Vegf165基因修飾的毛囊幹細胞及其製備方法
2023-06-07 02:52:36
Vegf165基因修飾的毛囊幹細胞及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及VEGF165基因修飾的毛囊幹細胞及其製備方法，該方法包括以下的步驟：1）收集形態完好且處於生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗後放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基；2)毛囊幹細胞的純化；3）毛囊幹細胞的鑑定；4）包裝慢病毒；5）慢病毒感染毛囊幹細胞；6）獲得的VEGF165基因修飾毛囊幹細胞。本發明以毛囊幹細胞為種子細胞，具有體外培養時能快速大量擴增，來源非常豐富，減小免疫排斥反應；同時利用VEGF165基因轉染修飾毛囊幹細胞，能夠形成具有擴張和收縮功能的新的工程血管系統，將很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題。
【專利說明】VEGF165基因修飾的毛囊幹細胞及其製備方法【技術領域】
[0001]本發明涉及皮膚組織工程學領域，尤其涉及一種毛囊幹細胞基因修飾的方法和該方法獲得的毛囊幹細胞。
[0002]【技術領域】
[0003]皮膚作為人體最大的器官，具有感覺、調節體溫、分泌與排洩、防止水分蒸發等多種作用，其中最主要的功能是作為人體與外界環境的屏障以維持內環境的穩定，同時其也是免疫系統的重要組成部分。隨著社會經濟的發展，特別是作為「世界工廠」的我國製造業和手工業的繁榮發展，各種涉及皮膚缺損的外傷特別是燒傷、壓軋傷、切割傷等也越來越多。其中，外傷導致的皮膚大面積缺損常常導致非常嚴重的肢體殘疾，甚至死亡。目前臨床上治療皮膚缺損的標準治療方法是自體皮膚移植，由於具有無免疫排斥反應，成活率高等特點，其在臨床上應用極為廣泛，並取得了很好的療效。但自體皮膚移植的缺點也非常明顯，由於是自體取材，其本身就是對患者的再次損傷,極大增加了患者痛苦,而且有發生供皮區感染，不癒合等併發症的風險。更為嚴重的是，對於上述的大面積皮膚缺損，常由於缺乏足夠可供移植的自體皮膚而導致創面修復困難，嚴重影響了治療進程，甚至導致死亡。
[0004]正因如此，科學家們一直試圖尋找一種外源性的皮膚替代物。早在公元前1500年，異種皮膚移植就被用於臨時覆蓋皮膚缺損創面。而隨著組織工程學的創立和發展，皮膚組織工程學迅速興起，並成為近十年來研究的熱點。組織工程學是應用工程學及生命科學的原理與方法，研究生物替代物，以用於重建、保持或提高組織功能的一門學科。目前，國外應用皮膚組織工程學構建人工皮膚的研究已取得了實質性進展，Apligraf, OrCel,Suprathel> Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等產品已先後被美國藥品與食品管理局(FDA)批准上市並已應用於臨床皮膚缺損的治療中。
[0005]然而，雖然目前已有以上數種人工皮膚產品可供臨床選擇，也確實促進了對大面積皮膚缺損患者的臨床治療 。但是，根據我們多年臨床應用過程中遇到的問題，結合文獻報導，我們認為目前人工皮膚移植還存在著許多問題，其中甚至包括可能導致治療最終失敗的「硬傷」:①由於以上人工皮膚產品都沒有血管生成能力，導致移植的人工皮膚沒有血管系統供給營養，從而使人工皮膚容易發生壞死，使移植失敗。②人工皮膚產品中所含的各種異體細胞容易引起免疫排斥反應，臨床上常出現移植的皮膚壞死、脫落，嚴重的甚至出現全身免疫反應等嚴重併發症，並且有可能傳播疾病。③目前所有的人工皮膚產品都只能恢復正常皮膚的部分解剖結構和生理功能，而無法再生具有重要功能的皮膚附屬器結構，例如:血管、毛髮、汗腺等。
[0006]毛囊幹細胞是一類存在於毛囊外根鞘隆突部的幹細胞，具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點。體外培養研究中的毛囊幹細胞表現出了高克隆形成能力，具有很高的再生潛能。由於毛囊幹細胞來源於毛髮，可以直接從患者自身取得，數量極其豐富，且沒有任何併發症，對患者完全無創，現已成為皮膚組織工程學研究的焦點。Taylor等(Taylor G，Lehrer MS, Jensen PJj et al.1nvolvement of follicular stem cells informing not only the follicle but also the epidermis.Cell, 2000, 102(4):451-461.)研究發現毛囊幹細胞不僅能夠分化形成毛囊，而且還參與了表皮組織的形成過程。Stelios等發表的最新研究結果證明，頭髮毛囊中含有大量的幹細胞，是最容易獲得的幹細胞來源之一，並已成功將毛囊幹細胞分化發育生成新的脈管系統。血管內皮細胞生長因子165 (VEGF165)是血管內皮細胞生長因子5種亞型之一，其活性最強，分布範圍最廣，是VEGF體內發揮作用的主要亞型。近年來圍繞VEGF165為中心的血管再生性基因治療研究成為國內外研究熱點。
【發明內容】
[0007] 為了解決目前人工皮膚產品存在的可能影響臨床應用效果的諸多問題，本發明的一個目的是提供VEGF165基因修飾毛囊幹細胞的方法，本發明的另外一個目的是提供上述的方法獲得的VEGF165基因修飾毛囊幹細胞。本發明以毛囊幹細胞為種子細胞，具有體外培養時能快速大量擴增，來源非常豐富，減小免疫排斥反應；同時利用VEGF165基因轉染修飾毛囊幹細胞，能夠形成具有擴張和收縮功能的新的工程血管系統，將很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題。
[0008]為了實現上述的第一個目的，本發明採用了以下的技術方案:
[0009]VEGF165基因修飾毛囊幹細胞的方法，該方法包括以下的步驟:
[0010]I)選用一周齡SD大鼠觸鬚部皮膚，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處於生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗後放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，置於37°C、5%C02培養箱中，每2d換液一次；所述的DMEM/F12補充培養基成分為:44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青鏈黴素混合液、500 μ I L-穀氨醯胺、500 μ I非必需胺基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人鹼性成纖維細胞生長因子、50 μ I羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松；
[0011]2)毛囊幹細胞的純化:將100 μ g/ml的IV型膠原按照3ml/100mm dish的量包被在培養皿中，室溫靜置Ih ;將IOOmm培養皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞後，吹打成單細胞懸液接種於培養皿中，20min後，將未貼壁的細胞連同培養液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養基培養，每3天換液；P2代再純化一次；
[0012]3)毛囊幹細胞的鑑定:
[0013]a、採用Q-PCR法:分選純化後的P3代毛囊幹細胞進行Q-PCR檢測，用ΛΛ Ct法進行各基因表達的相對定量；
[0014]b、細胞免疫螢光染色法:將P3代細胞培養到對數生長期，消化後接種在玻片上，貼壁培養2d後，吸掉培養液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定後，再用5%BSA室溫封閉。分別加入一抗整合素β I抗鼠多克隆抗體、整合素a6多克隆抗體以及角蛋白15多克隆抗體，室溫孵育，PBST洗漆後,再加標記二抗避光30min,加DAPI染核5min,避光晾乾,用mountingsolution封片，觀察；
[0015]4)包裝慢病毒:取對數生長期的293T細胞，提前24h接種於IOOmm培養皿中，待次日細胞長至50%-70%即可；病毒包裝採用鈣轉法進行:轉染前將293T細胞培養基更換為不含雙抗的培養基，包括10 % FBS+DMEM高糖；接著，目的質粒pLent1-1RES-VEGF165-EGFP10ug 和 3 種包裝質粒 VSVG、RSV-REV, RRE 各 5ug 加入 50ulHBS液中輕輕混勻，然後補充ddH20至500 μ I作為B液，另準備500 μ ICaCl2A液，接著將B液加入A液中，打出氣泡，室溫放置2min ;逐滴加入細胞培養皿中，十字水平搖晃多次；待孵育培養10-12h，更換為培養液為含10% FBS+DMEM高糖+1%雙抗；48h後細胞出現融合併有強綠色螢光表達時，收集培養上清，用0.45 μ m孔徑濾膜過濾後，用超速離心機4°C，55000rpm/min離心3h，除去上清後，然後加100 μ I培養基吹打分裝成2管，-80°C保存病毒液；
[0016]5)慢病毒感染毛囊幹細胞:取培養的毛囊幹細胞，提前I天按照I X IO5/孔的濃度將生長狀態良好的P3代的毛囊幹細胞消化、離心後用50 μ I病毒原液和50 μ I補充培養基混勻的吹打後接種在預舖膠的24孔板，在37°C、5%C02培養箱靜置30min，再補加400 μ I補充培養基繼續培養，24h後換液，48h、72h後螢光倒置顯微鏡下觀察綠色螢光，獲得VEGF165基因修飾毛囊幹細胞；
[0017]6)獲得的VEGF165基因修飾毛囊幹細胞。分別檢測該細胞的增殖能力、RT-PCR檢測VEGF165mRNA的表達以及Western-Blot檢測VEGF165蛋白表達情況。
[0018]為了實現上述的第二個目的，本發明採用了以下的技術方案:
[0019]VEGF165基因修飾毛囊幹細胞，該毛囊幹細胞採用上述的方法獲得。
[0020]本發明由於採用了上述的技術方案，以毛囊幹細胞為種子細胞，利用VEGF165基因轉染製得毛囊幹細胞，可以將該毛囊幹細胞種植於三維明膠海綿組織支架，構成成具有新的血管系統的新型複合人工皮膚模型。該模型具有以下獨特的優點:
[0021]①作為幹細胞，毛囊幹細胞具有體外培養時能快速大量擴增，長期體外傳代培養，細胞功能旺盛等特點，並且具有很高的再生和分化能力，這將極大縮短體外培養擴增時間，提聞臨床治療效率；
[0022]②由於能夠形成 的問題；
[0023]③本研究中所用的種子細胞一毛囊幹細胞取自自體毛髮，來源非常豐富，也非常容易獲得，且不會對患者造成任何損傷和痛苦；
[0024]④由於種子細胞取自自體組織，免疫排斥反應和傳播疾病等問題將迎刃而解；
[0025]⑤相對於目前的人工皮膚產品，此新型人工皮膚將更大程度的恢復和再生正常皮膚組織的解剖結構和生理功能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1、圖2為原代毛囊幹細胞從毛囊隆突部爬出，呈鳥巢狀、上皮樣細胞，排列緊40 X。
[0027]圖3為IV型膠原篩選純化後的P3代毛囊幹細胞，呈典型的鋪路石狀100X。
[0028]表1為分選純化後的P3代毛囊幹細胞進行Q-PCR檢測，用ΛΛ Ct法進行各基因表達的相對定量。
[0029]圖4-圖6為P3代毛囊幹細胞的免疫螢光染色，分別為整合素β 1、整合素a6、角蛋白 15，100X。
[0030]圖7-圖9為噴金顯示明膠海綿三維支架掃描電鏡，分別為SEM50X、200X、400X。
[0031]圖10、圖11分別為倒置螢光顯微鏡下，P3代毛囊幹細胞用慢病毒感染完72h的GFP 圖和 PH 圖 100X。[0032]圖12為VEGF165基因修飾後的毛囊幹細胞的生長曲線圖。
[0033]圖13為VEGF165基因修飾後的毛囊幹細的mRNA的RT-PCR結果圖。
[0034]圖14為VEGF165基因修飾後的毛囊幹細的VEGF165蛋白的表達結果。
[0035]圖15~圖17分別為複合人工皮膚的HE染色，分別為注射濃度1X106、5X106、
1X 107/cm2, bar:200 X。
[0036]圖18-19為做大鼠背部移植時創面圖。
[0037]圖20-23為7d移植術後的四個創面癒合情況。依次為VEGF165組、空質粒組、無細胞組、紗布組。
[0038]圖24-27為14d移植術後的四個創面癒合情況。依次為VEGF165組、空質粒組、無細胞組、紗布組。
[0039]圖28-31為21d移植術後的四個創面癒合情況。依次為VEGF165組、空質粒組、無細胞組、紗布組。
[0040]圖32為7d、14d、21d四個組的創面癒合率。
[0041]圖33-35為21d後對取材組織做的HE染色，觀察血管形成情況。依次為VEGF165組、空質粒組、無細胞組。100X
【具體實施方式】
[0042]實施例1大鼠毛囊幹細胞的分離、培養，鑑定
[0043]1.1)選用一周齡SD大鼠觸鬚部皮膚，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處於生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗後放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，置於37°C、5%C02培養箱中，每2d換液一次；所述的DMEM/F12補充培養基成分為:44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青鏈黴素混合液、500 μ I L-穀氨醯胺、500 μ I非必需胺基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人鹼性成纖維細胞生長因子、50μ I羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松。圖1、圖2為原代毛囊幹細胞從毛囊隆突部爬出，呈鳥巢狀、上皮樣細胞，排列緊密。
[0044]1.2)毛囊幹細胞的純化:將100 μ g/ml的IV型膠原按照3ml/100mm dish的量包被在培養皿中，室溫靜置Ih ;將IOOmm培養皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞後，吹打成單細胞懸液接種於培養皿中，20min後，將未貼壁的細胞連同培養液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養基培養，每3天換液；P2代再純化一次。如圖3為IV型膠原篩選純化後的P3代毛囊幹細胞，呈典型的鋪路石狀。
[0045]1.3)毛囊幹細胞的鑑定:
[0046]a、採用Q-PCR法:分選純化後的P3代毛囊幹細胞進行Q-PCR檢測，用ΛΛ Ct法進行各基因表達的相對定量。如表1
[0047]b、細胞免疫螢光染色法:將P3代細胞培養到對數生長期，消化後接種在玻片上，貼壁培養2d後，吸掉培養液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定後，再用5%BSA室溫封閉。分別加入一抗整合素β I (integrin-β I)抗鼠多克隆抗體(1:100)、整合素a6 (integrin_a6)多克隆抗體(1:50)以及角蛋白15 (keratin-15)多克隆抗體(1: 100)，室溫孵育，PBST洗滌後，再加標記二抗避光30min,加DAPI( 1:2000)染核5min,避光晾乾,用mounting solution封片。圖4-圖6為P3代毛囊幹細胞的免疫螢光染色,分別為整合素@1、整合素&6、角蛋白15。
[0048]實施例2明膠海綿三維組織支架的製備
[0049]2.1)明膠海綿三維組織支架製備:
[0050]A.取含量為5%的明膠溶解於25°C的蒸餾水IOml，分別加入0.05%6_硫酸軟骨素鈉鹽(C6S)和0.2%透明質酸鈉鹽(HA)；
[0051 ] B.室溫下用磁力攪拌器攪拌60分鐘後，將交聯劑0.5%1-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽溶液(EDC)和0.25%N-羥基琥珀醯亞胺溶液(N-Hydroxysuccinimide)滴入溶液中混勻5分鐘後,再將溶液注入12控辦孔板的模具中，水平搖晃均勻。
[0052]C.於_80°C下冷凍2小時
[0053]D.然後上凍幹機，凍幹24小時得到厚度為2mm的多孔海綿狀的Gel-C6S-HA支架。
[0054]2.2)觀察:取少量支架樣品，掃描電鏡觀察並記錄，圖7-圖9為噴金顯示明膠海綿三維支架掃描電鏡，分別為SEM50X、200Χ、400Χ.[0055]實施例3血管內皮生長因子165基因(VEGF165)修飾毛囊幹細胞的製備
[0056]3.1包裝慢病毒:取對數生長期的293Τ細胞，提前24h接種於IOOmm培養皿中，待次日細胞長至50%-70%即可；病毒包裝採用鈣轉法進行:轉染前將293T細胞培養基更換為不含雙抗的培養基，包括10% FBS+DMEM高糖；接著，目的質粒pLent1-1RES-VEGF165-EGFP10ug 和 3 種包裝質粒 VSVG、RSV-REV, RRE 各 5ug 加入 50ulHBS液中輕輕混勻，然後補充ddH20至500 μ I作為B液，另準備500 μ ICaCl2A液，接著將B液加入A液中，打出氣泡，室溫放 置2min ;逐滴加入細胞培養皿中，十字水平搖晃多次；待孵育培養10-12h，更換為培養液為含10% FBS+DMEM高糖+1%雙抗；48h後細胞出現融合併有強綠色螢光表達時，收集培養上清，用0.45 μ m孔徑濾膜過濾後，用超速離心機4°C，55000rpm/min離心3h，除去上清後，然後加100 μ I培養基吹打分裝成2管，-80°C保存病毒液。
[0057]3.2慢病毒感染毛囊幹細胞:取培養的毛囊幹細胞，提前I天按照I X IO5/孔的濃度將生長狀態良好的P3代的毛囊幹細胞消化、離心後用50 μ I病毒原液和50 μ I補充培養基混勻的吹打後接種在預舖膠的24孔板，在37°C、5%C02培養箱靜置30min，再補加400 μ I補充培養基繼續培養，24h後換液，48h、72h後螢光倒置顯微鏡下觀察綠色螢光，獲得VEGF165基因修飾毛囊幹細胞。圖10、圖11分別為倒置螢光顯微鏡下，P3代毛囊幹細胞用慢病毒感染完72h的GFP圖和PH圖。
[0058]3.3生長曲線測定:將感染完72h的P3代毛囊幹細胞，消化後以lX105/ml的細胞濃度接種在24孔板上，分別於l、2、3、4、5、6、7d進行細胞計數板計數，每天設置6個復孔，
[0059]取平均數。然後繪製細胞生長曲線。如圖12為VEGF165基因修飾後的毛囊幹細胞的生長曲線圖。
[0060]3.4反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測轉然後毛囊幹細胞中VEGF165mRNA的表達。
[0061](I)提取總RNA:將接種了毛囊幹細胞的六孔培養板置於冰上，吸去培養液；每孔加預冷的Trizol試劑1ml，反覆吹打裂解充分後移入EP管中；加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻後放置2-3min ；12000g, 4°C離心15min ;將上清液移入另一 EP管中，約0.5ml，加等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置lOmin，離心(12000g，4°C ) lOmin，棄上清；用0.5ml DEPC處理的75%酒精Iml洗滌沉澱，離心(7500g，4°C ) 5min ;傾去酒精，倒置EP管，乾燥至酒精揮發；加適量的DEPC處理的水_70°C冷凍備用。
[0062](2)毛囊幹細胞RNA的逆轉錄體系:
[0063]
【權利要求】
1.VEGF165基因修飾毛囊幹細胞的方法，其特徵在於該方法包括以下的步驟: 1)選用一周齡SD大鼠觸鬚部皮膚，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處於生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗後放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，置於37°C、5%C02培養箱中，每2d換液一次；所述的DMEM/F12補充培養基成分為:44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青鏈黴素混合液、500 μ I L-穀氨醯胺、500 μ I非必需胺基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人鹼性成纖維細胞生長因子、50 μ I羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松； 2)毛囊幹細胞的純化:將100μ g/ml的IV型膠原按照3ml/100mm dish的量包被在培養皿中，室溫靜置Ih ;將IOOmm培養皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞後，吹打成單細胞懸液接種於培養皿中，20min後，將未貼壁的細胞連同培養液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養基培養，每3天換液；P2代再純化一次； 3)毛囊幹細胞的鑑定: a、採用Q-PCR法:分選純化後的P3代毛囊幹細胞進行Q-PCR檢測； b、細胞免疫螢光染色法:將P3代細胞培養到對數生長期，消化後接種在玻片上，貼壁培養2d後，吸掉培養液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定後，再用5%BSA室溫封閉；分別加入一抗整合素β I抗鼠多克隆抗體、整合素a6多克隆抗體以及角蛋白15多克隆抗體，室溫孵育，PBST洗漆後,再加標記二抗避光30min,加DAPI染核5min,避光晾乾,用mountingsolution封片，觀察； 4)包裝慢病毒:取對數生長期的293T細胞，提前24h接種於IOOmm培養皿中，待次日細胞長至50%-70%即可；病毒包裝採用鈣轉法進行:轉染前將293T細胞培養基更換為不含雙抗的培養基，包括10 % FBS+DMEM高糖；接著，目的質粒pLent1-1RES-VEGF165_EGFP10ug和3種包裝質粒VSVG、RSV-REV, RRE各5ug加入50ulHBS液中輕輕混勻，然後補充ddH20至500 μ I作為B液，另準備500 μ ICaCl2A液，接著將B液加入A液中，打出氣泡，室溫放置2min ;逐滴加入細胞培養皿中，十字水平搖晃多次；待孵育培養10-12h，更換為培養液為含10% FBS+DMEM高糖+1%雙抗；48h後細胞出現融合併有強綠色螢光表達時，收集培養上清，用0.45 μ m孔徑濾膜過濾後,用超速離心機4°C, 55000rpm/min離心3h,除去上清後,然後加100 μ I培養基吹打分裝成2管，-80°c保存病毒液； 5)慢病毒感染毛囊幹細胞:取培養的毛囊幹細胞，提前I天按照IXlO5/孔的濃度將生長狀態良好的P3代的毛囊幹細胞消化、離心後用50 μ I病毒原液和50 μ I補充培養基混勻的吹打後接種在預舖膠的24孔板，在37°C、5%C02培養箱靜置30min，再補加400 μ I補充培養基繼續培養，24h後換液，48h、72h後螢光倒置顯微鏡下觀察綠色螢光，獲得VEGF165基因修飾的毛囊幹細胞。
2.根據權利要求1所述的方法獲得的VEGF165基因修飾的毛囊幹細胞。
【文檔編號】C12N5/10GK103468744SQ201310290239
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】全仁夫, 黃忠名, 鄭宣, 許世超 申請人:杭州市蕭山區中醫院