活細胞標記的製作方法

2023-06-07 02:25:46 2

專利名稱:活細胞標記的製作方法
本項發明涉及標記活細胞而對細胞的形態或功能沒有不利影響的新方法。
螢光檢測方法作為測定許多細胞特殊性質的分析手段，廣泛應用於免疫學和細胞生物學的各個方面。螢光檢測的優點是，單個染料分子能夠在每秒鐘裡幾千次地被激發並返回基態，發射出許多光子。因此，如果一個單個抗體分子用兩個或三個染料分子標記，就能從一個單個的抗原一抗體結合位點獲得幾千個光子。這是一項很可觀的信號增強技術。
二氧雜羰花青染料已被用來進行白血細胞分類測定。Gunter Valet，MaX Planck Ges Wissensch;專利登記號84-102307/17，通過同時進行選擇性染色、體積和螢光測定對血細胞的定量測定。可是，在這些研究中運用的染料是短鏈羰花青染料(少於10個碳)，並且對膜電位的變化有反應。此外，這些短鏈羰花青染料進入細胞線粒體，是毒害細胞的，而且當洗滌細胞時，不論細胞膜電位是否變化，染料都容易滲出細胞。本項發明的長鏈染料被封閉在細胞膜裡，並且只受到膜電位非常小的影響。它們不滲出細胞。
用於進行白血細胞鑑別的其它類型的染料不是花青類的，而且不嵌隔到脂質裡。吡喃鎓(Pyrilium)或噻喃鎓(thiapyrili-nm)化合物已經被用來區分白血細胞種類(David S.Frank，R.T.Belly，專利登記號84-166275/27，《用吡喃鎓或噻喃鎓化合物染色來鑑別生物樣品中的細胞》)。可是，這些染料是結合到細胞的胞質或細胞核成分上的，它們不是特異地結合到細胞膜上。其它陽離子染料(L.Kass，專利登記號81-78187/43，《用異染性陽離子染料染色確定不同白細胞的類別》，L.kass，美國專利號4，400，370，1983年8月23日，《用於白細胞分類確定的異染染料吸附方法》，L.kass，專利登記號83-771982/39，《用特定鹼性染料染色不固定細胞分析人的血細胞》)已經被用來進行白血細胞的鑑別，然而，這些染料不能有效地嵌隔在膜的脂質裡，而是著染細胞內的各種細胞器。另一種用來進行白血細胞鑑別的異染性染料是吖啶橙(P.J.Natale，美國專利號4，336，029，1982年6月22日，《用於全血中網織紅細胞和血小板定量測定的方法和試劑》，R.J.Gershman，美國專利號4，325，706，1982年4月20日，全血中血小板和網織紅細胞的自動檢測。吖啶橙能染色細胞的RNA和DNA，而不能有效地嵌隔在膜的脂質裡。
另外一項應用是利用部花青540來區分正常細胞和惡性細胞。這種染料有一個長烴鏈尾巴，最長有15個碳，可這個分子在烴鏈尾巴末端有一個親水基團，並且當細胞受光照時染料是毒害細胞的。Valinsky，J.E.，Reich，E.and Easton，T.G.，美國專利號4，424，201，1984年1月3日，《運用部花青染料檢測惡性白細胞》。部花青特異地摻入到正常和惡性細胞的細胞膜中。
短鏈脂肪族花青染料被用在許多生物學分析上。可是，這些短脂肪鏈分子對膜電位有反應，並能跨過細胞膜，穿透到細胞的線粒體內。H.M.Shapiro，美國專利號4，343，782，1982年8月10日。這些短鏈花青染料也是毒害細胞的，並且因為它們迅速地從細胞中滲出來，所以不能用在活體內示綜細胞。
三羰花青染料(Fox，I.J.，et al.，Proc.Mayo Clinic 32478-484，1957)和伊文思藍(Evans-blue)染料(Schad，H.，et al，Pfluegers Arch Eur J.Physiol 370(2)139-144，1977)已經用來在活體內通過一種稀釋方法測定心輸出量。道爾(Dow)(Dow，P.，Physiol.ReV.3677-102，1956)把這種方法描述為，把已知量的某種血管內指示劑注射到肺的靜脈側，然後測定這種指示劑在動脈中的濃度隨時間變化的過程，以確定注射點和取樣點之間的體積。這些染料不能用來染色細胞。
螢光素和若丹明染料的長鏈脂肪族衍生物已被用來監測細胞融合(Wanda，P.E.and Smith，J.D.，J.Histochem.CytoChem 301297-1300，1982)。可是，這些染料只含有一種脂肪族碳鏈，而且長時間在膜裡是不穩定的。並且，異核體形成的檢測方法是根據兩個染料分子之間的共振能量轉移。此外，染色是在鹽水中進行的，尚不了解其溶解性。
生物物理學家已經利用長鏈型的雙脂肪族花青染料的主要用途來研究細胞膜的流動性(D.Axelrod，Biophysical J.，26557-574，1979)。在這些類型的研究中，染料是從一種乙醇原液被用到短期培養的細胞上的。據幾名研究人員報導，染色過程中變化很大。可是對於生物物理測定來說，有必要在每個被研究的細胞都被測定幾次的地方，只考查幾個細胞。結合到質膜上去的長鏈羰花青染料也已經用來測定培養神經元的原始同一性。Honig，M.G.and Hume，R.I.，J.Cell Biology 103171-187(1986)。一種對細胞的形態或功能沒有不利影響而同樣染色活細胞的方法是上述參考文獻中所沒有的。
本發明是可對活細胞進行牢固而可重複的標記的新方法，對細胞的形態或功能沒有明顯的改變。根據本發明，細胞用一種具有足夠脂溶性和足夠高的細胞膜分配係數的花青染料進行標記，以便最大限度地減少或防止染料分子從細胞膜中流出。把染料加到懸浮在含有一種滲透壓調節劑的介質裡的細胞中，能達到堅固的、可重複的標記，這種滲透壓調節試劑對細胞生活力沒有明顯影響而且染料能夠在其中溶解。這樣的滲透壓調節試劑包括糖、糖醇、胺基酸和某些氫離子緩衝劑(「Good氏緩衝劑「)。
本發明方法用於標記各種細胞而對細胞的形態或功能沒有不利影響，本方法中使用花青染料。具有下列結構的化合物在這裡被稱作花青染料
其中Y是氧，硫，亞甲基或被烷基取代的亞甲基;
m是0-3;
n是12-22。
這裡所用的被烷基取代的亞甲基是指具有甲基、乙基或丙基取代基的任何組合的單或雙取代亞甲基。
具有上述結構的化合物用下述通用的速記公式表示DiYCn(2m+1)Sims，P.J.，et al.，Biochem.，133315(1974)。舉例來講也就是說，其中的Y是硫，並具有3個碳原子來連接環，還有2個14碳脂肪鏈的化合物記作DiSC14(3)。相似地，DiIC14(5)表示其中的Y是異丙基，有5個碳原子來連接環以及2個14碳脂肪鏈的該化合物。
具有上述結構、有一個或多個取代的化合物包括在這裡被稱作花青染料的化合物中，假定這樣的取代化合物至少在標記所需要的時間裡可以溶解在細胞標記介質中，而且具有足夠高的細胞膜分配係數以保持與被標記的細胞膜結合。這樣的化合物還必須在標記所需的濃度下對細胞的生活力沒有明顯影響。染料在細胞標記介質裡的溶解性是按照下述的方法測定的，把一種花青染料分散到標記介質中，用一般螢光分光光度技術測定細胞的螢光強度隨時間的變化。螢光強度下降表明染料沉澱並附著到容器壁上。例如，使用已知的流動式血細胞計數方法，來監測標記後重新注射到供血動物中的紅血細胞的螢光強度，以確定染料是否仍然與細胞膜結合。重新注射後，標記細胞的螢光強度基本不變，證實了染料在細胞膜中的溶解性。
摻入一個可用核磁共振成象檢測的原子的上述結構的化合物也包括在這裡被稱作花青染料的化合物中。這樣的化合物可以通過比如把一個氟原子摻入脂肪鏈的甲基基團之一來製備。用象125I這樣一個伽馬放射物標記的上述結構的化合物，在這裡也被稱作花青染料。
本發明所使用的花青染料可以從多處購買到，象Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，而且能夠用已知的合成方法從現有的起始原料製備。Hamer，F.M.，The Cyanine Dyes and Related Compounds，Interscience Publishers(1964)。
使用本發明的方法，任何活細胞都能用花青染料標記。這裡所用的「細胞」這個術語，包括原核細胞，如細菌，具核的真核細胞如白血細胞、各種腫瘤細胞和培養的哺乳動物細胞，例如，中國倉鼠卵巢細胞，酵母，還包括無核細胞如紅血細胞和血小板。如果一個有核的細胞能夠生長，或者能基本上象它所屬類型細胞那樣行使功能，細胞就是活的;一個不具核的細胞如果能夠行使它預期的功能就是活的，例如，一個活的紅細胞能夠運輸氧和二氧化碳;活的血小板能夠在如聚集和釋放分析中基本上表現其應有的行為。
細胞標記在一種不會使細胞致死的介質中進行，該介質能提供可重複的細胞標記。要使這種介質具有這些必要特徵，得使用滲透壓調節劑，花青染料至少可以在標記所需要的同樣長的時間裡在這種試劑中形成穩定的溶液。合適的滲透壓調節劑包括這樣的試劑或試劑組合，如糖，例如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖等單糖和蔗糖等雙糖，糖醇，如甘露醇、甘油、肌醇、木糖醇及阿東糖醇，胺基酸，如甘氨酸和精氨酸，以及某些Good氏緩衝劑，如N-三(羥甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸以及下面列在表Ⅱ中的那些化合物。Good，N.E.，et al，Biochem.15，467-477(1966)，Good，N.E.and S.Izawa，Methods Enzymol.，24，Part B，53(1968)，Feguson，W.J.，etal.，Anal.Biochem.104301-310(1980)。然而，有些細胞系可能對其中一種或多種滲透壓調節劑敏感，特別是對糖醇。因此，標記以前要進行標準檢驗，以肯定細胞在所要用的滲透壓調節劑中是能夠生存的。此外，可在標記介質中加入少量緩衝劑來調節氫離子濃度。
與各種滲透壓調節劑接觸對細胞生活力的影響，是通過測定Yac細胞在接觸各種滲透壓調節劑30分鐘後細胞的倍增時間來確定的。Yac細胞是可以從American Type Culture Collec-tion公開得到的一種小鼠淋巴瘤組織培養細胞系，由Kiessl-ing，R.，European J.Immunology 5112-117(1975)描述。正如表Ⅰ列出的數據所表明的，與磷酸鹽緩衝液相比，與蔗糖、葡萄糖和Good氏緩衝液TAPS，CAPS，EPPS，HEPPSO和DIPSO接觸，對細胞倍增時間產生可忽略的影響，說明不存在與接觸有關的細胞毒性。
表Ⅰ滲透壓調節劑 倍增時間(小時)磷酸鹽緩衝鹽溶液 31.0蔗糖 41.0葡萄糖 34.5TAPS 32.5CAPS 45.8EPPS 32.2HEPPSO 23.4DIPSO 36.73-氨基-1-丙磺酸 99.63-(N-嗎啉代)丙磺酸鈉(MOPS) A2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇 B2-氨基-2-甲基-1-丙醇 BN-三(羥甲基)甲氨基乙磺酸(TES) BN，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基 A乙磺酸(BES)3-(環己氨基)-2-羥基 A-1-丙磺酸(CAPSO)三乙醇胺 B三(羥甲基)氨基甲烷(TRIZMA) B
表Ⅰ(續)滲透壓調節劑 倍增時間(小時)Bis-tris丙烷 B2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES) B3-〔二甲基(羥甲基)甲氨基〕-2- A羥基丙磺酸(AMPSO)N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸 57.7(BICINE)3-〔(-3-膽醯胺丙基)二甲基銨〕 B-1-丙磺酸鹽(CHAPS)3-〔N-三(羥甲基)甲氨基〕-2- 63.6羥基丙磺酸(TAPSO)3-(N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸 178.4(MOPSO)2-〔(2-氨基-2-氧乙基)氨基〕 1038.4乙磺酸(ACES)雙(2-羥乙基)亞氨基-三-(羥甲基) A甲烷(BIS-TRIS)2-(N-環己氨基)乙磺酸(CHES) 51.5N-三-(羥甲基)甲基甘氨酸 A(TRICINE)葡糖胺 288.4咪唑 B甘氨醯甘氨酸 66.9A-不生長或部分細胞毒性B-劇烈細胞毒性表Ⅱ給出用於檢查花青染料溶解性的各種滲透壓調節劑。所有濃度的測定都是通過離心除去沉澱後，把含有花青染料的滲透壓調節劑的小等分樣品溶解到乙醇裡進行螢光分光光度分析而進行的。所用的染料是DiSC14(5)和DiOC14(3)，滲透壓調節劑處在等滲濃度。以乙醇溶液作標準，螢光強度的下降與花青染料溶解性的降低直接相關。
表Ⅱ相對螢光強度(CONC)滲透壓調節劑 DiSC14(5) DiOC14(3)乙醇 100 100葡萄糖 31 100果糖 35 100山梨糖 40 100蔗糖 41 100木糖 36 19-52核糖 24 100來蘇糖 0.12 1.8甘氨酸 31 93精氨酸 17 17.2甘油 39 99.5肌醇 42 92木糖醇 34 76.4甘露醇 29 ＊阿東糖醇 34 ND
表Ⅱ(續)相對螢光強度(CONC)滲透壓調節劑 DiSC14(5) DiOC14(3)三(羥甲基)-甲氨基丙磺酸(TAPS) 18 ND3-(環己氨基)-1-丙磺酸(CAPS) 40 NDN-(2-羥乙基)哌嗪-N′-3- 18 ND丙磺酸(EPPS)N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-羥基 20 ND丙磺酸(HEPPSO)3-〔N-N-雙(2-羥乙基)氨基〕 43＊＊＊ND-2-羥基丙磺酸(DIPSO)NaCl 6 1.7磷酸鹽緩衝鹽溶液 2.1 6.5Na2SO47.4 1.6Nal 1.1 0.14氯化膽鹼 11＊＊6.3碘化膽鹼 0.16 2.3＊在乙醇裡沉澱，沒有得到數據。
＊＊由不能形成沉澱的大晶體造成的假象。
＊＊＊在酒精裡沉澱(數據有問題)。
ND未測。
從表Ⅱ可以看出，花青染料在一般鹽存在時，比在除來蘇糖以外的糖、糖醇、胺基酸和Good氏緩衝劑TAPS、HEPPSO、DIPSO、CAPS和EPPS存在時溶解度小得多。此外，測定了DiSC14(5)溶液在下列物質中的穩定性糖類如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖、蔗糖和木糖，糖醇如甘油、肌醇、木糖醇和阿東糖醇，胺基酸如甘氨酸和精氨酸。花青染料在所檢測的溶液中至少可以穩定存在20分鐘，這足夠用來進行可重複的細胞標記。而且這些試劑中有許多都發現花青染料在其溶液中的量到60分鐘時還沒有明顯減少。
進一步，測定花青染料在一種含有一般鹽和可溶解染料的滲透性調節劑的介質中的溶解度。DiSC14(5)在等滲葡萄糖溶液中的溶解度不因用蒸餾水稀釋而受明顯影響。可是，DiSC14(5)在等滲的葡萄糖溶液中的溶解度卻因用僅約20%的等滲氯化鈉溶液稀釋而明顯降低。因此，使用花青染料進行的可重複的細胞標記，只能在含有少量一般鹽的介質中進行，這些鹽如氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，醋酸鈉，醋酸鉀，硫酸鈉，碘化鈉，氯化膽鹼或者碘化膽鹼;而且，最好在沒有用任何一般鹽來調節滲透壓的介質中進行標記。
為了確定標記對細胞生活力的影響，分析利用本發明方法用花青染料標記的細胞。V79細胞可從American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，並在Prescott，D.M.，Ann.New York ACad.Sci.，397101-109(1982)中描述;把V79細胞用含有濃度為10-5或4×10-5M的DiOC14(3)溶液進行標記，並比較被染色的細胞與未經染色的細胞以及染色細胞與未染色細胞的等量混合物的生長動力學。經過花青染料標記，細胞的倍增時間沒有受到影響，因此，標記對細胞生長沒有任何影響。臺盼藍排除法和Propidinm iodide排除法這樣幾種其它的細胞生活力常規檢測法也確證，按所描述的方法進行花青染料標記對細胞生活力沒有影響。
花青染料標記對細胞生活力的影響還可以通過測定紅細胞的脆性加以確定。標記的和未標記的紅血細胞懸浮在由於改變鹽濃度而具有可變滲透強度的氯化鈉介質中，細胞的體積分布用帶有一個通道附件的庫爾特(Coulter)計數儀來測量，測出平均體積並對每一鹽濃度作圖。氯化鈉濃度下降時，細胞體積增加，直到氯化鈉濃度大約為0.5g/100ml時，細胞體積出現一個急劇下降，在這一點上紅細胞裂解。而且不論細胞是否經過花青染料標記，細胞體積變化都是一樣的。
類似地，在平行樣品中把溶血作用作為氯化鈉濃度的函數來監測。紅細胞放入氯化鈉中大約2-3分鐘後，溶液離心沉澱所有未裂解的細胞。然後對上清液進行分光光度分析，測定血紅蛋白濃度。細胞裂解的百分比通過每個樣品的血紅蛋白濃度與全部裂解的對照樣品相比較來確定。直到氯化鈉濃度達到大約每100ml0.5g時，游離血紅蛋白濃度是相對較低的，此後，血紅蛋白迅速釋放。通過與紅細胞脆性實驗的結果進行比較，細胞體積變化與血紅蛋白釋放直接相關。此外，血紅蛋白的釋放在標記細胞和未標記細胞中是相同的。
為了檢驗按照本發明的方法用花青染料標記的細胞在活體內的穩定性，取兔紅細胞用DiSC14(5)標記並回輸。此後定期取血樣，並分析標記細胞的百分比和標記細胞螢光強度。循環的紅細胞數量作為時間的函數而呈線性減少，而且測得的標記細胞的52天的壽命與報導過的兔紅細胞40天到60天的平均壽命非常接近。因此，花青染料標記不影響紅血細胞的清除速率。
在所檢驗的5隻兔子中，除1隻以外，其餘所有兔子的染色細胞的螢光強度在標記並重新注射60天後基本保持不變。在第5隻動物中，只有不超過20%的花青染料在兔子體內循環60天以後從標記細胞中流出來。結合從組織培養得到的表明染料不會從標記細胞向未標記細胞轉移的資料，這些數據說明細胞被染料穩定標記。
根據本發明用花青染料標記的活細胞，用於許多要求能區分一個細胞群體中的多個亞群體的應用中。比如，要確定輸入紅血細胞後血細胞比容的減少是因為流血引起，還是由於對被輸入的細胞發生免疫反應引起，可在輸血以前，取一個等分的細胞試樣，按照本發明的方法進行標記，並且在輸血後立即測定循環中的被標記的紅細胞組分。此後，如發現血細胞比容下降，就把標記細胞組分與輸血剛結束時的標記細胞組分進行比較，並且算出標記細胞和未標記細胞血細胞比容減少的相對速率。標記細胞和未標記細胞血細胞比容減少量相同，表明由流血造成的失血;而標記細胞血細胞比容下降較多，則說明對輸入細胞產生免疫反應。用類似的方法，可以區分由於流血造成的輸入血小板後血小板計數的減少和對輸入血小板的免疫反應。
本發明的方法也用來測定培養的哺乳動物細胞的生長速率。被標記的培養細胞每分裂一次，花青染料就平均分布到兩個子細胞上。因此，使用流動血細胞計數技術來比較生長一定階段後的細胞的螢光強度和標記後立即測定的螢光強度，就可以確定細胞分裂的次數，因而可以測定細胞生長速率。
下面的實施例闡述本發明，但並非限制如上限定的及如下要求的本發明的範圍。
實施例1組織培養細胞的染色方法
Ⅰ、細胞的製備使用生長對數期的組織培養細胞以得到最佳結果。從培養容器中取出懸浮培養物並放入聚丙烯離心管。
使用單層培養時，必須除去上清液，用無鈣鎂離子的磷酸鹽緩衝液洗滌附著的細胞，從培養瓶中除去血清蛋白。加入胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco laboratories，Grand Island，New York，＃ 610-5300)，沒過瓶底，置室溫下培養，直到細胞單層鬆動並解聚。將得到的細胞懸浮物轉移到一個聚丙烯離心管中，加入等體積的含10%小牛血清(FBS)(Hazelton)的培養介質來阻止胰酶的酶作用。把細胞在室溫下以400×g離心10分鐘。吸出上清液，代之以等體積的等滲甘露醇來重新懸浮細胞沉澱物。這一步甘露醇洗滌是為了除去細胞懸浮液中的血漿蛋白並製備用於染色的細胞。把細胞再一次在室溫下以400×g離心10分鐘，吸出上清液，得到的細胞沉澱物以2×106細胞/ml的濃度重新懸浮在甘露醇溶液中以便染色。但有些細胞系對糖醇(甘露醇)的使用敏感，在這樣的情況下，可以使用等滲的葡萄糖溶液(MW 180.16，54.05g/l)。
Ⅱ、染料原液的配製在無水乙醇中配製2×10-3M原液如下DiO-C14(3) MW800(1.600mg/ml)DiS-C14(5) MW814(1.628mg/ml)DiO-C18(3) MW936(1.872mg/ml)DiI-C14(5) MW850(1.700mg/ml)所有染料都是從Molecular Probes，Eugene，Oregon得到的。
染料原液要用聲處理以保證染料完全溶解，並且使管壁上的吸附減到最少。原液配製使用聚苯乙烯管以可觀察到染料的溶解。但是，因為花青染料在水溶液環境裡，對聚丙烯的吸附比對聚苯乙烯的吸附要少得多，所以染色細胞用聚丙烯管。
Ⅲ、細胞染色在等滲的甘露醇溶液中把細胞濃度調整到2×106細胞/ml。為染色細胞，把2×10-3M的染料原液按照每1ml細胞懸浮液加入5ul染料加到染色溶液中。吹吸或者攪拌用於染色的樣品，使樣品完全混合。把細胞與染料一起保溫10分鐘，然後取出一小份樣品用於在螢光顯微鏡下檢查，以保證已產生強烈而均勻的染色。DiO染料系列使用對488微米激發光具有選擇性的顯微鏡濾波器，而DiS和DiI染料系列要求在575nm附近激發進行螢光觀察。
保溫期後，向染色細胞懸浮液中加入等體積的磷酸鹽緩衝液(PBS)。細胞在20℃以400×g離心10分鐘。吸出上清液，並把沉澱物重新懸浮在PBS中。重複離心過程，用得到的上清液觀察染料是否存在。如果染料在上清液中顯而易見，則重複洗滌直到用螢光分光度計測量時上清液裡沒有游離的染料為止。在最後一次洗滌後，除去上清液，把沉澱物按照所要求的濃度重新懸浮在合適的培養介質中。所有步驟均在無菌條件下進行。
實施例2紅血細胞染色Ⅰ、試劑配製A、檸檬酸鹽抗凝劑1.66g 檸檬酸鈉
0.206g 檸檬酸0.140g NaH2PO41.61g 葡萄糖列出的組分溶解在63ml蒸餾水中，並把溶液的PH調到5.6。配成的終溶液經過一個0.22微米的濾器滅菌。
B、等滲葡萄糖溶液葡萄糖(54.05g)溶解在1升蒸餾水中。用一個Fiske滲透壓計來檢查滲透壓，如果需要，將滲透壓調到320mOsm。
Ⅱ、染料原液的配製在無水乙醇中溶解1.628mg/ml染料製備2×10-3M的DiIC14(5)原液。為了完全溶解染料可能要求聲處理。
Ⅲ、染色過程用含有檸檬酸鈉的抽血管或者一支含有其總容積1/10量的所配製的檸檬酸鹽抗凝劑的注射器，無菌收集全血。保存一小份樣品用於流動血細胞計數或功能檢測。血液在室溫下以100×g離心10分鐘以使紅細胞沉澱。把含有血小板的血漿移走並保存起來，而用與壓緊的紅細胞沉澱的5倍體積相等量的等滲葡萄糖液洗滌紅細胞。細胞應在室溫下以100×g再次離心10分鐘，吸出上清液。這種洗滌能除去血漿蛋白並能得到更強、更均勻的染色，重複洗滌一次以上。最後一次離心並吸出上清液後，把紅細胞按照4×108細胞/ml的濃度重新懸浮在等滲葡萄糖中。
加入染料以前，吹吸或攪拌樣品以保證沒有沉降出現。每1毫升的紅細胞懸浮液加入15微升DiSC14(5)(在乙醇中濃度2mM)原液，立即混勻樣品，保證染料在溶液裡迅速而均勻地散布。大約5分鐘後，取出一小份樣品進行顯微鏡觀察。用蠟筆在顯微鏡的載玻片上畫一個圈，將染色液中的少量細胞樣品放到蠟圈內，在載玻片上放一張蓋玻片並觀察樣品。畫蠟圈是為了減少由載玻片和蓋片造成的盤狀細胞一棘細胞的變形。使用塑料載片和蓋片也能防止這類變形。這種方法能在保證產生強烈而均勻的染色的同時，保證在整個染色過程中紅細胞結構保持不變。5分鐘後細胞應被均勻染色，不需要長於10分鐘的接觸時間。
在確定細胞已被均勻染色以後，向染色懸浮液中加入等體積的磷酸鹽緩衝液，細胞在室溫下以400×g離心10分鐘，除去上清液。離心後通常可在上清液中看到有游離的染料殘跡存在，因此必須用含有鈣鎂的磷酸鹽緩衝液進行反覆洗滌，直到用螢光分光光度計檢測時在上清液裡沒有游離的染料存在。
到這一步，細胞可以懸浮在合適的溶液中用於實驗，也可懸浮在不含血小板的血漿中，用於重新注射到受體動物中。重新注射使用的一般方法是，把染色的紅細胞重新懸浮在從所收集的全血第一次離心後回收的血漿中和已在400×g下離心除去了血小板的血漿中。所有步驟均使用無菌技術進行。
實施例3血小板染色Ⅰ、細胞的準備收集全血，使用含有檸檬酸鈉的抽血管，或者使用含有其總容積1/10量的所配製的檸檬酸鈉抗凝劑的注射器。將細胞在室溫下以100×g離心10分鐘，得到富含血小板的血漿。涉及到血小板的所有步驟都使用塑料吸管和聚丙烯離心管以防止血小板激活。
將富含血小板的血漿吸出並轉移到另一支離心管中。接著經過在20℃以100×g離心10分鐘把血小板從血漿中沉澱出來。然後把血漿收集並保存起來，或者用於功能檢測，或者用作重新注射用的懸浮介質。在用作重新懸浮介質前，這種血漿應該以4000×g離心10分鐘，以保證除去任何殘留的血小板，把這樣的血漿稱作無血小板血漿(PPP)。
由1000×g離心得到的血小板沉澱物應小心地重新懸浮在少量體積的檸檬酸鹽抗凝劑中，以得到濃縮的均勻懸浮液。這一步操作完成之後，就可以把等滲葡萄糖作為稀釋劑按照與最初的血漿相等的量加入。然後將血小板以300×g離心5分鐘，吸去上清液。這步葡萄糖洗滌能除去殘留的血漿蛋白，並使染色均勻而更強烈。血小板沉澱物重新懸浮在葡萄糖溶液中，現在準備染色。
把血小板濃度調到4×108個細胞/ml，每ml血小板懸浮液加入15微升DiOC14(3)原液(在無水乙醇中濃度為2mM)，立即將懸浮液小心地徹底地混勻，以保證染料的均勻分布。用螢光顯微鏡觀察血小板，保證出現均勻的染色，如果是這樣的話，現在就準備把懸浮液中的血小板與游離染料分離開來。
Ⅱ、用於分離標記血小板的Sephadex G-100層析柱的使用人們習慣用Sepharose 2B從富含血小板的血漿中分離血小板。我們已經發現Sephadex G-100也能很好地進行血小板分離。這個技術與染色技術一起運用並按下述方式進行。把血小板-染料懸浮液上柱，小分子量的染料分子截留在凝膠顆粒中，而大的血小板直接穿過層析柱。Sephadex G-100可以這種方式用於分離螢光標記的血小板和懸浮液中的游離染料。
A、層析柱的準備G-100(Pharmacia Laboratories，Piscataway，New Jersey)按廠商的指導進行水化，並在丙酮(100%)中洗滌，為用作血小板分離介質做準備。洗滌過程通過在室溫下以300×g離心Sephadex 10分鐘來進行，除去上清液，把沉澱重新懸浮在Hanks平衡鹽溶液中。應該用Hanks平衡鹽溶液反覆洗滌，直到再也檢測不到丙酮的氣味為止。將得到的溶液插入到一個真空沸水浴中進行除氣。
這時，用Sephadex漿灌柱，用一個沒有抽塞的10CC注射器作為層析柱的支持物。把矽酮管連接到注射器針頭插孔上，用一個可調的小管夾來調節經過層析柱的液體流速。用47微米的尼龍篩網在注射器底部作為支持膜，以擋住顆粒。應避免使用帶有燒結玻璃濾膜支持物的常規玻璃層析柱，因為這些柱可能激活血小板。將層析柱注滿Hanks液，並把少量Sephadex漿加到柱子裡。管夾充分打開，使液流緩慢而連續。這一操作能平穩而均勻地壓緊Sephadex，防止形成孔道或空氣間隙。重複進行加HBSS和Sephadex漿的操作，直到獲得所需體積的壓緊的柱子。層析柱使用前要用HBSS(2倍外水體積)徹底衝洗。
B、血小板的分離把血小板染料和懸浮液小心地鋪到Sephadex上。柱子底部的管夾應該打開，並應使液體在層析柱中的液面下降到剛好抵達Sephadex流體的頂部。繼續流動，使懸浮液穿過Sephadex。當液面達到Sephadex頂部時再停止液體流動。小心地向層析柱頂部加入足夠量的HBSS，形成一個緩衝帶，這樣可以很容易再追加HBSS，而不會影響到Sephadex。重新開始層析柱液體的流動。用這個辦法能使血小板懸浮液在凝膠中形成一個緻密的帶，並且能以一個相當均勻的速率流過整個柱長。用這個方法可以得到一個較濃縮的血小板洗脫液。繼續經過層析柱的液體流動，收集0.5-1.0ml的各組分。含有血小板的組分可由其混濁度看出，可把這些組分合併到一起，然後把合在一起的組分以300×g離心10分鐘。吸出上清液，可以把沉澱物重新懸浮在合適的介質中用於實驗或分析，或者重新懸浮在不含血小板的血漿中用於功能測定或重新注射。
本發明較好的實施例闡述如上，但本發明不限於此處公開的說明，而且保留在下面的權利要求
書範圍之內的所有改動的權利。
權利要求
1.一種用花青染料標記活細胞的方法，包括在含有一種滲透壓調節劑的介質中使細胞與花青染料接觸，這種滲透壓調節劑對細胞的生活力不造成明顯影響而且能提供可重複的細胞標記。
2.根據權利要求
1的方法，其中的滲透壓調節劑是一種糖，一種糖醇，一種胺基酸，或者一種Good氏緩衝液或其組合。
3.根據權利要求
2的方法，其中的介質是等滲的。
4.根據權利要求
3的方法，其中的細胞是紅血細胞。
5.根據權利要求
3的方法，其中的細胞是白血細胞。
6.根據權利要求
3的方法，其中的細胞是血小板。
7.根據權利要求
3的方法，其中的滲透壓調節劑是一種糖。
8.根據權利要求
7的方法，其中的糖是葡萄糖。
9.根據權利要求
3的方法，其中的滲透壓調節劑是一種糖醇。
10.根據權利要求
9的方法，其中的糖醇是甘露醇。
11.根據權利要求
3的方法，其中的滲透壓調節劑是一種胺基酸。
12.根據權利要求
11的方法，其中的胺基酸是甘氨酸。
13.根據權利要求
3的方法，其中的滲透壓調節劑是一種Good氏緩衝劑。
14.根據權利要求
13的方法，其中的Good氏緩衝劑是HEPPSO。
15.根據權利要求
13的方法，其中的Good氏緩衝劑是EPPS。
16.根據權利要求
13的方法，其中的Good氏緩衝劑是TAPS。
17.根據權利要求
13的方法，其中的Good氏緩衝劑是CAPS。
18.根據權利要求
13的方法，其中的Good氏緩衝劑是DIPSO。
19.根據權利要求
3的方法，其中的花青染料是DiSC14(5)。
20.根據權利要求
3的方法，其中的花青染料是DiOC14(3)。
21.一種物質成份，包括溶解於一種滲透壓調節劑的花青染料，該滲透壓調節劑對細胞生活力沒有明顯影響。
22.根據權利要求
21的一種物質成分，其中的滲透壓調節劑是一種糖，一種糖醇，一種胺基酸，或者一種Good氏緩衝劑或它們的一種組合。
23.根據權利要求
22的一種物質成份，其中的糖是葡萄糖。
24.根據權利要求
22的一種物質成份，其中的糖醇是甘露醇。
25.根據權利要求
22的一種物質成份，其中的胺基酸是甘氨酸。
26.根據權利要求
22的一種物質成份，其中的Good氏緩衝劑是HEPPSO，EPPS，TAPS，CAPS或DIPSO。
27.根據權利要求
22的一種物質成份，其中的花青染料是DISC14(5)或DIOC14(3)。
28.根據權利要求
3的方法，其中的細胞是一種組織培養細胞。
專利摘要
用對細胞生活力沒有明顯影響的花青染料進行可重複的活細胞標記的方法。標記細胞的應用包括利用標記的紅血細胞區別輸血後出血和免疫反應，以及用稀釋法測定培養細胞的生長率。
文檔編號G01N33/50GK87107216SQ87107216
公開日1988年5月11日 申請日期1987年10月30日
發明者保羅·卡爾·霍蘭, 布魯·戴維·詹森, 休·埃倫·斯萊扎克 申請人:史密絲克萊恩貝克曼公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan