細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法
2023-06-06 21:00:26
細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法
【專利摘要】本發明公開了一種細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法。本發明利用序列表序列1所示的細胞穿透肽將1000—10000bp的目的DNA轉染經33℃高溫預培養12—24小時的甘藍型油菜或白菜的單核靠邊期至雙核早期游離小孢子，並在轉染後再進行33℃高溫預培養2天，經胚狀體誘導培養和植株再生培養，可獲得表達目的DNA的胚狀體和基因組整合目的DNA的轉基因植株，胚狀體時期轉化效率檢測結果為6.5%—65.0%，再生植株時期PCR檢測的陽性率為41.7%—49.0%。本發明為蕓薹屬植物小孢子轉基因技術提供了一個有效的方法，對蕓薹屬植物相關基因功能研究和育種具有重要意義。
【專利說明】細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法。
【背景技術】
[0002]細胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一類在親水性及極性上變化很大的短肽。它們可以通過共價或非共價結合通過細胞膜，將其攜帶的大分子，如寡核苷酸、蛋白、藥物等帶入細胞，並可以通過分子設計，針對不同細胞器，實現細胞器定位轉基因，是近年新發展起來的一個具有廣闊應用前景的轉基因載體。目前研究工作主要集中在動物細胞上，植物上的應用研究剛剛開始(Chugh et al.，2010)。細胞穿透蛋白介導的轉基因技術具有高效，不需要選擇標記基因，不需要基因槍或農桿菌，物種依賴性弱，CPP種類多，選擇餘地大，可攜帶的大分子種類多，可設計性強等許多突出優勢，目前在國際上成為生命科學研究，特別是基因工程技術研究的新熱點。它在幹細胞基因工程，DNA、RNA、蛋白質、藥物分子的功能研究，利用基因定點突變的反向遺傳學研究，及至實現真正的分子育種上具有重要且深遠的研究及應用價值。
[0003]小孢子即發育早期的花粉細胞，是植物的生殖細胞，具有單倍性、單細胞、大群體的特點。利用游離小孢子培養系統的CPP轉基因可以一次性獲得大量純合的轉基因株。雖然小孢子是一個理想的轉基因受體材料，但由於花粉壁的特殊結構，造成壁厚、堅實，農桿菌或基因槍都難以操作的特點，小孢子的轉基因國際上一直是一個難題。建立CPP在作物上的應用技術，特別是在小孢子轉基因上的應用技術，不僅有利於理論研究的深入，更有益於後基因組時代對於基因功能的研究，以及利用基因工程的遺傳育種。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種培育蕓薹屬轉基因植物的方法，該方法是利用細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物(Brassica)小孢子，包括如下步驟:將細胞穿透肽與目的DNA的複合體轉染處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞後，再將所述細胞經胚狀體誘導培養和植株再生培養，獲得導入所述目的DNA的蕓薹屬轉基因植株。
[0005]所述單核靠邊期是指小孢子細胞內的細胞質明顯液泡化形成中央大液泡，細胞核位於細胞內一側。
[0006]所述雙核早期是指單核靠邊期的小孢子細胞核發生一次分裂，形成了兩個緊鄰的細胞核。
[0007]所述胚狀體是指小孢子細胞經離體培養獲得的器官分化之前的胚胎。
[0008]在上述方法中，在所述轉染前，還可包括將所述處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞在溫度33°C、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養基靜置懸浮培養12—24小時(如12、16或24小時)的步驟。
[0009]在上述方法中，在所述轉染後，將所述細胞經胚狀體誘導培養前，還可包括將所述細胞在溫度33°C、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養基靜置懸浮培養2天的步驟。
[0010]在上述方法中，所述細胞穿透肽為序列表序列I所示的短肽；
[0011]和/ 或，所述目的 DNA 大小為 1000— 1000bp，具體可為 1930bp、3230bp 或 7907bp。
[0012]和/或，所述複合體中的所述細胞穿透肽與所述目的DNA的質量比為4:1。
[0013]在上述方法中，所述轉染按照包括如下步驟的方法進行:
[0014]將濃度為40 μ g/ml的所述細胞穿透肽溶液與濃度為10 μ g/ml的所述目的DNA溶液等體積混合後，靜置15分鐘，得到含有所述複合體的溶液；
[0015]將轉染試劑與含有所述複合體的溶液按5 μ g:200 μ I的比例混合後靜置5分鐘，獲得轉染液；所述轉染試劑具體可為Invitrogen公司的產品目錄編號為Cat.N011668-019的轉染試劑Lipofectamine。
[0016]將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養液混合，於溫度33°C、黑暗條件下靜置45分鐘一I小時。
[0017]在上述方法中，所述轉染前，所述細胞的所述靜置懸浮培養的起始濃度為5 X 15個/mL ;將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養液混合的體積比為1:1。
[0018]在上述方法中，在所述轉染後，將所述細胞經胚狀體誘導培養前，所述細胞的所述靜置懸浮培養的起始濃度為I X 15個/mL。
[0019]在上述方法中，所述胚狀體誘導培養按照包括如下步驟的方法進行:將所述細胞於溫度24°C條件下用所述細胞的胚狀體誘導培養基懸浮培養至獲得綠色胚狀體；
[0020]所述植株再生培養按照包括如下步驟的方法進行:將所述綠色胚狀體在24°C、每天16小時光照和8小時黑暗、所述光照的強度為6000LUX的條件下用B5固體培養基培養至獲得具有根莖葉的所述轉基因植株。
[0021]在上述方法中，當所述蕓薹屬植物為甘藍型油菜(Brassica napus L.)時,所述胚狀體誘導培養基為NLN培養基；
[0022]當所述蕓薹屬植物為白菜(Brassica pekinensis)時,所述胚狀體誘導培養基為添加0.lmg/L6-BA (6-苄基腺嘌呤)的NLN培養基。
[0023]在上述方法中，所述處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞按照包括如下步驟的方法製備:取小孢子發育至單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物花蕾，用活性氯質量百分含量為4.5%的次氯酸鈉溶液浸泡6分鐘後用無菌水清洗；再將所述花蕾在室溫的B5液體培養基中研碎後用70 μ m孔徑的濾膜過濾，收集濾液，離心，取沉澱用所述B5液體培養基清洗，獲得所述處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞。
[0024]在上述方法中，所述B5液體培養基具體為pH為6.0，溶劑為水，溶質及其終濃度分別如下的溶液:KN033000mg/L，CaCl2.2H20750mg/L, MgSO4.7H20500mg/L, KH2PO4.H20150mg/L, (NH4) 2S04134mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, H3B033.0mg/L, Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2010.0mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L,ZnSO4.7H202.0mg/L, K1.75mg/L,肌醇 100mg/L，煙酸 1.0mg/L,吡哆醇 1.0mg/L 和硫胺素10.0mg/Lο
[0025]在上述方法中，所述B5固體培養基為在所述B5液體培養基中添加10g/L的瓊脂。
[0026]在上述方法中，所述NLN培養基具體為pH為6.0,溶劑為水，溶質及其終濃度分別如下的溶液:KN03125mg/L, Ca(NO3)2.4H20500mg/L, MgSO4.7H20125mg/L, KH2P04125mg/L, FeSO4.7Η2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, H3B036.2mg/L,Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2022.3mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L, ZnSO4.7H208.6mg/L,肌醇lOOmg/L,煙酸5mg/L,批唆醇0.5mg/L,硫胺素0.5mg/L,甘氨酸2.0mg/L,葉酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L,穀氨醯胺800mg/L,絲氨酸lOOmg/L,穀胱甘肽30mg/L,鹿糖130g/L。
[0027]實驗證明，利用序列表序列I所示的細胞穿透肽將1000— 1000bp的目的DNA轉染經33°C高溫預培養12 — 24小時的甘藍型油菜或白菜的單核靠邊期至雙核早期游離小孢子，並在轉染後再進行33°C高溫預培養2天，經胚狀體誘導培養和植株再生培養，可獲得表達目的DNA的胚狀體和基因組整合目的DNA的轉基因植株，胚狀體時期轉化頻率檢測結果為6.5%—65.0%，再生植株時期PCR檢測的陽性率為41.7%—49.0%。本發明為蕓薹屬植物小孢子轉基因技術提供了一個有效的方法，對蕓薹屬植物相關基因功能研究和育種具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為甘藍型油菜小孢子胚狀體形成的再生轉基因植株。
[0029]圖2為目的DNA35S CaMV-gus-nos (3230bp)轉染甘藍型油菜小孢子後形成胚狀體的⑶S染色結果。
[0030]圖3為目的DNA35S CaMV-gfp-nos (1930bp)轉染甘藍型油菜小孢子後形成胚狀體的GFP發光檢測結果。
[0031]圖4為目的DNA35S CaMV-gus_nos (3230bp)轉染甘藍型油菜小孢子形成的再生轉基因植株葉片的GUS染色結果。
[0032]圖5為PCR檢測結果。其中，泳道M為分子量標準，從下至上依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp，代表空白對照，N代表陰性對照，泳道I一9為目的DNA35SCaMV-gfp-nos (1930bp)轉染甘藍型油菜小孢子形成的不同再生轉基因植株，泳道10—15為目的DNA35S CaMV-gfp-nos+ (7907bp)轉染甘藍型油菜小孢子形成的不同再生轉基因植株。
[0033]圖6為Southern雜交檢測結果。其中，泳道M為中的條帶大小為600bp,水代表空白對照，PS代表質粒PCAMBIA1302陽性對照，CK代表陰性對照，泳道I一4為目的DNA35SCaMV-gfp-nos (1930bp)轉染甘藍型油菜小孢子形成的不同再生轉基因植株。
【具體實施方式】
[0034]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0035]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0036]下述實施例中所用的培養基如下:
[0037]B5液體培養基為文獻「Gamborg et al.Plant tissue culture media.1n vitro,1976，12:473-478」中的B5液體培養基；具體為pH為6.0，溶劑為水，溶質及其終濃度分別如下的溶液:KN0330 0 0mg/L，CaCl2.2H20750mg/L, MgSO4.7H20500mg/L, KH2PO4.H20150mg/L, (NH4) 2S04134mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, H3B033.0mg/L, Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2010.0mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L,ZnSO4.7H202.0mg/L, K1.75mg/L,肌醇 100mg/L，煙酸 1.0mg/L,吡哆醇 1.0mg/L 和硫胺素10.0mg/Lο
[0038]B5固體培養基為在所述B5液體培養基中添加10g/L的瓊脂。
[0039]NLN 培養基為文獻「Nitsch JP and C.Nitsch.Haploid plants from pollengrains.Science, 1969，163:85-87」中的NLN培養基；具體為pH為6.0，溶劑為水，溶質及其終濃度分別如下的溶液:KN03125mg/L, Ca(NO3)2.4H20500mg/L, MgSO4.7H20125mg/L, KH2P04125mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L, EDTA.Na237.3mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L,H3BO36.2mg/L, Na2MoO4.2H200.25mg/L, MnSO4.4H2022.3mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L,ZnSO4.7H208.6mg/L,肌醇 lOOmg/L,煙酸 5mg/L,批唆醇 0.5mg/L,硫胺素 0.5mg/L,甘氨酸
2.0mg/L,葉酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L,穀氨醯胺800mg/L,絲氨酸lOOmg/L,穀胱甘肽30mg/L,鹿糖 130g/L。
[0040]下述實施例中所用的質粒pCAMBIA1301和pCAMBIA1302均購自Cambia。
[0041]實施例1、培育甘藍型轉基因油菜
[0042]一、培育甘藍型轉基因油菜
[0043]1、游離小孢子細胞的製備
[0044]人工氣候室種植甘藍型油菜(Brassica napus L.)品種Topas (文獻:Pechan PMand Keller WA.1dentificat1n of potentially embryogenic microspores in Brassicanapus, Phys1l.Plant, 1988，74:377-384.公眾可從北京市農林科學院獲得)，在開花期時，油菜生長的溫度為白天10°c、夜晚5°C，光周期為每天16小時光照、8小時黑暗。日常維護中及時去除種莢，病或黃萎葉片，以維持植株處於旺盛的生殖生長期。
[0045]取上述開花期植株的小孢子細胞發育至單核靠邊期至雙核早期的花蕾，用活性氯質量百分含量為4.5%的次氯酸鈉溶液浸泡6分鐘後，用無菌水清洗3次；再將所述花蕾在室溫下的B5液體培養基中研碎後用70 μ m孔徑的濾膜過濾,收集濾液，100rpm離心,取沉澱用所述B5液體培養基清洗3次，獲得處於單核靠邊期至雙核早期的油菜游離小孢子細胞。
[0046]2、轉染前的預培養
[0047]將步驟I製備的油菜游離小孢子細胞，用胚狀體誘導培養基(即NLN培養基)調整至細胞密度為5 X 15個/mL，按每孔200 μ L分裝至24孔細胞培養板中，置於溫度33°C、黑暗條件下、靜置懸浮培養16小時，獲得所述細胞的懸浮培養液。
[0048]3、轉染
[0049]1)將人工合成的序列表序列I所示的細胞穿透肽Tat2用無菌水配製成濃度為40 μ g/ml的溶液A ;將欲導入植物細胞的目的DNA (35S CaMV-gus-nos (3230bp)、35SCaMV-gfp_nos( 1930bp)或35S CaMV-gfp_nos+(7907bp))用無菌水配製成濃度為 10 μ g/ml的溶液B ;將質量濃度比為4:1的溶液A與溶液B等體積混合後，靜置15分鐘，使細胞穿透肽與目的DNA形成複合體，得到含有所述複合體的溶液C ；
[0050]2)將轉染試劑Lipofectamine (濃度為I μ g/ μ I,購自Invitrogen,產品目錄編號為Cat.N011668-019)按照5 μ g:200 μ I的比例與含有所述複合體的溶液C混合後靜置5分鐘，獲得轉染液；
[0051] 3)將所述轉染液與步驟2獲得的所述細胞的懸浮培養液等體積混合，於溫度33°C、黑暗條件下靜置I小時，獲得轉染細胞培養液。
[0052]所述目的DNA35S CaMV-gus-nos (3230bp)、35S CaMV-gfp-nos (1930bp)和35SCaMV-gfp-nos+ (7907bp)的製備方法如下:
[0053]取質粒pCAMBIA1301用Sph I酶切，回收長度為3230bp的DNA片段(SP35SCaMV-gus-nos)，該片段的結構為35S CaMV啟動子、gus基因和nos終止子；
[0054]取質粒pCAMBIA1302用Sph I酶切，回收長度為1930bp的DNA片段(SP35SCaMV-gfp-nos)，該片段的結構為35S CaMV啟動子、gfp基因和nos終止子；
[0055]取質粒pCAMBIA1301用EcoR I和Sac II雙酶切，回收長度為7907bp的DNA片段(即35S CaMV-gus-nos+)，該片段的結構為35S CaMV啟動子、gus基因、nos終止子和部分載體骨架片段。
[0056]4、轉染後的預培養
[0057]將步驟3所述的轉染細胞培養液轉移至盛有2.6mL胚狀體誘導培養基(即NLN培養基)的直徑為6cm的培養皿中，使所述細胞的濃度為IX 15個/mL，繼續於溫度33°C、黑暗條件下、靜置懸浮培養2天。
[0058]5、胚狀體誘導培養和植株再生培養
[0059]將經步驟4培養後的所述細胞的培養液置於溫度24°C、黑暗條件下靜置懸浮培養3周獲得魚雷期至子葉期的胚狀體；再將該培養液置於溫度24°C、光周期為每天光照16小時和黑暗8小時、光照強度為6000LUX、轉速為10rpm條件下振蕩懸浮培養I周獲得綠色胚狀體；
[0060]將所述綠色胚狀體轉移至B5固體培養基上，於24°C、每天16小時光照、8小時黑暗、所述光照強度為6000LUX的條件下培養3— 4周，獲得具有根莖葉的轉基因植株(圖1)。[0061 ] 二、標記基因表達檢測
[0062]1、胚狀體的標記基因表達檢測
[0063]在上述步驟一中的步驟5中，在將經步驟4培養後的所述細胞的培養液置於溫度24°C、黑暗條件下靜置懸浮培養2周時，各培養皿內都有多量的胚狀體形成，胚狀體發育處於心形期至子葉期，此時從轉染不同目的DNA的各處理中分別隨機取2— 4個培養皿(每皿為一個重複)進行標記基因gus或gfp的表達檢測，統計不同長度目的DNA的轉化頻率(=顯色胚狀體數/檢測的胚狀體數X 100%),結果如表1所示:
[0064]表1、不同長度目的DNA的轉化頻率統計結果
[0065]
【權利要求】
1.一種培育蕓薹屬轉基因植物的方法，包括如下步驟: 將細胞穿透肽與目的DNA的複合體轉染處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞後，再將所述細胞經胚狀體誘導培養和植株再生培養，獲得導入所述目的DNA的蕓薹屬轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:在所述轉染前，包括將所述處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞在溫度33°C、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養基靜置懸浮培養12 — 24小時的步驟。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於:在所述轉染後，將所述細胞經胚狀體誘導培養前，包括將所述細胞在溫度33°C、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養基靜置懸浮培養2天的步驟。
4.根據權利要求1一3中任一所述的方法，其特徵在於:所述細胞穿透肽為序列表序列I所示的短肽； 和/或，所述目的DNA大小為100 — 1000bp。 和/或，所述複合體中的所述細胞穿透肽與所述目的DNA的質量比為4:1。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於:所述轉染按照包括如下步驟的方法進行: 將濃度為40 μ g/ml的所述細胞穿透肽溶液與濃度為10 μ g/ml的所述目的DNA溶液等體積混合後，靜置15分鐘，得到含有所述複合體的溶液； 將轉染試劑與含有所述複合體的溶液按5 μ g:200 μ I的比例混合後靜置5分鐘，獲得轉染液； 將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養液混合，於溫度33°C、黑暗條件下靜置45分鐘一I小時。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於: 所述轉染前，所述細胞的所述靜置懸浮培養的起始濃度為5 X 15個/mL ； 將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養液混合的體積比為1:1。
7.根據權利要求1一6中任一所述的方法,其特徵在於: 在所述轉染後，將所述細胞經胚狀體誘導培養前，所述細胞的所述靜置懸浮培養的起始濃度為I X 15個/mL。
8.根據權利要求1一7中任一所述的方法，其特徵在於:所述胚狀體誘導培養按照包括如下步驟的方法進行:將所述細胞於溫度24°C條件下用所述細胞的胚狀體誘導培養基懸浮培養至獲得綠色胚狀體； 所述植株再生培養按照包括如下步驟的方法進行:將所述綠色胚狀體在24°C、每天16小時光照和8小時黑暗、所述光照的強度為6000LUX的條件下用B5固體培養基培養至獲得具有根莖葉的所述轉基因植株。
9.根據權利要求1一8中任一所述的方法，其特徵在於: 當所述蕓薹屬植物為甘藍型油菜(Brassica napus L.)時,所述胚狀體誘導培養基為NLN培養基； 當所述蕓薹屬植物為白菜(Brassica pekinensis)時,所述胚狀體誘導培養基為添加.0.lmg/L6-BA 的 NLN 培養基。
10.根據權利要求1一9中任一所述的方法，其特徵在於:所述處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞按照包括如下步驟的方法製備:取小孢子發育至單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物花蕾，用活性氯質量百分含量為4.5%的次氯酸鈉溶液浸泡6分鐘後用無菌水清洗；再將所述花蕾在室溫的B5液體培養基中研碎後用70 μ m孔徑的濾膜過濾，收集濾液，離心，取沉澱用所述B5液體培養基清洗，獲得所述處於單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離 小孢子細胞。
【文檔編號】A01H5/00GK104073519SQ201310101986
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優先權日:2013年3月27日
【發明者】劉凡, 王桂香, 宗梅, 韓碩, 秦瑩, 張月雲 申請人:北京市農林科學院