一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法
2023-06-06 20:55:36 2
專利名稱：一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法
技術領域：
本發明屬於生物冶金技術領域，特別涉及一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法。
背景技術：
目前，細菌胞外聚合層提取方法有物理提取法和化學提取法兩類。物理提取法主要是利 用各種外力來增強細菌胞外聚合層中各成分在溶液中的溶解度，常用的有超聲波法、離心法、 熱處理提取法等。但是由於細菌胞外聚合層與細胞壁結合得很緊密，因而物理提取法的提取 含量很低。化學提取法主要是利用試劑使細菌胞外聚合層的大分子成為水溶性成分而被提取 出來，常用的有NaOH提取法、戊二醛提取法、陽離子交換樹脂法、H2S04提取法等。但其 中NaOH提取法和戊二醛提取法雖可以提高產率，卻會造成較多細胞死亡，使胞內物質'外流 導致提取物有雜質；陽離子交換樹脂法費用較高；而H2S04提取法提取含量較低。此外，上 述方法對氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌的胞外聚合層的提取效果也不明 顯。
發明內容
針對以上技術問題，本發明提供一種提取細胞外聚合層中多糖的方法。
本發明包括以下步驟
1、 細菌培養在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按
菌種液體積佔菌種液和培養基總體積的5~20%，採用硫酸調節pH值為1.0 3.0，在控溫30~60 'C和轉速100 240卬m的條件下，培養l 24h，至菌液電位為400 700 mV時，獲得培養菌k。
2、 提取方法將培養菌液置於離心管中，在轉數為1500~12500rpm的條件下離心 5 30min，收集沉澱，在沉澱中加入重量濃度為1~20%的EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)溶液， 加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培養菌液EDTA-1 : 0.2 5，搖勻後在轉數為 1500~12500rpm的條件下離心5 30min;獲得的上清液用孔徑為0.01~10.00pm的微孔濾膜過 濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
提取的多糖的含量測定採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定。取多糖粗提液 0.25~2.00mL，先加入濃度為98wt。/o的濃硫酸5.0mL，再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻後 1 2min顯色穩定，測得在波長488 492nm處有最大吸收峰，說明提取物是多糖類物質，並可 根據測得的吸光值計算多糖含量。
本發明中的細菌為氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌其中的一種或者幾 種的混合菌，當為混合菌時混合比例為任意比例。本發明中採用的培養基為Leathen、 9K、 Wakesman、 ONM或Clomer培養基中任意一種 均可。
本發明中步驟(1)獲得的培養菌液為細菌生長進入對數期後的培養菌液。 本發明的提取方法選用物理與化學相結合的提取方式，由離心分離、提取劑浸提和微孔
濾膜過濾協同作用，排除了培養基、緩衝液和菌體的幹擾；提取出的多糖可用於細菌胞外聚
合層糖類成分的鑑定、細菌浸礦過程中代謝物的測定和細菌浸礦機理的研究等。本發明提取
方法具有使用試劑簡單、操作簡便、流程簡易等特點。
圖1是本發明的細菌胞外聚合層中多糖的提取流程圖。
具體實施例方式
本發明實'施例中採用的細菌為氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌的混合 菌，可購於國家菌種保藏中心。
本發明實施例中採用Leathen、 9K、 Wakesman、 ONM或Clomer培養基中的一種。 本發明實施例中採用的恆溫振蕩培養箱為HZQ-QX型。 本發明實施例中採用的微孔濾膜為市購水溶性微孔濾膜。
本發明實施例中採用的苯酚、濃硫酸和EDTA為分析純試劑，分別與去離子水配製成溶液。
本發明實施例中採用的離心機為臺式高速TG16-WS型。 本發明實施例中測量pH值和電位的設備為PHS-2F型。 本發明實'施例中採用的紫外可見分光光度計為TU-1901型。 本發明實施例中調節pH值的硫酸為硫酸與同體積水混合製備成的硫酸溶液。 實施例1
在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌 種液和培養基總體積的10%，採用體積比為l : l的硫酸溶液調節pH值為1.0-3.0，在控溫44'C 和轉速l卯rpm的條件下，培養18h，至菌液電位為600mV時，獲得培養菌液。
將培養菌液置於離心管中，在轉數為12500rpm的條件下常溫離心10min，收集沉澱， 在沉澱中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培 養菌液EDTA=1 : 0.2，搖勻後在轉數為12500rpm的條件下常溫離心15min;獲得的上清液 用孔徑為0.45;im的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5。/o苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min後顯色穩定，測得在波 長488 492nm處有最大吸收峰，根據測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.194 mg/mL。 實施例2
在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌 種液和培養基總體積的10%，採用體積比為l : l的硫酸溶液調節pH值為1.0 3.0,在控溫44'C 和轉速190rpm的條件下，培養18h;然後加入濃度為3N的三價砷離子溶液，加入量按三價砷 離子溶液體積佔菌液體積的0.125%，繼續培養24h，至菌液電位為680mV時，獲得培養菌液。
將培養菌液置於離心管中，在轉數為12500rpm的條件下常溫離心10tnin，收集沉澱， 在沉澱中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培 養菌液EDTA=1 : 0.5，搖勻後在轉數為12500ipm的條件下常溫離心15min;獲得的上清液 用孔徑為0.45nm的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度 為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5n/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min後顯色穩定，測得在波 長488 492nra處有最大吸收峰，根據測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.182 mg/mL。 實施例3
在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌 種液和培養基總體積的20%，採用體積比為l : l的硫酸溶液調節pH值為1.0 3.0，在控溫44'C 和轉速190rpm的條件下，培養12h;然後加入濃度為3N的三價砷離子溶液，加入量按三價砷 離子溶液體積佔菌液體積的0.25%，繼續培養24h，至菌液電位為650mV時，獲得培養菌液。
將培養菌液置於離心管中，在轉數為12500rpm的條件下常溫離心5min，收集沉澱，在 沉澱中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培養 菌液EDTA=1 : 1，搖勻後在轉數為12500rpm的條件下常溫離心15min;獲得的上清液用孔 徑為0.45pm的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度 為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min後顯色穩定，測得在波 長488 492nm處有最大吸收峰，根據測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.192mg/mL。 實施例4在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌 種液和培養基總體積的5%，採用體積比為l : l的硫酸溶液調節pH值為1.0 3.0，在控溫44。C 和轉速170rpm的條件下，培養24h;然後加入濃度為3N的三價砷離子溶液，加入量按三價砷 離子溶液體積佔菌液體積的0.375%，繼續培養24h，至菌液電位為630mV時，獲得培養菌液。
將培養菌液置於離心管中，在轉數為10000rpm的條件下常溫離心15min，收集沉澱， 在沉澱中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培 養菌液EDTA=1 : 2,搖勻後在轉數為10000rpm的條件下常溫離心20min;獲得的上清液用 孔徑為0.45pm的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度 為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min後顯色穩定，測得在波 長488 492nm處有最大吸收峰，根據測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.161 mg/mL。 實施例5
在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌 種液和培養基總體積的5%，採用體積比為l : l的硫酸溶液調節pH值為1.0 3.0，在控溫30'C 和轉速100卬m的條件下，培養24h，至菌液電位為400mV時，.獲得培養菌液。
將培養菌液置於離心管中，在轉數為1500rpm的條件下常溫離心30min，收集沉澱，在 沉澱中加入重量濃度為20%的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培養 菌液EDTA=1 : 4，搖勻後在轉數為12500rpm的條件下常溫離心5min;獲得的上清液用孔 徑為10.00nm的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。'
採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液0.25mL，先加入濃 度為98wtW的濃硫酸5.0mL，再加入5n/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min後顯色穩定，測得在 波長488 492nm處有最大吸收峰，根據測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含 量為0.096 mg/mL。 實施例6
在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌 種液和培養基總體積的20%，採用體積比為l : l的硫酸溶液調節pH值為1.0 3.0，在控溫6(TC 和轉速240rpm的條件下，培養2h，至菌液電位為500 mV時，獲得培養菌液。
將培養菌液置於離心管中，在轉數為12500rpm的條件下常溫離心5min，收集沉澱'，在 沉澱中加入重量濃度為1%的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培養菌液EDTA-1 : 5，搖勻後在轉數為1500rpm的條件下常溫離心30min;獲得的上清液用孔 徑為O.Olpm的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
採用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液2.00mL，先加入濃 度為98wtn/。的濃硫酸5.0mL,再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min後顯色穩定，測得在 波長488 492nm處有最大吸收峰，根據測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含 量為0.113 mg/mL。
權利要求
1、一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特徵在於按以下步驟進行(1)在恆溫振蕩培養箱中，將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，接種量按菌種液體積佔菌種液和培養基總體積的5～20％，調節pH值為1.0～3.0，在控溫30～60℃和轉速100～240rpm的條件下，培養1～24h，至菌液電位為400～700mV時，獲得培養菌液；(2)將培養菌液置於離心管中，在轉數為1500～12500rpm的條件下離心5～30min，收集沉澱，在沉澱中加入重量濃度為1～20％的EDTA溶液，加入量按培養菌液與EDTA溶液的體積比為培養菌液∶EDTA＝1∶0.2～5，搖勻後在轉數為1500～12500rpm的條件下離心5～30min；獲得的上清液用孔徑為0.01～10.00μm的微孔濾膜過濾，過濾後獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
2、 根據權利要求1所述的一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特徵在於所述的 細菌為氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌其中的一種或者幾種的混合菌，當 為混合菌時混合比例為任意比例。
3、 根據權利要求1所述的一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特徵在於所述的 培養基為Leathen、 9K、 Wakesman、 ONM或Clomer培養基中的一種。
4、 根據權利要求l所述的一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特徵在於調節pH 值時採用硫酸。
全文摘要
一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，屬於生物冶金技術領域，該方法按以下步驟進行(1)將細菌接種到培養基中並用搖瓶培養，調節pH值，加熱振蕩培養1～24h，菌液電位為400～700mV時，獲得培養菌液；(2)將培養菌液離心5～30min，收集沉澱，加入EDTA溶液，離心5～30min；獲得的上清液用微孔濾膜過濾，獲得細菌胞外聚合層中多糖粗提液。本發明的方法排除了培養基、緩衝液和菌體的幹擾；具有使用試劑簡單、操作簡便、流程簡易等特點。
文檔編號C12P19/00GK101481716SQ200910010238
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月21日 優先權日2009年1月21日
發明者瑤 富, 楊洪英 申請人:東北大學