一種膀胱癌檢測試紙的製作方法

2023-06-06 20:41:41 2

專利名稱：一種膀胱癌檢測試紙的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，特別是涉及一種膀胱癌的檢測試紙。
技術背景膀胱移行細胞癌(Bladdertransitional cell carcinoma, BTCC)是我國最 常見惡性腫瘤之一，為男性的第5位，女性的第6 7位。及早地發現、診斷 膀胱癌對治療和預後有重要的影響。目前膀胱癌診斷主要依賴於膀胱鏡，但 膀胱鏡檢査是一種侵入性操作，診療過程複雜、費時費力，費用較高，且病 人痛苦難以耐受，很多病人因為畏懼膀胱鏡檢查而失去了及時診斷、治療的 機會。為此，找到一種簡便、無創，價格低廉且高效的診斷方法迫在眉睫。尿纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)是一種廣為研究的新的膀胱癌腫瘤標 記物。研究表明尿液FN作為浸潤性BTCC的診斷指標，診斷的靈敏度為 76.47% 100%，特異度為87.22%,診斷正確率為86.96%。目前，尿FN 的臨床檢測主要採用ELISA方法檢測，尚存在以下問題1、採用的ELISA 試劑盒為不同廠家生產，缺乏標準化。2、步驟比較繁瑣，結果易受操作者技 術水平等的影響，不確定性因素較多。3、 ELISA方法需要操作者具備一定的 分子生物學技能，不易在基層醫院開展。4、曰ISA方法檢測不但要求操作者 具有一定的操作技能還必需酶標儀，因此病人無法在家中對自己的病情進行膠體納米金免疫層析方法(Gold immunochromatography assay,GICA)是20世紀90年代興起的一種將膠體金免疫技術和色譜層析技術相結合的固相膜免疫分析方法。其原理是將特異的抗原或抗體先固定於硝酸纖維膜的某 一區帶，該乾燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品(如尿液、血液、唾液等)後，由 於毛細管作用，樣品便會帶著膠金墊上的金標抗體或抗原沿著硝酸纖維膜向 前移動，當移動至固定有抗原或抗體的區域時，體系中發生抗原與抗體特異 性結合反應，這一反應使膠體金在這一帶聚集而顯示出紫紅色，從而實現特 異性的免疫診斷。由這一技術開發出的膠體金檢測試紙已廣泛應用於臨床診斷及藥物檢測，其種類包括早孕類檢測試紙(檢測HCG、 LH、 FSH等)、 傳染病檢測試紙(檢測HIV、 HCV、 HBV、 HBsAg等)、毒品、藥物殘留檢測 試紙(檢測嗎啡、古柯鹼、鴉片、大麻、搖頭丸、瘦肉精等)等。發明內容所要解決的技術問題本發明所要解決的技術問題是提供一種膀胱癌的檢測試紙，以克服現有 的膀胱癌檢測中診療過程複雜、費時費力、費用較高，且病情難以自我監測 等缺陷。技術方案本發明的技術方案之一是提供一種膀胱癌檢測試紙，由樣品墊、膠金墊、 硝酸纖維膜、吸水紙和底板組成，在所述的硝酸纖維膜上有尿纖維連接蛋白 一牛血清蛋白偶聯物的檢測區和抗鼠二抗的對照區，在所述的膠金墊上有金 標抗尿纖維連接蛋白抗體，其中，所述的金標抗尿纖維連接蛋白抗體為粒徑5 一40nm的膠體。上述的膀胱癌檢測試紙的優選方案之一為，所述的金標抗尿纖維連接蛋白抗體是以如下方法製備的將100mL 0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸，在 劇烈攪拌下迅速加入0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態反應5-30min 後關閉熱源即得膠體金溶液，混合抗尿纖維連接蛋白抗體與膠體金溶液並使 其結合，得到穩定的金標抗體。上述的膀胱癌檢測試紙的優選方案之二為，所述的膠金墊由玻璃纖維和 固定其上的金標抗體組成。上述的膀胱癌檢測試紙的優選方案之三為，所述的樣品墊為吸水性玻璃 纖維層。上述的膀胱癌檢測試紙的優選方案之四為，所述試紙上具有至少一條質 控線，其顯色表示試紙有效。本發明的技術方案之二是提供一種膀胱癌檢測試紙的製備方法，依次包 括如下步驟1) 將100mL 0.01 %的HAuCI4溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入 0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態反應5-30min後關閉熱源即 得膠體金溶液；2) 混合抗尿纖維連接蛋白抗體與膠體金溶液並使其結合，得到穩定的金 標抗體；3) 將金標抗體固定在玻璃纖維上，製成膠金墊；4) 將樣品墊、聚酯膜、膠金墊、硝酸纖維層和吸水紙，依次重疊相連粘 貼在底板上，組裝成檢測試紙。本發明的技術方案之三是提供一種上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應 用，即將液體樣品滴於所述的試紙樣品墊一側，通過抗原與抗體特異性結合 反應，使膠體金聚集而顯色，從而實現結果判斷。'上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用的優選方案之一為，所述試紙的檢測限低於200ug/L尿纖維連接蛋白。上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用的優選方案之二為，所述試紙上 具有至少一條質控線，其顯色表示試紙有效。上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用的優選方案之三為，所述液體樣 品為尿液。本發明可以通過如下方式實現，也可以使用同樣效果的類似方式 所述的試紙由吸尿玻璃纖維層(樣品墊)、聚酯膜層、固定有金標抗體的 玻璃纖維層(膠金墊)、硝酸纖維膜層(NC膜)和吸水紙層，按從左到右的順序 依次重疊相連粘貼在底板上組裝而成(如圖1所示)。金標抗體為膠體金顆粒與抗FN抗體結合的複合物；硝酸纖維膜上標記有T線(測試線)和C線(質 控線)，T線為FN—BSA偶聯物，C線為包被的抗鼠的二抗。待病人的尿樣 滴加後，若T線顯色，C線也顯色，得到的結果為陰性，表明病人無患有膀 胱癌的可能。若T線不顯色，C線顯色，得到的結果為陽性，表明病人可能 患有膀胱癌。若質控線(C線)不顯色，表示試紙失效(如圖2所示)。有益效果本發明採用膠體金免疫層析技術設計、開發一種用於檢測病人尿樣中FN 含量的試紙，為膀胱癌的臨床診斷提供可靠的依據。膠體金免疫層析檢測法不僅具有快速、靈敏度高、特異性強、穩定性好、操作簡便、無需任何儀器 設備，而且結果判斷直觀可靠、容易被基層單位人員掌握，同時也方便病人 對病情的自我監測。本發明在膀胱癌的檢測中採用膠體金免疫層析技術，只需要病人的幾滴尿液，就可檢驗出病人的FN的含量是否超標，為膀胱癌的診 斷提供可靠的依據，有望成為診斷膀胱癌的新方法。


圖1為膀胱癌檢測試紙結構示意圖 圖2為膀胱癌檢測試紙檢測示意圖 圖3為膠體金的TEM圖具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於 說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授 的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形 式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。下列實施例中未注朋具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分 子標記操作手冊或臨床檢測操作手冊，或按照製造廠商所建議的條件。實施例11、採用經典的Frens法製備粒徑為5—40nm的膠體金溶液:將100mL0.01 %的HAuCl4溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態反應5-30min後關閉熱源，即得亮紅色透明膠體。2、 選擇適當的pH值(6—10)，使抗體與膠體金牢固地結合，製備得到穩定 的金標抗體。3、 將金標抗體噴點在玻璃纖維上，製備出膠金墊。然後在硝酸纖維膜(NC 膜)的一側噴點FN—BSA偶聯物和抗鼠的二抗，分別作為T線和C線。4、 將樣品墊(長度為35mm)、膠金墊(長度為10mm)、 NC膜(長度為 25mm)和吸水紙(長度為20mm)按照從左到右的順序組裝在底板上， 並用切刀切割成寬為4mm的試紙條。試紙檢測方法1、 取50ul的待測樣本加在試紙條的加樣區；2、 在10min後記觀察記錄檢測結果。20min後觀察的結果無效。 檢測結果的判斷1、 陽性結果僅在試紙條的質控線上出現一條紫紅色條帶。2、 陰性結果在試紙條的測試線和質控線位置上各出現一條紫紅色條帶。3、 無效結果在試紙條的質控線上未出現紫紅色條帶。
權利要求
1.一種膀胱癌檢測試紙，由樣品墊、膠金墊、硝酸纖維膜、吸水紙和底板組成，在所述的硝酸纖維膜上有尿纖維連接蛋白-牛血清蛋白偶聯物的檢測區和抗鼠二抗的對照區，在所述的膠金墊上有金標抗尿纖維連接蛋白抗體，其中，所述的金標抗尿纖維連接蛋白抗體為粒徑5-40nm的膠體。
2. 根據權利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特徵在於，所述的金標抗尿纖 維連接蛋白抗體是以如下方法製備的將100mL0.01X的HAuCl4溶液加 熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態 反應5-30min後關閉熱源即得膠體金溶液，混合抗尿纖維連接蛋白抗體與 膠體金溶液並使其結合，得到穩定的金標抗體。
3. 根據權利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特徵在於，所述的膠金墊由玻 璃纖維和固定其上的金標抗體組成。
4. 根據權利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特徵在於，所述的樣品墊為吸 水性玻璃纖維層。
5. 根據權利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特徵在於，所述試紙上具有至 少一條質控線，其顯色表示試紙有效。
6. —種膀胱癌檢測試紙的製備方法，依次包括如下步驟1) 將100mL 0.01 %的HAuCI4溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入 0.5-5mL的擰檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態反應5-30min後關閉熱源即 得膠體金溶液；2) 混合抗尿纖維連接蛋白抗體與膠體金溶液並使其結合，得到穩定的金 標抗體；3) 將金標抗體固定在玻璃纖維上，製成膠金墊；4) 將樣品墊、聚酯膜、膠金墊、硝酸纖維層和吸水紙，依次重疊相連粘 貼在底板上，組裝成檢測試紙。
7. 權利要求1所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用，即將液體樣品滴於所 述的試紙樣品墊一側，通過抗原與抗體特異性結合反應，使膠體金聚集而 顯色，從而實現結果判斷。
8. 根據權利要求7所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用，其特徵在於，所 述試紙的檢測限低於200ug/L尿纖維連接蛋白。
9. 根據權利要求7所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用，其特徵在於，所 述試紙上具有至少一條質控線，其顯色表示試紙有效。
10. 根據權利要求7所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應用，其特徵在於，所述液體樣品為尿液o
全文摘要
本發明涉及一種膀胱癌檢測試紙，由樣品墊、膠金墊、硝酸纖維膜、吸水紙和底板組成，在所述的硝酸纖維膜上有尿纖維連接蛋白—牛血清蛋白偶聯物的檢測區和抗鼠二抗的對照區，在所述的膠金墊上有金標抗尿纖維連接蛋白抗體，其中，所述的金標抗尿纖維連接蛋白抗體為粒徑5-40nm的膠體。具有快速、靈敏度高、特異性強、穩定性好、操作簡便、無需任何儀器設備的特點，結果判斷直觀可靠、易於掌握，適用於對膀胱癌疾病的診斷及病情的自我監測。
文檔編號G01N33/574GK101221179SQ20071017313
公開日2008年7月16日 申請日期2007年12月26日 優先權日2007年12月26日
發明者周海清, 沈周俊, 沈鶴柏 申請人:上海柏匯申生物科技有限公司