成DNA序列的拷貝。PCR依賴於熱循環，由反應混合物的反覆加熱和冷卻循環組成，從而實現DNA解鏈和DNA的酶促複製。含有與靶DNA序列互補的序列的引物(DNA寡核苷酸)連同DNA聚合酶一起是致使選擇性和反覆擴增成為可能的關鍵組分。隨著PCR進展，生成的DNA自身用作模板用於複製，啟動其中DNA模板指數擴增的鏈反應。在這點上的「反應混合物」包含DNA聚合酶、dNTP、離子、緩衝液和實現與靶DNA序列雜交(退火)的引物延伸所需的所有其他化合物。本發明人已得出結論在由ElderingJ. A·，等人(同上)公開的方法中，對於測定細菌汙染物的存在或不存在關鍵的PCR條件是對於CHO (中國倉鼠卵巢)細胞培養和/或培養上清液專一地最佳化的。此外，本發明人已觀察到根據SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引物對偶然產生無關擴增或人工產物(即對於大小不同於所需靶DNA片段的片段的非特異性擴增)。這特別是當從來自衍生自其他動物物種或人的細胞培養的樣品材料製備的DNA 用作模板時的情況。在此類設置中，本發明基於其上的基礎觀察是當PCR在CHO細胞DNA 的存在下進行時，PCR人工產物的形成可以被抑制。然而，這種所需技術效應要求CHO細胞 DNA不含由細菌DNA的汙染，所述細菌DNA可以通過所述引物對擴增。因此，以最廣泛的含義，本發明的第一個方面是用於進行聚合酶鏈式反應(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸(PCR)形成具有範圍為約IOObp-約1500bp大小的特異性擴增產物，所述引物各自與一種或多種原核生物的 16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR中形成來自第一種模板的特異性擴增產物， 所述PCR在預定條件(R)下在具有預定組合物的反應混合物(Q)進行，並且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，並且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應混合物⑴) 中不形成來自第二種模板的擴增產物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，該改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA ；(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(d)在反應混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(C)的所述第三種模板、和(b) 的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進行PCR;
其中非特異性PCR擴增產物的形成被抑制。在本發明的背景中，PCR的條件(R)反映參數包括溫度方案、孵育時間、PCR循環數目和PCR領域技術人員已知的其他物理參數。反應混合物(Q)包含PCR過程與之一起進行的最終混合物的所有組分，包括引物延伸所需的所有化合物。反應混合物(Q)還包括各自以其分別的預定濃度的引物對。為了明確起見，以這種意義的反應混合物(Q)不包含分開添加的模板DNA。模板DNA這樣加入，使得在最終混合物(即在模板DNA的添加後)中，所有其他組分的濃度是等同的，不管使用何種模板。根據本發明，含有另一種生物而不是CHO細胞的基因組DNA的模板另外必須含有以測量的量即以預定濃度的CHO細胞DNA。在本發明的一個優選實施方案中，寡核苷酸對與多個原核物種雜交，並且0-3個錯配可能在引物與其16S-rRNA基因的靶區域的雜交中發生。在任何此類情況下，任何錯配 (如果存在的話)排除末端核苷酸，提供分別寡核苷酸的3』 -OH基團。在本發明的一個優選實施方案中，所述一種或多種原核生物是選自柔膜體綱物種、芽孢桿菌屬(Bacillus)物種、梭菌屬物種、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物種、微球菌屬(Micrococcus)物種、葡萄球菌屬Staphylococcus)物種和鏈球菌屬 Streptococcus)物種的物種。更加優選的，物種是柔膜體綱物種。更加優選的，物種是支原體屬物種，更加優選的，物種選自豬鼻支原體(M. hyorhinis)、精氨酸支原體(M. arginini)、肺炎支原體、發酵支原體(M. fermentans)、口腔支原體(M. orale) 和梨形支原體(M.pirum)，或物種是無膽甾原體屬(Achol印lasma)物種，更加優選萊氏無膽甾原體(Achol印lasma laidlawii)，或物種是螺原體屬物種，更加優選非凡螺原體 (Spiroplasma mirium)。在本發明的一個非常優選的實施方案中，所述第一種真核生物是CHO細胞或包含多個CHO細胞的培養物。更加優選的，所述引物對包含SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2之一，
或兩者。在本發明的一個更加優選的實施方案中，條件(R)和反應混合物(Q)是在 MYC0T00L測試試劑盒的手冊中描述的通過Roche Diagnostics GmbH, Mannheim(德國) MYC0T00L 測定。本發明的進一步優選實施方案在下述項目列表中給出1.用於測定液體樣品中細菌汙染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步驟(a)處理樣品且純化來自經處理的樣品的核酸，隨後為(b)形成用於基於PCR的擴增反應的組合物，該組合物包括-根據SEQID NO 1的第一種引物、-根據SEQID NO 2的第二種引物，和-步驟(a)的純化核酸或其測量的部分作為模板；隨後為(c)用步驟(b)的組合物進行聚合酶鏈式反應(PCR)，由此擴增原核16S-rRNA基因中包含的靶序列，如果存在於模板中的話；隨後為(d)檢測擴增的靶序列的存在或不存在，由此所述擴增的靶序列的存在指示樣品中細菌汙染物的存在，並且所述擴增的靶序列的不存在指示樣品中細菌汙染物的不存在；
改良的特徵在於相對於樣品的體積，將來自CHO細胞的預定量的DNA加入(i)樣品、或(ii)步驟(a)的經處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的純化核酸、或(iv)步驟(b)的組合物中，由此所加入的來自CHO細胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴增。2.項目1的方法，其特徵在於每ml液體樣品的預定量DNA是來自約5xl06個CHO 細胞的DNA含量。3.根據項目1和2中任一項的方法，其特徵在於所述液體樣品選自具有培養的細胞的細胞培養基、無細胞的培養上清液和羊膜液。4.根據項目3的方法，其特徵在於所述液體樣品是羊膜液。5.根據項目4的方法，其特徵在於所述羊膜液來自含胚卵。6.根據項目1-5中任一項的方法，其特徵在於所述細菌汙染物是選自無膽留原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。7.根據項目6的方法，其特徵在於所述細菌汙染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細菌汙染物是萊氏無膽留原體，或所述細菌汙染物是非凡螺原體。8.組合物，其包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細胞的DNA。9.根據任何項目8的組合物，其進一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。10.組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細胞的DNA。11.根據項目10的組合物，其進一步包含根據SEQ ID NO 1的第一種引物、根據 SEQ ID NO :2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。12.根據項目11的組合物，其進一步包含嵌入染料。13.試劑盒，其在分開的容器中包含⑴裂解試劑，(ii)以預定濃度的來自CHO細胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNAJP (iii)根據SEQ ID NO 1的第一種引物和根據SEQ ID NO 2的第二種引物。14.根據項目10-12中任一項的組合物用於擴增原核汙染物的DNA的用途，所述原核汙染物的DNA來自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液。15.用於進行改良聚合酶鏈式反應(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有範圍為約IOObp-約 1500bp大小的特異性擴增產物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR(P)中形成來自第一種模板的特異性擴增產物，所述PCR(P)在預定條件(R)下在具有預定組合物的反應混合物(Q)進行，並且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，並且其中在P中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應混合物⑴)中不形成來自第二種模板的擴增產物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，所述改良方法包括以下步驟
(a)提供所述寡核苷酸引物對和所述第一種真核生物的基因組DNA ；(b)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(c)在所述反應混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(d)的所述第三種模板、和所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進行PCR;其中非特異性PCR擴增產物的形成被抑制。序列表描述SEQ ID NO 1用於檢測支原體屬和相關物種的通用引物(正向)；先前公開於 Wong-Lee, J. G.禾口 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture，，中Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ (編輯)Washington，DC, American Society for Microbiology (1993) 257-260, 和 Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193。SEQ ID NO :2用於檢測支原體屬和相關物種的通用引物(反向)；先前公開於 Wong-Lee, J. G.，等人(同上)和 Eldering, J. A.，等人(同上)中。SEQ ID NO 3對於甘油醛3_磷酸脫氫酶基因中的靶序列(對照序列)特異的正向引物。SEQ ID NO 4對於甘油醛3_磷酸脫氫酶基因中的靶序列(對照序列)特異的反向引物。附圖描述

圖1泳道注釋/稀釋度1-5GAPDH對照PCR ；從MDCK細胞中分離的DNA，無CHO細胞DNA，用萊氏無膽甾原體DNA摻加1未稀釋的2 KT13 10 24 10 35 10 46大小標記(50bp間隔(st印s))7-1IGAPDH對照PCR ；從MDCK細胞中分離的DNA，無CHO細胞DNA，未摻加7 KT18 10 29 IO 310 1(Γ411大小標記(50bp間隔)圖2泳道注釋/稀釋度1-5GAPDH對照PCR ；從MDCK細胞中分離的DNA，加入CHO細胞DNA，用萊氏無膽甾原體DNA摻加1未稀釋的
2 KT13 IO 24 IO 35 IO 46大小標記(50bp間隔)7-11 GAPDH對照PCR ；從MDCK細胞中分離的DNA，加入CHO細胞DNA，未摻加7 KT18 1(Γ29 IO 310 1(Γ411大小標記(50bp間隔)圖3泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中的引物；從ASC分離的DNA，用口腔支原體 DNA摻加，無CHO細胞DNA1-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；用8個獨立抽取的等分試樣的PCR6條帶的大小與對於特定靶DNA擴增產物觀察到的大小範圍一致圖4泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中的引物；從ASC中分離的DNA，用口腔支原體DNA摻加，含加入的CHO細胞DNA1-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；用8個獨立抽取的等分試樣的PCR9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩衝液的PCR( 「無模板」對
昭)13大小標記(50bp間隔)圖5泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Tris 緩衝液，無CHO細胞DNAl_40cfu萊氏無膽甾原體DNA5_81cfu萊氏無膽甾原體DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩衝液，未摻加，無CHO細胞DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，無CHO細胞DNA15大小標記(50bp間隔)圖6泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Tris 緩衝液，含加入的CHO細胞DNAl_410cfu萊氏無膽甾原體DNA5_81cfu萊氏無膽甾原體DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩衝液，未摻加，含加入的CHO細胞DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，含加入的CHO細胞DNA15大小標記(50bp間隔)圖7泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Vero 細胞懸液，無CHO細胞DNAl_410cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Vero細胞懸液，未摻加，無CHO細胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，無CHO細胞DNA11，12如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩衝液的PCR( 「無模板」對
昭)13大小標記(50bp間隔)圖8泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Vero 細胞懸液，含加入的CHO細胞DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2中的引物；Vero細胞懸液，未摻加，含加入的 CHO細胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，含加入的CHO細胞DNA11，12如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩衝液的PCR( 「無模板」對
昭)13大小標記(50bp間隔)圖9泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體「接種」的尿囊液，無CHO細胞DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的，無CHO細胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，無CHO細胞DNA11大小標記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴增的PCR產物移動的凝膠區域圖10泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體「接種」的尿囊液，2. 5 μ g/50 μ 1 CHO 細胞 DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA
5-8 如 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 中的引物；尿囊液，未接種的，2. 5 μ g/50 μ 1 CHO細胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，無CHO細胞DNA11大小標記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴增的PCR產物移動的凝膠區域圖11泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體「接種」的尿囊液，5 μ g/50 μ 1 CHO 細胞 DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO 1禾口 SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的， 5 μ μ g/50 μ ICHO 細胞 DNA9，10如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩衝液的PCR( 「無模板」對
昭)11大小標記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴增的PCR產物移動的凝膠區域圖12泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體「接種」的尿囊液，10 μ g/50 μ 1 CHO 細胞 DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的，10 μ g/50 μ 1 CHO細胞DNA9，10如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩衝液的PCR( 「無模板」對
昭)11大小標記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴增的PCR產物移動的凝膠區域5圖13泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Tris 緩衝液l-43cfu萊氏無膽甾原體DNA，無小牛胸腺DNA5-8Icfu萊氏無膽甾原體DNA，含加入的小牛胸腺DNA9-12如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；未摻加的Tris緩衝液，含加入的小牛胸腺DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩衝液，陽性對照質粒的約10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應混合物，無小牛胸腺DNA15大小標記(50bp間隔)圖14泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體「接種」的尿囊液，含加入的小牛胸腺DNA
l_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；尿囊液，未接種的，含加入的小牛胸腺DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩衝液，無接種物，含加入的小牛胸腺DNA13，14如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩衝液的PCR( 「無模板」對
昭)15大小標記(50bp間隔)實施例1MYC0T00L試劑盒和測定MYC0T00L PCR支原體檢測試劑盒是對於屬於柔膜體綱的細菌檢測最佳化的體外核酸擴增測試。這些包括豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發酵支原體、口腔支原體、梨形支原體、唾液支原體(M. salivarum)、人型支原體(M. hominis)、滑液囊支原體 (M. synoviae)、非凡螺原體、檸檬螺原體(S. citri)和萊氏無膽甾原體。MycoTool試劑盒包含2個亞試劑盒(subkits)亞試劑盒1 ( "Detection Prep Kit" ；Roche Applied Science 目錄號 05184592001)和亞試劑盒 2 ( 「Detection Amplification Kit" ；Roche Applied Science 目錄號 05184240001)。試劑盒確切地根據製造商的說明書使用。如果沒有另外說明，那麼通過下述裂解選自(i)細胞培養上清液、(ii)培養細胞的懸液和(iii)羊膜液的液體樣品加入含有胍鹽和蛋白酶K的水性緩衝液，將緩衝液與樣品混合，且孵育混合物以實現裂解。在裂解後，一般將10-250 μ g/lml樣品CHO細胞DNA加入裂解物中且混合。CHO細胞DNA不含如分開測試的任何汙染原核DNA。隨後，通過加入醇從混合物中沉澱核酸。通過離心回收沉澱物，用70%乙醇洗滌且乾燥。將乾燥的團塊溶解於預先製備的緩衝液中且實施PCR分析。作為內部對照，MYC0T00L試劑盒還包括用於GAPDH持家基因的引物對。在PCR擴增前，通過應用尿嘧啶-N-糖基化酶(試劑盒的組分)減少擴增子汙染的危險。在下文每個實施例中，根據通過製造商的說明書確切地進行PCR。PCR產物在聚丙烯醯胺凝膠上在標準條件下進行電泳。條帶用RES0LIGHT化合物和UV照明進行顯現，條帶檢測在520nm。用於檢測柔膜體綱的MYC0T00L試劑盒的引物是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的那些引物。還提供了對於GAPDH特異的對照引物(SEQID NO 3禾P SEQ ID NO :4)。每個MYC0T00L試劑盒進一步包含含有支原體屬DNA的對照質粒，然而，產生具有與由分離的細菌DNA(陽性對照)擴增的PCR片段相比較可區分的不同大小的PCR片段。為此,參考 Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193，其公開了質粒。實施例2用於樣品摻加的來自柔膜體綱物種的DNA在本實施例中使用的所有樣品來自不含原核汙染物的培養物。
代替由柔膜體綱物種感染的樣品材料，由萊氏無膽留原體或口腔支原體製備的 DNA在裂解前被摻加到樣品材料，或被摻加到由樣品材料製備的分離的DNA中(如果沒有另外說明)。為了摻加的目的，由萊氏無膽甾原體(ATCC27556)和口腔支原體(ATCC23714)的參考培養物(標準條件)製備DNA。對於每種培養物，測定表示為菌落形成單位(cfu)的細胞滴度。應用的摻加的DNA的數量反映對於由其製備DNA的各自培養物測定的cfu數目。如上所述的柔膜細菌DNA用於下文描述的摻加實驗中。由柔膜體綱DNA擴增的一般特定PCR片段(特異性擴增產物)的大小在約430-470bp的範圍中。實施例3在來自MDCK細胞培養(懸浮細胞)的樣品中GAPDH基因組靶序列的檢測使用不含任何原核生物且具有0，79 · IO6細胞/ml的細胞滴度的MDCK細胞的培養物。將萊氏無膽甾原體DNA以3個菌落形成單位(cfu)/lml樣品的濃度加入樣品中。如 MYC0T00L試劑盒(還參見實施例1)的指導手冊中說明的，從摻加的樣品材料中分離核酸。 製備2種不同核酸製備物，第一種不含CHO細胞DNA的添加，第二種含加入樣品材料中的 CHO 細胞 DNA (50mg/lml 樣品)。然而，進行不摻加萊氏無膽留原體DNA的樣品的重複製備。再次，製備含或不含 CHO細胞DNA的核酸。在TE緩衝液中製備DNA製備物的幾個稀釋度。根據MYC0T00L指導手冊，對每個稀釋度的等分試樣實施GAPDH特異性PCR。圖1和2顯示具有指出獲得的PCR產物的條帶的凝膠。圖1描述了不含加入的 CHO細胞DNA而獲得的結果，圖2顯示了含加入的CHO細胞DNA的PCR產物。可以明確觀察到含加入的CHO DNA,即使當用10_4稀釋度進行PCR時，GAPDH對照條帶也是可檢測的。實施例4在來自脂肪幹細胞(ASC)的細胞上清液的摻加的樣品中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測通過離心沉積不含任何原核生物的ASC。如MYC0T00L試劑盒的指導手冊中說明的 (還參見實施例1)，澄清上清液(細胞培養基)用於DNA分離。在裂解步驟之前，將口腔支原體DNA以3個菌落形成單位(cfu)/lml樣品的濃度加入樣品中。隨後將樣品分成2個相等體積。向一個等分試樣中加入以100mg/lml上清液濃度的CHO細胞DNA。從2個等分試樣中分開地分離總DNA。用每種DNA製備物的等分試樣進行幾次PCR反應。圖3和4顯示通過PCR獲得的擴增產物和在電泳泳動後的DNA片段的凝膠。明確地，CHO細胞DNA的添加使得MYC0T00L測試更有效(robust)，因為支原體屬 DNA在測試的所有摻加的樣品中檢測到。另一方面，不含CHO細胞DNA，8次PCR反應中僅1 次成功擴增對於支原體屬靶DNA特異的片段。在其中不存在CHO細胞DNA的情況下，可以看出(圖3)非特異性PCR片段基本上不存在(圖3中的泳道1是可能的例外)。這強調本發明人的PCR人工產物通常不通過 MYC0T00L測定產生的觀察。有趣的是，CHO細胞DNA的添加還不導致如在圖4中可以看出的非特異性擴增產物。實施例5
在摻加的水性緩衝液中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測不含任何汙染物的IOmM TrisHCl緩衝液pH7. 5用萊氏無膽甾原體DNA以1或 10cfu/lml緩衝液的濃度進行摻加。摻加和未摻加的緩衝液與CHO細胞DNA混合，以獲得 80 μ g/lml緩衝液的濃度。此外，製備不含CHO細胞DNA的摻加和未摻加的緩衝液。根據 MYCOTOOL方案，從每種摻加和未摻加的製備物來製備DNA。用每種DNA製備物的等分試樣進行幾次PCR反應。此外，用含有其為MYCOTOOL試劑盒的一部分(陽性對照)的對照質粒的約10個拷貝的Tris緩衝液的等分試樣進行PCR。圖5和6顯示具有通過PCR獲得的擴增產物和在電泳泳動後的DNA片段的凝膠。雖然PCR檢測對應於IOcfu的萊氏無膽甾原體DNA沒有問題，但Icfu的檢測在 CHO細胞DNA的存在下得到顯著改善。具有陽性對照質粒的泳道舉例說明與萊氏無膽留原體靶序列的特異性擴增產物比較的可區分的大小差異。實施例6 在來自培養的Vero細胞培養(懸浮細胞)的摻加樣品中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測向具有來自不含任何原核生物的培養物在IO5-IO6細胞/ml範圍中的細胞滴度的Vero細胞懸液中以3或lOcfu/lml細胞懸液的濃度摻加萊氏無膽留原體或口腔支原體DNA。向用3cfu/mlCH0細胞DNA摻加的培養物中，加入以10、30、50、70、85、100和 150 μ g/lml細胞懸液濃度的DNA。根據MYCOTOOL方案，由每種摻加的懸液以及僅Vero細胞的未摻加的懸液製備 DNA。用每種DNA製備物的等分試樣進行幾次PCR反應。此外，用含有其為MYCOTOOL試劑盒的一部分(陽性對照)的對照質粒的約10個拷貝的Tris緩衝液(IOmM TrisHCl緩衝液 PH7.5)的等分試樣進行PCR。圖7和8顯示具有通過PCR獲得的擴增產物和在電泳泳動後的DNA片段的凝膠。圖8中所示的樣品含有以150 μ g/lml細胞懸液的濃度的CHO細胞 DNA。當使用10、30、50、70、85和100 μ gCHO細胞DNA/Iml細胞懸液的濃度時，獲得可比較的結果。值得注意的是，在不存在CHO細胞DNA的情況下獲得某些非特異性(人工產物) PCR產物(參見圖7)。注意到在某些情況下這些人工產物條帶的大小與特異性擴增產物的大小的相似性(圖7中的泳道1-4)。令人驚訝的是，在CHO細胞DNA的存在下沒有產生非特異性PCR擴增產物(圖8，泳道1-4)。實施例7在來自含胚雞卵的尿囊液的「接種」樣品中原核DNA的16S-rRNA互補體中靶序列的檢測不含支原體汙染的尿囊液從用病毒疫苗株接種的含胚雞卵(9-11天)中收穫。用TE緩衝液1 1，000稀釋具有2.45xl03cfu滴度的萊氏無膽留原體的液體培養物。用尿囊液1 10稀釋這個稀釋度的等分試樣。加入這種1 10，000接種物的12. 2μ1 體積/Iml尿囊液，以獲得3cfu/lml接種的尿囊液的等價滴度。對接種的尿囊液實施DNA 分離而無進一步孵育，即細菌不允許在尿囊液中生長。提供了 4種不同樣品(i)不含CHO細胞DNA的接種的尿囊液，(ii)不含CHO細
17胞DNA的非接種的尿囊液，(iii)含加入的CHO細胞DNA的接種的尿囊液，和(iv)含加入的CHO細胞DNA的非接種的尿囊液。在(iii)和(iv)的樣品中，CHO細胞DNA的濃度是 208mg/lml 尿囊液。根據MYC0T00L方案，由每種接種和非接種的樣品(i_iv)製備DNA。用每種DNA製備物的等分試樣進行幾次PCR反應。此外，用含有其為MYC0T00L試劑盒的一部分(陽性對照)的對照質粒的約10個拷貝的Tris緩衝液(IOmM TrisHCl緩衝液pH7. 5)的等分試樣進行PCR。再次，可以驗證下述效應CH0細胞DNA的存在(a)抑制非特異性PCR擴增產物和 (b)增加PCR檢測的靈敏度。實施例8在來自含胚雞卵的尿囊液的「接種」樣品中原核DNA的16S-rRNA互補體中靶序列的檢測，其中將不同濃度的CHO細胞DNA加入PCR反應混合物中如實施例7中所述的進行實驗，除在DNA純化前不加入CHO細胞DNA。相反，在起始PCR之前，將CHO細胞DNA加入反應混合物中。在反應混合物中CHO細胞DNA的濃度是 0、2. 5、5和10 μ g/50 μ 1 (PCR反應混合物的體積)。這對應於最終反應混合物中的Oyg/ μ 1、0. 05μ g/μ 1、0. 1 μ g/μ 1和0. 2μ g/μ 1，即僅在起始PCR反應前的反應混合物。圖 9-12顯示結果。實施例9在摻加的水性緩衝液中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測如實施例5中所述的進行實驗，除萊氏無膽甾原體DNA的濃度是3cfu/lml緩衝液夕卜，並且代替CHO細胞DNA，在DNA純化前加入以200 μ g/lml緩衝液的濃度的小牛胸腺。圖 13顯示結果。值得注意的是，在小牛胸腺DNA的存在下生成的PCR片段顯示大小中的某些變動， 不像在CHO細胞DNA的存在下產生的片段，例如圖6中所示的那些(具體地)。因此，小牛胸腺DNA不適合於抑制PCR人工產物的形成。考慮到這些結果，得出結論CHO細胞DNA而不是小牛胸腺DNA(和其他真核基因組DNA)的能力可以提供所需效應， 原因在於最初基於SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 2的引物的MYC0T00L PCR適合於CHO細胞培養和培養上清液的事實。在做出最佳化時，CHO細胞的基因組DNA提供對於引物看起來是有利的「本底」並不顯而易見，因為「本底」看起來抑制人工產物的形成。來自其他物種的基因組DNA在組成中是不同的，並且看起來不能抑制非特異性人工產物的形成(或在實現這點時較不有效)。實施例10在來自含胚雞卵的尿囊液的「接種」樣品中原核DNA的16S-rRNA互補體中靶序列的檢測，其中添加小牛胸腺DNA如實施例7中所述的進行實驗，除代替CHO細胞DNA，在DNA純化前加入小牛胸腺外。提供了 4種不同樣品(i)不含小牛胸腺DNA的接種的尿囊液，(ii)不含小牛胸腺DNA的非接種的尿囊液，(iii)含加入的小牛胸腺DNA的接種的尿囊液，和(iv)含加入的小牛胸腺DNA的非接種的尿囊液。在(iii)和(iv)的樣品中，小牛胸腺DNA的濃度是200mg/lml 尿囊液。 圖14顯示結果。基本上，結論與實施例9相似。再次，與在CHO細胞DNA的存在下的PCR形成對比，產生非特異性擴增產物。
權利要求
1.一種用於測定具有生物學材料的樣品中細菌汙染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括步驟(a)處理所述樣品且純化來自所述經處理的樣品的核酸，隨後為(b)形成用於基於PCR的擴增反應的組合物(反應混合物)，所述組合物包括-根據SEQ ID NO 1的第一種引物、-根據SEQ ID NO 2的第二種引物，和-步驟(a)的所述純化核酸或其測量的部分作為模板；隨後為(c)用步驟(b)的所述組合物進行聚合酶鏈式反應(PCR)；隨後為(d)檢測擴增的靶序列的存在或不存在，其中所述擴增的靶序列的存在指示所述樣品中所述細菌汙染物的存在，並且所述擴增的靶序列的不存在指示所述樣品中所述細菌汙染物的不存在；所述改良的特徵在於相對於所述樣品的體積，將來自CHO細胞的預定量的DNA加入(i) 所述樣品、或(ii)步驟(a)的所述經處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的所述純化核酸、或(iv)步驟(b)的所述組合物中，由此所加入的來自CHO細胞的DNA減少步驟(d) 中的非特異性擴增。
2.權利要求1的方法，其特徵在於每ml液體樣品的DNA預定濃度在10yg/lml樣品-250 μ g/Iml樣品的範圍中。
3.根據權利要求1和2中任一項的方法，其特徵在於所述液體樣品選自具有培養的細胞的細胞培養基、無細胞的培養上清液和羊膜液。
4.根據權利要求3的方法，其特徵在於所述液體樣品是羊膜液。
5.根據權利要求4的方法，其特徵在於所述羊膜液來自含胚卵。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其特徵在於所述細菌汙染物是選自無膽留原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。
7.根據權利要求6的方法，其特徵在於所述細菌汙染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細菌汙染物是萊氏無膽留原體，或所述細菌汙染物是非凡螺原體。
8.一種組合物，其包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細胞的DNA。
9.根據任何權利要求8的組合物，其進一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。
10.一種組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細胞的DNA。
11.根據權利要求10的組合物，其進一步包含根據SEQID NO :1的第一種引物、根據 SEQ ID NO 2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。
12.根據權利要求11的組合物，其進一步包含嵌入染料。
13.—種試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii)以預定濃度的來自CHO細胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNAJP (iii)根據SEQ ID NO 1的第一種引物和根據SEQ ID NO 2的第二種引物。
14.根據權利要求10-12中任一項的組合物用於擴增原核汙染物的DNA的用途，所述原核汙染物的DNA來自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液。
15. 一種用於進行聚合酶鏈式反應(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有範圍為約IOObp-約 1500bp大小的特異性擴增產物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR中形成來自第一種模板的特異性擴增產物，所述 PCR在預定條件(R)下在具有預定組合物的反應混合物(Q)中進行，並且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，並且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應混合物(Q)中不形成來自第二種模板的擴增產物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA， 所述改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA；(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(d)在所述反應混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(c)的所述第三種模板、和(b) 的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進行PCR;其中非特異性PCR擴增產物的形成被抑制。
全文摘要
本發明提供了通過抑制非特異性擴增產物改良的基於PCR的靶序列擴增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴增汙染物的核酸的引物對。當對懷疑包含汙染物的來自第二種生物的DNA實施相同的基於PCR的擴增反應時，當第一種生物的基因組DNA的量存在於擴增反應中時，汙染物的檢測靈敏度和特異性增強。
文檔編號C12Q1/68GK102471804SQ201080033520
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月29日 優先權日2009年8月1日
發明者C·比克納 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司