一種作為a群鏈球菌四價疫苗保護性抗原的重組多肽的製作方法

2023-06-18 23:55:46

專利名稱：一種作為a群鏈球菌四價疫苗保護性抗原的重組多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術和疫苗藥物領域，更具體講，本發明涉及一種重組多肽， 該重組多肽可作為主要針對我國廣東省流行的可引起風溼熱的A群鏈球菌四個血清型的 四價疫苗的保護性抗原，編碼該重組多肽的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿 主細胞，DNA重組技術製備該重組多肽的方法，以及該重組多肽在A群鏈球菌疫苗研製中的 應用。
背景技術：
A群鏈球菌是臨床上最常見的致病性革藍氏陽性菌之一。A群鏈球菌通過空氣飛 沫、皮膚接觸等方式傳播可引起多種感染性的疾病。在所有A群鏈球菌引起的疾病中，以A 群鏈球菌上呼吸道感染導致的急性風溼熱和由此誘發的風溼性心臟病的危害最為嚴重，研 究表明，約3%的未治療的兒童咽炎可能發展為風溼熱，並最終導致風溼性心臟病。導致該 病的原因是由於部分血清型的A群鏈球菌與人體心肌組織存在共同抗原，A群鏈球菌感染 後可引起自身免疫性疾病。根據世界衛生組織的報導，全球每年517000人死於因鏈球菌感 染所致的各種疾病，其中2/3死於鏈球菌 感染後所致的風溼熱、風溼性心臟病、急性腎小球 腎炎等疾病。近年來，雖然抗菌素廣泛使用，但A群鏈球菌感染在一些發展中國家仍然十分 嚴重。我國八五期間進行的A群鏈球菌的流行病學調查發現，我國學齡兒童A群鏈球菌上 呼吸道年平均感染率達50 %，部分農村地區A群鏈球菌感染率高達70 % 80 %。保守估 計，我國因A群鏈球菌感染導致的風溼性心臟病患者在250萬以上，高額的手術和終身治療 費用給患者家庭和社會造成了嚴重的經濟負擔。因此，研製一個主要針對A群鏈球菌多價 疫苗非常必要。A群鏈球菌血清型眾多，根據其細胞壁M蛋白抗原的不同，可分為約150多個血清 型，並且各血清型之間缺乏交叉保護，因此很難研發一種針對所有流行毒株的疫苗。同時， 部分血清型的A群鏈球菌M蛋白抗原與人類組織蛋白存在交叉抗原。因此，傳統的菌體疫 苗或亞單位疫苗可能導致人體的自身免疫反應。到目前為止，全世界仍然沒有一個安全有 效的A群鏈球菌疫苗上市。M蛋白是A群鏈球菌菌體表面的主要毒力因子，有抗吞噬作用，機體感染A群鏈球 菌後產生的抗M蛋白的抗體是保護性抗體，自然感染後能持續存在30多年。近年來的研 究發現，M蛋白基因(emm)編碼的多肽C末端為高度保守，N末端高度變異，是A群鏈球菌 型特異性的基礎；N端由A、B、C三個重複片段組成，產生型特異性的保護性抗體的抗原決 定簇位於A區，產生與人體組織交叉反應的抗原決定簇位於B區、B-C區的側翼、A-B區的 側翼° (Alan L. Bison, Fran A. Rubin, P. Patrick Cleary and James B. Dale Clinical InfectiousDiseases 2005 ；41 11501156)因此，以M蛋白A區為基礎設計針對A群鏈球 菌不同血清型的疫苗既避開了人體產生交叉反應的區域，又可使機體產生保護性抗體，是A 群鏈球菌疫苗研製的一個可行的方法。研究表明，A群鏈球菌的M蛋白是由兩條完全為α-螺旋結構的多肽鏈構成的同源二聚體蛋白，空間結構為線性分子。因此，其抗原表位應為線性的抗原表位，不具有複雜的空間構象。將不同血清型A群鏈球菌M蛋白A區含有保護性表位，不含人體交叉反應表 位的胺基酸序列串聯連接後形成的人工設計的多肽應和天然M蛋白具有相似的空間結構， 並且不會破壞原有的抗原表位。歐美發達國家經長期的研究已確認致風溼熱原性的A群鏈球菌M分型主要集中在 皿1、3、5、6、14、18、19、24、27和29等10個血清型。2004年廣東省心血管病研究所在國內首 次報導了在廣東省和我國其他部分地區分離的104株A群鏈球菌的M蛋白emm基因分型的 結果,主導血清型是emml、18、12、69、110等型，其中emml型佔29. 8%，emml8型佔9. 6%。 這兩個血清型均為風溼熱原性的A群鏈球菌(陳志紅，龔守芳，董太明等.應用emm基因序 列分析對104株鏈球菌分型.中華微生物學和免疫學雜誌，2004，24 (6) :489_491.)。2008 年廣州市兒童醫院陳兆鴻等報導的廣州地區兒童感染A群鏈球菌87株的emm基因分型也 證實了以上結果(陳兆鴻，謝國強，鄧秋連等.廣州地區兒童感染A群鏈球菌87株的emm 基因分型.廣東醫學，2008，29 (4)583-584.)。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種主要針對我國廣東省流行的風溼熱原性的A群 鏈球菌的四價疫苗的保護性抗原，它是由廣東省流行的風溼熱原性的A群鏈球菌Ml、M3、 M6、M18四個血清型的M蛋白N端含保護性抗原表位，不含人體交叉反應表位的型特異性的 胺基酸序列以及這四個血清型M蛋白C端共有的一段保守胺基酸序列連接而成的一個重組 多肽。本發明的另一個目的是提供編碼該重組多肽的DNA、該DNA序列的獲得方法、含該 DNA序列的載體和含該載體的宿主細胞。本發明的第三個目的是提供獲得該重組多肽的方法。在本發明的第一方面，提供了一種重組多肽，它包括A群鏈球菌Ml型M蛋白型特 異性胺基酸序列的1-50個胺基酸(SEQ ID NO 3) ；A群鏈球菌M3型M蛋白型特異性序列 的21-70個胺基酸(SEQ ID NO 4) ；A群鏈球菌M6型M蛋白型特異性序列的1_35個胺基酸 (SEQ ID NO 5) ；A群鏈球菌M18型M蛋白型特異序列的1-45個胺基酸(SEQ ID NO 6) ；A 群鏈球菌M1、M3、M6、M18四個血清型M蛋白C端共有的一個含14個胺基酸的序列(SEQ ID NO 7)。以上所述的構成本發明重組多肽的5段胺基酸序列的連接順序，從左側NH2端至 右側COOH端依次為A群鏈球菌Ml型M蛋白型特異性胺基酸序列的1-50個胺基酸，A群鏈 球菌M3型M蛋白型特異性序列的21-70個胺基酸，A群鏈球菌M6型M蛋白型特異性序列 的1-35個胺基酸，A群鏈球菌M18型M蛋白型特異序列的1_45個胺基酸，A群鏈球菌Ml、 M3、M6、M18四個血清型M蛋白C端共有的一個含14個胺基酸的序列。見圖1。本發明提供的重組多肽具有序列表中序列1所示的胺基酸序列。在本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子以及該DNA分子的獲得方法。它 編碼SEQ ID NO :1所示的重組多肽，所述的DNA分子包括SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。獲取上述DNA分子的方法包括根據本發明重組多肽胺基酸序列選擇合適的遺傳 密碼子直接化學合成編碼本發明重組多肽DNA分子；採用PCR的方法從A群鏈球菌基因組中擴增出各血清型的目的基因，再通過SOE-PCR的方法拼接，形成編碼本發明重組多肽的 DNA分子；根據本發明重組蛋白胺基酸序列選擇合適的遺傳密碼子，合成一系列寡核苷酸 片段，然後通過overlap-PCR合成編碼本發明重組多肽的DNA分子。用這些方法得到的DNA 分子其遺傳密碼子可能不同，但最終翻譯產物一定含有本發明重組多肽的胺基酸序列。
在本發明的第三方面，提供了一種載體，該載體的特徵在於它含有按上述任何一 種方法獲得的包含有編碼本發明重組多肽的胺基酸序列的DNA分子。在本發明的第四個方面，提供了含有上述載體的宿主細胞，該宿主細胞在合適的 條件下誘導表達後，產生的重組蛋白一定含有本發明重組多肽的胺基酸序列。在本發明的第五個方面，提供了一種產生本發明重組多肽的一種方法。它包括步 驟在適合表達所述重組多肽條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達出重組多肽或含有重 組多肽胺基酸序列的重組蛋白，通過合適的方法分離純化重組多肽或含有重組多肽胺基酸 序列的重組蛋白。在本發明的第六個方面，提供了一種預防A群鏈球菌Ml、M3、M6、M18型感染的疫 苗，本疫苗含有權利要求1所述重組多肽以及藥學上可以接受的佐劑，也可含有一些免疫 增強劑。佐劑如氫氧化鋁、磷酸鋁、水包油乳劑、核酸類佐劑等，免疫增強劑包括已知的可 提高機體免疫的人體、植物或微生物的蛋白質、多糖、脂類或小分子化合物。定義如本文所用，術語「M蛋白的型特異性的胺基酸序列」是指目前已公開的可從美國 疾病和預防控制中心資料庫下載的不同血清型A群鏈球菌M蛋白N末端高度變異的胺基酸 序列，該段序列的抗原特異性決定A群鏈球菌的血清分型。下載地址:http://www. cdc. gov/ncidod/biotech/strep/strepindex. htm。如本文所用，術語「Ml、M3、M6、M18等」表示A群鏈球菌以M蛋白抗原性不同進行 的分型；術語「emml、emm3、emm6、emmlS等」表示A群鏈球菌以M蛋白基因的不同進行的分 型。兩者之間的關係為Ml型等同於emml型，M3型等同於emm3型，依此類推。如本文所用，術語「含保護性抗原表位，不含人體交叉反應表位的型特異性的氨基 酸序列是指A群鏈球菌M蛋白N末端的型特異性的胺基酸序列中可誘導機體產生保護性抗 體，同時又不會引起自身免疫反應的區段。如本文所用，術語「C端共有的一段保守胺基酸序列，，是指文獻已公開的A群鏈球 菌M蛋白大多數血清型C端保守區都有的一段與人體組織蛋白無交叉抗原的區段(Hayman WA, Brandt ER, Relf WA, et al. Int Immunol,1997,9(11) 1723-1733)。如本文所用，術語「載體」包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體等。在本發明中可 選用本領域已知的各種載體如市售載體，然後將編碼本發明重組蛋白的核苷酸序列克隆進 載體提供的表達調控序列之後，可形成蛋白表達載體。如本文所用，術語「宿主細胞」主要指原核細胞，包括大腸桿菌、枯草桿菌等。在本發明的一個實例中，將編碼重組多肽的基因Strep4克隆入原核表達載體 PQE30質粒，並將重組質粒轉入大腸桿菌M15，獲得了可可溶性表達重組多肽的大腸桿菌重 組菌 M15/PQE30-Str印4。本發明的重組多肽免疫家兔後可產生針對A群鏈球菌Ml型、M3型、M6型的型特異 性的殺菌抗體。在一個實例中，將重組多肽免疫後的家兔血清分別與A群鏈球菌Ml型、M3型、M6型、M5型的菌體進行間接免疫螢光實驗，結果發現，家兔免疫血清只和重組多肽上包 含血清型的A群鏈球菌Ml型、M3型、M6型反應，不和無關的M5型A群鏈球菌反應。這表 明，由重組多肽免疫後產生的抗體是型特異性抗體。在另一個實例中，將滅活補體後的重組 多肽免疫家兔血清分別與A群鏈球菌Ml型、M3型、M6型、M5型以及不含針對這些血清型A 群鏈球菌抗體的健康成年人抗凝血混合，進行體外殺菌實驗，結果發現，免疫血清僅對重組 多肽上包含血清型的A群鏈球菌Ml型、M3型、M6型有較高的殺菌率，而對無關的M5型A群 鏈球菌無殺菌作用。這表明，由重組多肽免疫後產生的抗體是型特異性的殺菌抗體。綜上所述，本發明通過基因重組技術，構建了一個含可引起風溼熱的A群鏈球菌 Ml型、M3型、M6型、M18型四個血清型M蛋白N端含保護性抗原表位，不含人體交叉反應表 位的型特異性胺基酸序列的重組多肽。實驗表明，該重組多肽可誘導產生針對A群鏈球菌 Ml型、M3型、M6型的特異性的殺菌抗體，因而可作為預防我國廣東省主要流行的風溼熱原 性的A群鏈球菌四價疫苗的保護性抗原。


圖1為本發明重組多肽結構示意圖。
圖2為overlap-PCR擴增的重組多肽基因的電泳圖譜，圖中1為overlap-PCR第 一輪反應後的產物；2，3為overlap-PCR第二輪反應後的產物(重組多肽基因)；4為空白； 5 :DL2000markero圖3為含重組多肽基因的大腸桿菌克隆載體PUClS-Str印4。圖4為含重組多肽基因的大腸桿菌表達載體PQE30_Str印4。圖5為M15/PQE30-Str印4工程菌誘導表達後SDS-PAGE電泳圖譜，圖中1為 蛋白質分子量標準；2，4，6為M15/PQE30-Str印4工程菌IPTG誘導表達；3，5，7為M15/ PQE30-Str印4工程菌未誘導表達；8為帶有PQE30質粒的大腸桿菌M15經IPTG誘導表達； 9為帶有PQE30質粒的大腸桿菌M15未誘導表達。圖6為重組多肽表達純化的SDS-PAGE電泳圖譜，圖中1為蛋白質分子量標準；2為 M15/PQE30-Strep4工程菌未誘導表達；3為M15/PQE30_Str印4工程菌誘導表達；4為M15/ PQE30-Strep4工程菌誘導表達後超聲裂解上清；5為用Ni-NTA凝膠吸附後上清；6為用洗 脫緩衝液1洗脫後上清；7為用洗脫緩衝液2洗脫後上清(純化重組多肽)。圖7為家兔免疫後血清中抗重組多肽的IgG抗體滴度變化曲線；圖8免疫血清和免疫前血清分別與A群鏈球菌Ml、M3、M6、M5型的間接免疫螢光 反應結果，其中A為免疫血清和Ml型A群鏈球菌的免疫螢光反應；B為免疫前血清和Ml型 A群鏈球菌的免疫螢光反應；C為免疫血清和M3型A群鏈球菌的免疫螢光反應；D為免疫前 血清和M3型A群鏈球菌的免疫螢光反應；E為免疫血清和M6型A群鏈球菌的免疫螢光反 應；F為免疫前血清和M6型A群鏈球菌的免疫螢光反應；G為免疫血清和M5型A群鏈球菌 的免疫螢光反應；H為免疫前血清和M5型A群鏈球菌的免疫螢光反應。圖9為免疫血清針對不同血清型A群鏈球菌殺菌率的條形示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實例進一步闡述本發明。這些實例僅用於說明本發明，而不是限制本發明的範圍，下列實例中未註明具體具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 sanbrook等人的分子克隆實驗手冊中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1重組多肽基因序列的合成以及大腸桿菌克隆載體的構建從美國疾病和預防控制中心資料庫下載A群鏈球菌emml、emm3、emm6、emml8四 個型別M蛋白N端型特異性序列，獲得在重組多肽中這四個型別對應的胺基酸序列；從 報導文獻中獲取這四個型別M蛋白C端的共有序列。將5段胺基酸序列按從N端到C端 1-3-6-18-共有保守序列的順序，串聯拼接全部的胺基酸序列(SEQ ID NO :1)。將胺基酸序列輸入DNAW0RK 2. 0在線軟體，運行後獲取一個帶有大腸桿菌偏嗜性 密碼子的編碼重組多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)，以及採用overlap-PCR方法合成該 核苷酸序列的一套寡核苷酸序列(SEQ ID NO 8-17)和相應的技術參數。在第一條和最後 一條寡核苷酸序列的5』端分別引入了 BamHI和HindIII的酶切位點。合成該套寡核苷酸序列，通過兩輪PCR反應擴增目的基因序列。表1.第一輪PCR反應體系 反應條件為95°C 5分鐘預變性，95°C，1分鐘，64°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘， 共15個循環後再72°C延伸2分鐘。表2.第二輪PCR反應體系
反應體系μ
寡核苷酸序列 ο2
5XPCRbuffer10
dNTP Mix(10 μ M)4
primeSTAR HS DNA polymerase(2. 5U/ml) θ7δ ddH2029 5
反應總體積50 反應條件為95°C 5分鐘預變性，95°C，1分鐘，64°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘， 共30個循環後再72°C延伸2分鐘。通過兩步PCR，成功擴增出一個600bp左右的DNA片段，和設計預期相同。(圖2)PCR產物經純化和BamH I和HindIII雙酶切後後克隆到大腸桿菌克隆載體PUC18 中，構建重組克隆質粒，命名為PUClS-Str印4(圖3)。藍白斑法篩選陽性克隆，經測序分析 插入的核苷酸序列和SEQ ID NO :3中的序列完全一致。實施例2重組多肽表達載體的構建BamH I和HindIII分別雙酶切重組克隆質粒PUC18_Str印4，以及大腸桿菌原核表 達質粒PQE30。瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，回收純化編碼重組多肽疫苗的DNA片段和 PQE30質粒的酶切片段，連接構建重組表達質粒，命名為PQE30-Strep4(圖4)。轉化大腸杆 菌M15，氨苄青黴素、卡那黴素雙抗性篩選陽性克隆，經測序分析插入的核苷酸序列和SEQ ID NO 3中的序列完全一致。獲得的表達重組多肽的工程菌命名為M15/PQE30-Str印4。實施例3重組多肽的表達將實例2獲得的工程菌M15/PQE30-Str印4接種於20ml含100μ g/ml氨苄青黴素， 25μ g/ml卡那黴素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜。第二天將20ml隔夜培養的菌 液接種於IL含100 μ g/ml氨苄青黴素，25 μ g/ml卡那黴素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培 養，至菌液OD6tltl達到0. 6後加入IPTG至終濃度為ImM。繼續培養4個小時後，4000 X g，20 分鐘離心收菌。菌體沉澱經SDS-PAGE電泳分析在分子量約24KD處有蛋白質高表達的條帶 (圖5)。這和預測的表達產物的分子量是一致的。預測的表達產物包括重組多肽的194個 胺基酸、PQE 30質粒上含6個組氨酸標籤在內的10個胺基酸以及BamH I酶切位點編碼的 2個胺基酸，分子量為23. 8KD。實施例4
重組多肽的Ni2+親和層析純化將實例3獲得的菌體沉澱，用裂解緩衝液重懸，洗滌兩次，最後將菌體用20ml裂解緩衝液重懸於2支50ml離心管中，冰浴中超聲裂解菌體(200-300W，超聲30秒，停30秒，10 個循環)。，4000 Xg,4°C 20分鐘離心，收集超聲上清，0. 45um濾膜過濾。每5ml —管超聲上 清加入0. 5ml預先處理好的Ni-NTA凝膠，在IOml離心管中室溫振蕩混合1小時，500rpm， 5分鐘離心，去上清。加入IOml洗脫緩衝液1，室溫振蕩混合10分鐘，500rpm, 5分鐘離心， 重複洗滌一次，去上清，重複該步驟一次。加入3ml洗脫緩衝液2，室溫振蕩混合30分鐘， 500rpm, 5分鐘離心，收集含有純化重組多肽的洗脫緩衝液，重複洗脫一次。將純化的重組多 肽收集於3. 5KD孔徑的透析袋中，用PH7. 4的磷酸鹽緩衝液作為透析外液進行透析，以去除 純化蛋白中殘留的咪唑和Ni2+。共換透析外液10次，4小時/次。將透析後的純化重組多 肽除菌過濾，凍存。純化後的重組多肽經SDS-PAGE電泳鑑定後表明，純度較高，見圖6。實施例5重組多肽免疫原性的檢測將實例4獲得的純化的重組多肽疫苗與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化後， 皮下多點注射2Kg左右的健康雄性家兔3隻，2ml/只。初次免疫4周和8周後，以同樣劑量 抗原，採用不完全弗氏佐劑，皮下多點注射加強兩次。在初次免疫前和第一次免疫後每兩周 家兔耳靜脈採血，獲得免疫血清，以檢測免疫後抗體滴度的變化，於免疫後12周將免疫家 兔頸總動脈放血處死，大量製備免疫血清。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測免疫的不同時 間點，家兔血清中抗重組多肽疫苗I gG抗體的滴度變化情況。滴度判斷為以OD值大於每 只家兔免疫前血清OD值2倍的最高稀釋度作為待測血清的滴度。檢測結果如表3 表3重組多肽免疫後家兔血清抗重組多肽IgG抗體滴度
時間(周)I #1家兔#2家兔#3家兔
~1 1024001 256001 204800
~~61 2048001 512001 819200
~~81 4096001 204800 1 409600
~101 409600 1 204800 1 409600
~121 409600 1 204800 1 409600滴度變化曲線見圖7。從檢測結果可以看出，三隻家兔經重組多肽免疫後均產生了高滴度的針對重組多 肽的抗體，說明重組多肽有較好的免疫原性。實施例6重組多肽免疫後抗體特異性檢測用實例5獲得的3隻家兔的免疫血清和免疫前血清分別與從中國醫學菌種庫購買 的A群鏈球菌Ml型、M3型、M6型、M18型以及M5型(菌種編號分別為32171、32172、32175、 32180、32174)進行間接免疫螢光實驗，其中M5型作為陰性對照血清型。將血清從1 50開始對倍稀釋至1 6400，將不同稀釋度的血清作為一抗分別與5個血清型的A群鏈球菌進 行反應，37°C，1小時，PH7. 4的磷酸鹽緩衝液洗三次；滴加FITC標記的羊抗兔IgG，37°C 30 分鐘，PH7. 4的磷酸鹽緩衝液洗三次；乾燥後，滴加緩衝甘油一滴，加蓋玻片封片，螢光顯微 鏡下，分別用400 X，1000X油鏡觀察。以每份血清樣品與細菌反應後肉眼可見螢光的最高 稀釋度作為該血清樣品針對該血清型A群鏈球菌的免疫螢光滴度。從檢測結果如表4和圖 8所示。表4免疫血清和免疫前血清和不同血清型A群鏈球菌間接免疫螢光反應的滴度 「_」為間接免疫螢光反應陰性。從檢測結果可以看出，三隻家兔經重組多肽免疫後均產生了針對A群鏈球菌Ml、 M3、M6型M蛋白的型特異性抗體。實施例7重組多肽免疫兔血清的體外殺菌抗體實驗將實例6中所用的Ml型、M3型、M6型、M18型A群鏈球菌分別培養於3ml THB培 養基中，37°C靜止過夜。取各血清型A群鏈球菌的隔夜培養菌液0. Iml連續10倍稀釋至 10_5，將50ul稀釋後的菌液，IOOul實例5獲得的3隻家兔的免疫血清或免疫前血清(滅活 補體)以及350ul健康成年人抗凝全血(預實驗確定該血不含針對實驗用血清型A群鏈 球菌殺菌抗體)充分混合，37°C振蕩孵育3小時，每次實驗設免疫前血清對照，孵育3小時 後，取50ul孵育混合物塗布兔血瓊脂平板，37°C孵育過夜，次日統計每個平板上菌落個數， 若平板上菌落數超過1000個不便準確計數，按1000個計算。計算免疫血清對不同血清型 A群鏈球菌的殺菌率。按下列公式計算殺菌率殺菌率=(免疫前血清平板菌落數-免疫血清平板菌落數)/免疫前平板菌落 數X 100%檢測結果如表5所示表5重組多肽免疫兔血清體外殺菌抗體實驗抗體殺菌率 從檢測結果可以看出，三隻家兔經重組多肽免疫後均產生了針對A群鏈球菌Ml、 M3、M6型的殺菌抗體。免疫血清殺菌率的條形示意圖見圖9。以下為本發明專利申請涉及的胺基酸和核苷酸序列表，序列表中各序列依次為序列1 本發明重組多肽的胺基酸序列序列2 本發明重組多肽編碼基因序列序列3 =A群鏈球菌Ml型M蛋白型特異性胺基酸序列的1_50個胺基酸序列4 =A群鏈球菌M3型M蛋白型特異性胺基酸序列的21_70個胺基酸序列5 =A群鏈球菌M6型M蛋白型特異性胺基酸序列的1_35個胺基酸序列6 =A群鏈球菌M18型M蛋白型特異性胺基酸序列的1_45個胺基酸序列7 :A群鏈球菌Ml型、M3、M6、M18型M蛋白C端共有的一段保守序列序列8 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列1序列9 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列2序列10 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列3序列11 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列4序列12 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列5序列13 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列6序列14 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列7序列15 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列8序列16 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列9序列17 =Overlap-PCR合成重組多肽基因所用寡核苷酸序列10序列表SEQUENCE LISTING武漢生物製品研究所 一種作為A群鏈球菌四價疫苗保護性抗原的重組多肽/17PatentIn version 3. 51194PRT
人工1Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala Asn151015Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp Leu202530Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys354045Arg Ala Asn Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Asn Lys His Asn505560Ser Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg65707580Gln Lys Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu859095Leu Gln Glu Leu Arg Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp100105110Lys Ala Arg Glu Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu115120125Gln Ala Asn Asn Asp Lys Leu Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp130135140Asn Lys Asp Glu Leu lie Lys Arg Ala Asn Asp Tyr Glu lie Gln Asn145150155160His Gln Leu Thr Val Glu Asn Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln165170175Leu Thr Lys Glu Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala180185190Leu Glu2582DNA 人工2aacggcgatg gtaacccacg cgaagtcatc gaagacctgg ccgccaataa tccggccatc 60cagaacattc gtttacgcca cgaaaacaaa gatctgaaag cacgtctgga aaatgcaatg 120gaggtcgcgg gtcgcgattt caaacgcgca aatttactgg atcaagtgac gcaactgtac 180aacaaacaca atagcaatta tcagcagtac agcgcccagg ccggtcgttt agacctgcgc 240caaaaagcag aatacctgaa aggcctgaat gactgggcgg agcgcttatt acaggagtta 300cgcgtgtttc cacgcggcac ggtcgaaaat ccggacaaag cgcgcgagtt actgaataag 360
tacgatgtcg agaactctat gttacaggcc aacaatgata agctggcacc gctgacccgt 420
gcaaccgccg acaataagga tgaattaatc aaacgtgcca acgattatga gatccaaaac 480caccagttaa cggtggagaa taagaagctg aagacggaca aggagcagct gaccaaagag 540gccagccgtg aggcaaaaaa acaagttgaa aaggcgctgg ag582350PRTA群鏈球菌Ml型3Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala Asn151015Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp Leu202530Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys354045Arg Ala50450PRTA群鏈球菌M3型4Asn Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Asn Lys His Asn Ser Asn151015Tyr Gln Gln Tyr Ser Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg Gln Lys202530Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu Gln354045Glu Leu50535PRTA群鏈球菌M6型5Arg Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu
151015Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu Gln Ala Asn Asn202530Asp Lys Leu
35645PRTA群鏈球菌M18型6Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp Asn Lys Asp Glu Leu lie Lys151015Arg Ala Asn Asp Tyr Glu lie Gln Asn His Gln Leu Thr Val Glu Asn202530Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln Leu Thr Lys Glu354045714PRTA 群鏈球菌 Ml 型、M3、M6、M18 型7Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Glu1510856DNA人工序列8ggcggatcca acggtgacgg taatccgcgc gaggtgattg aagatctggc cgccaa 56990DNA人工序列9gcattctcta agcgtgcctt taaatcctta ttttcgtgac gcagacggat attttggatc 60gccgggttat tggcggccag atcttcaatc901090DNA人工序列10atttaaaggc acgcttagag aatgccatgg aggtcgcagg ccgcgacttt aaacgtgcaa 60atttactgga ccaggttacg caactgtaca 90
1190DNA 人工序列11ctgccttctg acgtaaatcc agacgacctg cctgtgcaga gtattgctgg tagttagaat 60tgtgcttatt gtacagttgc gtaacctggt901290DNA人工序列12tctggattta cgtcagaagg cagaatatct gaagggcctg aacgactggg cggaacgcct 60gttacaagag ctgcgcgtgt ttccacgcgg901390DNA人工序列13ttgcctgtaa catagagttt tcaacgtcgt atttgttcag cagttcacgt gctttgtctg 60ggttttcgac cgtaccgcgt ggaaacacgc901490DNA人工序列14acgttgaaaa ctctatgtta caggcaaata atgataaact ggcaccgctg acgcgtgcga 60cggcagacaa caaggacgag ctgattaagc901590DNA人工序列15tatcggtctt cagcttcttg ttctcaaccg tcagttgatg gttttgaatt tcgtagtcat 60tggcgcgctt aatcagctcg tccttgttgt901690DNA人工序列
16gagaacaaga agctgaagac cgataaggag cagctgacca aagaagcatc tcgcgaagcc 60aagaaacagg tggaaaaggc attagaataa901738DNA人工序列17ccgaagcttt tattctaatg ccttttccac ctgtttct38
權利要求
一種重組多肽，其特徵在於，它具有序列表中序列1所示的胺基酸序列。
2.一種分離的DNA分子，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的重組多肽。
3.根據權利要求2所述的分離的DNA分子，其特徵在於，它具有序列表中序列2所示的 核苷酸序列。
4.將權利要求1所述多肽作為抗原在製備針對A群鏈球菌疫苗中的應用。
5.一種產生權利要求2或3所述的DNA分子的方法，其特徵在於，所有可以得到該DNA 分子的化學合成或各種PCR擴增的方法，用這些方法得到的DNA分子其遺傳密碼子可以不 同，但最終翻譯產物一定含有權利要求1所述的重組多肽的胺基酸序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求2或3所述的DNA分子。
7.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求8所述的載體。
8.權利要求1所述重組多肽的製備方法，其特徵在於，在適合表達所述重組多肽條件 下，培養權利要求8所述的宿主細胞，分離和純化所述的重組多肽。
9.一種疫苗，其特徵在於，它含有權利要求1所述重組多肽以及藥學上可以接受的佐劑。
10.根據權利要求9所述的疫苗，其特徵在於，它還含有免疫增強劑。
全文摘要
本發明提供了一種通過基因重組技術製備的重組多肽，該重組多肽由我國廣東省流行的風溼熱原性A群鏈球菌M1、M3、M6、M18四個血清型的M蛋白N端含保護性抗原表位，不含人體交叉反應表位的型特異性胺基酸序列以及這四個血清型M蛋白C端共有的一段保守胺基酸序列拼接而成的。實驗證明，該重組多肽可誘導產生針對A群鏈球菌M1、M3、M6型的型特異性的殺菌抗體，因而該重組多肽可用於製備針對A群鏈球菌的重組多肽疫苗。
文檔編號C12P19/34GK101845084SQ20091006128
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者全家嫵, 喻剛, 楊京生 申請人:武漢生物製品研究所