結核分枝桿菌的抗原蛋白的製作方法

2023-06-06 21:30:56 3

專利名稱：結核分枝桿菌的抗原蛋白的製作方法
結核分枝桿菌的抗原蛋白技術領域
本發明是申請號為201010231572. 2的分案申請。
本發明屬於基因工程技術領域，也涉及到傳染病分子診斷技術領域，具體涉及3 種結核分枝桿菌抗原蛋白及在製備結核病診斷檢測試劑盒中的應用。
背景技術：
動物細菌性傳染病對人類健康的威脅日益嚴重，給國民經濟和社會穩定造成衝擊和影響。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,結核病的主要致病菌)是一種嚴重危害人類健康的病原菌，全世界有三分之一人口攜帶處於潛伏狀態的結核分枝桿菌，每年大約有兩百萬人死於結核病(Raviglione M C. TheTB epidemic from 1992 to 2002. Tuberculosis (Edinb), 2003, 83:4-14. )0近年來，結核分枝桿菌合併人類免疫缺陷病毒 (HIV)感染及多重耐藥結核菌株的出現，對人類公共衛生事業的威脅更加嚴峻。因此，開發結核病及耐藥結核病的簡單、快速、敏感的診斷技術，成為當前控制結核病的重要策略和手段。
到目前為止，臨床上結核病的診斷標準主要是在顯微鏡下直接觀察結核分枝桿菌的痰塗片法。但是，痰標本細菌學檢查的靈敏度非常低，臨床上主要還根據臨床症狀和影像學資料來綜合診斷結核病。而另一個診斷標準結核桿菌培養作為結核病診斷的「金標準」， 需要耗費大量的時間，同時還需要有高水平的技術人員操作，限制了其在臨床結核病診斷中的應用。
研究人員利用各種新興的分子生物學以及現代免疫學理論和技術，已經開發出一些有希望的檢測方法，比如快速分枝桿菌全自動培養和檢測、噬菌體生物擴增法和噬菌體生物發光法、利用DNA或者RNA的擴增技術、利用新型免疫學方法等。但是，這些技術均需要高成本以及高技術水平的操作人員，限制了它們在低收入國家的推廣的和應用，而這些國家的結核病感染率往往都比較高。
鑑於此，本發明申請人根據前期從結核分枝桿菌基因組序列中篩選得到的三個抗原蛋白編碼基因，將其在大腸桿菌中克隆表達純化，並進一步應用於結核病的體外分子診斷。本發明建立了一種快速、低成本、易於操作的基於ELISA技術的結核病診斷方法，該方法與在中國市場上應用較為廣泛使用的兩種同類試劑盒TB-DOT(上海奧普生物醫藥有限公司)和ΤΒ-check-l (法國VEDA LAB公司)相比，敏感性和特異性都得到了顯著提高。發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，通過分子生物學技術和方法，製備三種適用於診斷檢測結核病的新型結核分枝桿菌抗原蛋白，將所述的三種新型抗原蛋白應用於結核病的ELISA診斷檢測。
本發明是這樣實現的
申請人前期從結核分枝桿菌基因組序列中篩選得到三個基因片段，它們能夠強烈CN 102977197 A書
明
說2/16 頁的與結核病人的血清發生反應。它們的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO :1，3，5所示，它 們編碼的胺基酸序列分別如序列表SEQ ID NO :2，4，6所示。其中從Rvl987基因(NCBI登錄 號NP_216503. 1，GenelD:885815，基因注釋為可能的幾丁質酶)中篩選得到如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，序列長度為0. 429kb，從Rv3807c基因(NCBI登錄號NP_218324. 1， GeneID:886134，基因注釋為可能的保守的跨膜蛋白)中篩選得到如序列表SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，序列長度為0. 498kb,從Rv3887c基因(NCBI登錄號NP_218404. 1， GeneID:886211，基因注釋為可能的保守的跨膜蛋白)中篩選得到如序列表SEQ ID NO 1所 示的核苷酸序列，序列長度為1. 53kb。申請人通過基因克隆方法，獲得含有這三個抗原蛋白 的重組大腸桿菌。然後，在大腸桿菌中表達純化這三個結核分枝桿菌抗原蛋白。最後，利用 獲得的抗原蛋白進行結核病的檢測，並與市售的結核病診斷試劑盒的檢測結果進行比較。生物學試驗表明，本發明克隆的上述三個基因編碼的抗原蛋白可以作為特異性抗 原蛋白應用於結核病的檢測。在本發明的實施例中，申請人提供了三種結核分枝桿菌抗原蛋白的詳細製備方 法，並描述了這三個抗原蛋白在結核病診斷中的應用前景。本發明的優點是，操作成本低，並能夠快速、便捷、準確的檢測結核病。本發明更詳細的技術方案參見《具體實施方式
》。


序列表SEQ ID NO 1是本發明克隆的Rvl987基因片段的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是本發明克隆的Rvl987基因片段編碼的蛋白質的胺基酸序 列。序列表SEQ ID NO 3是本發明克隆的Rv3807c基因片段的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0:4是本發明克隆的Rv3807c基因片段編碼的蛋白質的胺基酸序 列。序列表SEQ ID NO 5是本發明克隆的Rv3887c基因片段的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0:6是本發明克隆的Rv3887c基因片段編碼的蛋白質的胺基酸序列。圖1 :本發明的技術流程圖。圖2 :本發明使用的抗原基因序列在結核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中所處的位 置(括號內顯示為有下劃線的為所述的抗原序列在NCBI資料庫中的編號，其後的冒號後的 數字為該編號所示序列在結核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中的位置，該位置後顯示的加粗 斜體字為所述的結核分枝桿菌的菌株號)。圖3 :是本發明使用的pET_28a (+ )載體圖譜。圖4 :是本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白編碼基因的PCR擴增結果。從左到右樣 品依次是Marker, Rvl987、Rv3807c、Rv3887c。圖5 :是本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白編碼基因的雙酶切驗證結果。從左到右 樣品依次是Marker、Rvl987、Rv3807c、Rv3887c。圖6 :是本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白的純化結果。從左到右樣品依次是 Marker、Rvl987、Rv3807c、Rv3887c、Mutiple-antigen(即混合抗原蛋白將 Rvl987、Rv3807c和Rv3887c按濃度比為1:1:1的比例混合)。
圖7 :是本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白的western-blot結果。從左到右樣品依次是Rvl987、Rv3807c、Rv3887c。
圖8 :本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白與兩種商購的試劑盒(TB-D0T 和ΤΒ-check-l)在結核病診斷中的敏感性的比較結果。從左到右樣品依次是 Mut ip I e-anti gen λ Rv3807c、Rv3887c、Rvl987、TB-DOT Λ TB-check-l。
圖9 :本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白與兩種商購的試劑盒(TB-D0T 和TB-check-l)在結核病診斷中的特異性的比較結果。從左到右樣品依次是 Mut ip I e-anti gen λ Rv3807c、Rvl987、Rv3887c、TB-check-l Λ TB-DOT。
圖10 :本發明的結核分枝桿菌抗原蛋白與兩種商購的試劑盒(TB-D0T 和TB-check-l)在結核病診斷中的準確性的比較結果。從左到右樣品依次是 Mut ip I e-anti gen λ Rv3807c、Rv3887c、Rvl987、TB-DOT Λ TB-check-l。
具體實施方式
實施例I :結核分枝桿菌抗原蛋白編碼基因的PCR擴增
申請人前期從結核分枝桿菌基因組序列中篩選得到三個基因片段，它們能夠強烈的與結核病人的血清發生反應。它們的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO :1，3，5所示，它們編碼的胺基酸序列分別如序列表SEQ ID NO :2，4，6所示。其中從1^1987基因(從^1登錄號NP_216503. I，GeneID:885815,基因注釋為可能的幾丁質酶)中篩選得到如序列表SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列，序列長度為O. 429kb，從Rv3807c基因(NCBI登錄號NP_218324. 1， GeneID:886134，基因注釋為可能的保守的跨膜蛋白)中篩選得到如序列表SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，序列長度為O. 498kb，從Rv3887c基因(NCBI登錄號NP_218404. 1， GeneID:886211，基因注釋為可能的保守的跨膜蛋白)中篩選得到如序列表SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，序列長度為I. 53kb。
I、結核分枝桿菌抗原蛋白編碼基因的引物設計方法根據NCBI提供的結核分枝桿菌H37Rv (結核分枝桿菌H37Rv菌株的公眾獲得來源中國醫學細菌保藏管理中心， 菌種編號為93004o網址http://www. cmccb. org. cn/)基因組核酸序列(NCBI登錄號 AL123456. 2)獲得結核分枝桿菌抗原蛋白編碼基因的核苷酸序列，根據編碼基因內部的酶切位點，選擇基因內部沒有的酶切位點組合(使用SacI和NotI的酶切位點組合)，從編碼基因的前後各取20bp設計引物，具體引物序列如下(下劃線所示為酶切位點序列)
R1987forward: ATAT GAGCTC ATGGCCGGACTGAACATTTA,
R1987reverse:GAGCG GCGGCCGC CTAGGTGCAAGGATATTGCC ；
R3807cforward:GATG GAGCTC ATGGTGGCCGTGCAGTCGGC,
R3807creverse:GAGAG GCGGCCGC TCATCTCTTCCGGGCCCTTT ；
R3887cforward:TTAT GAGCTC GTGACTGCGCCGCATAAGGT，
R3887creverse:CGAGC GCGGCCGC TTAGTGGCGAAGCCATGCAA。
對應基因的PCR結果參見圖4。PCR反應體系和反應條件如表I和表2
表IPCR反應體系
權利要求
1.結核分枝桿菌抗原蛋白，其胺基酸序列如序列表SEQID N0:5所示。
2.權利要求I所述的抗原蛋白，其蛋白質序列如序列表SEQID NO 6所示。
3.權利要求I或2所述的抗原蛋白在製備結核病診斷檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明屬於基因工程技術領域，與傳染病分子診斷技術領域有關。本發明具體涉及一種結核分枝桿菌抗原蛋白的製備及其在製備結核病診斷檢測試劑盒中的應用。所述的結核分枝桿菌抗原蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ ID NO5所示，其蛋白質序列如序列表SEQ ID NO6所示。生物學試驗表明本發明製備的結核分枝桿菌抗原蛋白能夠在製備結核病診斷檢測試劑盒中應用。
文檔編號C12N15/31GK102977197SQ20121052384
公開日2013年3月20日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者何正國, 李雨慶 申請人:華中農業大學