啤酒酵母工程菌及其構建方法

2023-06-07 11:43:21 6

專利名稱：啤酒酵母工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵工業技術領域中的一種啤酒酵母工程菌及其構建方法。
背景技術：
啤酒的風味穩定性是啤酒的一個重要的質量指標。由於硫化氫的存在影響啤酒的風味，因此，啤酒需要較長的貯酒時間以除去這些物質從而達到啤酒的風味的成熟。啤酒酵母的代謝流中，硫化氫是穀胱甘肽的上遊代謝物，可以通過增強γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶系的活性來降低硫化氫的形成，增加穀胱甘肽的形成，以改善啤酒的風味，增強啤酒的抗老化能力。
雙己醯是啤酒中另一個重要的風味物質，但它的口味域值很低(0.1mg/L)。當雙己醯的含量達到或超過口味域值時，會產生一種餿飯味，從而破壞了啤酒的風味。雙己醯是啤酒酵母合成纈氨酸和亮氨酸的代謝途徑的中間產物α-己醯乳酸經非酶途徑促氧化形成的。而ILV2基因編碼己醯羥酸合成酶，能夠把丙酮酸轉化為己醯乳酸。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的啤酒酵母工程菌。
本發明所提供的啤酒酵母工程菌，是將γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因導入釀酒酵母YSF-31(購於中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)中，得到的高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的菌株；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位鹼基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位鹼基的核苷酸序列。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的胺基酸殘基序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為D90220。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位鹼基的263bp核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位鹼基的379bp的核苷酸片段。
為了便於篩選，在導入所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導入釀酒酵母YSF-31；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank號為K02204。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導入釀酒酵母YSF-31；所述重組質粒pICG的物理圖譜如圖7。
所述啤酒酵母工程菌優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2CGMCC №1377。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377已於2005年05月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1377。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377的細胞為橢圓形，菌落形態特徵是菌落凸起、光滑、乳白色、邊緣整齊。最適生長溫度30℃。生長最適pH為5.5。其發酵培養基和培養條件與工業用啤酒酵母菌YSF-31(購於中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)相同。
本發明的第二個目的是提供一種構建上述啤酒酵母工程菌的方法。
本發明所提供的構建上述啤酒酵母工程菌的方法，是將γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因導入釀酒酵母YSF-31(購於中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)中，得到的高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的菌株即為啤酒酵母工程菌；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位鹼基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位鹼基的核苷酸序列。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的胺基酸殘基序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為D90220。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位鹼基的263bp核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位鹼基的379bp的核苷酸片段。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位鹼基的263bp核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的3′端第2983-3522位鹼基的539bp的核苷酸片段。
為了便於篩選，在導入所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導入釀酒酵母YSF-31(購於中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank號為K02204。
所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導入釀酒酵母YSF-31(購於中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)；所述重組質粒pICG的物理圖譜如圖7。
所述啤酒酵母工程菌優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
來源於非使用工業微生物的基因構建的工程菌是否適於飲用，能否被消費者接受還需要很長時間的實踐證明，又因為啤酒酵母本身就含有γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因，所以本發明採用基因自克隆的方式將γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因插入到ILV2基因中，構建了ILV2基因被破壞而γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因增加了一個拷貝的工程菌。本發明將傳統的育種技術與分子育種技術相結合，首先依據不同工業用啤酒酵母菌種的生理生化特性，通過銅抗性篩選，獲得在含有3.0mmol/lCuSO4的YEPD平板上不能生長的工業用啤酒酵母菌YSF-31作為受體菌。然後採用自克隆技術，用KpnI和PstI酶切重組質粒pICG得到一個6.0kb大小的DNA片段。
此片段含來源於酵母菌的銅抗性基因和γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因，兩端含有受體菌ILV2基因的5′端和3′端序列。用該DNA片段轉化工業啤酒酵母菌YSF-31，該片段和YSF-31基因組上的ILV2發生同源重組，結果銅抗性基因和γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因被整合到染色體上。這樣，在重組酵母菌株中，ILV2基因被破壞，而同時銅抗性基因和γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因都增加了一個拷貝。在含有4mmol/l CuSO4的YEPD平板上篩選轉化子。通過遺傳穩定性實驗、及模擬啤酒發酵小型實驗、在啤酒廠進行的小試實驗和中試發酵實驗，獲得高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的工業啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2(CGMCC №1377)。與受體菌相比，其生理、生化特性無明顯差異；小試和中試發酵實驗生產的啤酒的風味也無差異；對發酵設備及條件沒有特殊要求，一般啤酒廠的設備和條件均可使用。本發明的啤酒酵母工程菌因雙乙醯產生量降低而縮短發酵周期，生產的啤酒保鮮時間明顯增長；因增加穀胱甘肽的形成，改善了啤酒的風味，增強了啤酒的抗老化能力。


圖1為CUP1基因的PCR產物的電泳2為重組質粒pMCUP和pYCUP的構建過程示意3為質粒pMCUP的酶切驗證圖譜圖4為轉化子YS58(pYCUP)的營養缺陷型篩選圖5為轉化子YS58(pYCUP)的銅抗性篩選圖6為質粒pICG的構建過程示意7為質粒pICG的酶切驗證圖譜圖8為銅抗性基因和γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因整合到YSF-31基因組上的示意9為用引物ILV2-1和CUP1-P2進行受體和轉化子的PCR分析電泳圖譜圖10為搖瓶發酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的穀胱甘肽含量和雙乙醯含量的比較圖11為百升發酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙醯含量檢測圖12為百升發酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的糖度檢測結果圖13為兩噸發酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的穀胱甘肽含量和雙乙醯含量的比較具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、構建啤酒酵母工程菌-釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
一、含有穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1的表達載體pICG的構建1、工業用啤酒酵母菌的銅抗性測定工業用啤酒酵母菌對銅的抗性普遍偏低，因此，可以依據銅抗性的提高有效篩選酵母轉化子，銅抗性被普遍用作工業用啤酒酵母的選擇標記。通過銅抗性測定，大部分工業用啤酒菌在含有2.5mmol/l CuSO4的YEPD平板上不能生長，測定篩選到YSF-31、YSF-35和YSF-41(購於中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號分別為CGMCC 2.420、CGMCC 2.412、CGMCC 2.241)三株酵母在含有3.0mmol/lCuSO4的YEPD平板上不能生長，確定用YSF-31作為下一步轉化實驗的受體菌。
2、銅抗性基因CUP1的PCR擴增根據文獻報導的CUP1的基因序列(CUP1基因序列的GenBank號為K02204)設計CUP1基因克隆的PCR引物P15′-CCAAGATCTCGCTATACGTGCATATGTTC-3′P25′-CGAGTCGACATCTGTTGTACTATCCGCTT-3′劃線部分分別是BglII和SalI酶切位點，PCR反應以P1、P2為引物，以YSF-31的基因組DNA為模板，在50μl PCR反應混合液中含25μl Taq酶Mix，12.5μmol/l引物各2μL，模板10μl，加無菌水11μl調整至50μl。條件為94℃，變性5min，循環參數94℃變性40s；56℃退火1min；72℃延伸2min；30個循環；72℃延伸15min使產物延伸完全。將得到的PCR產物進行0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示，得到一條約1.1kb的特異性條帶，其大小與預期相當。圖1中，泳道M為DNA分子量標準sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，492，359bp)，泳道1為CUP1的PCR產物。回收該約1.1kb的DNA片段，克隆至pGEM-T載體，進行測序，結果表明擴增得到的CUP1具有GenBank Access No.K02204的自5′端第1098-2189位鹼基的核苷酸序列。
3、重組質粒pYCUP的構建PCR片段經低熔點膠回收直接與經HincII酶切的質粒pBluescriptM13(寶生物工程(大連)有限公司)連接，構成質粒pMCUP。用KpnI和SalI酶切質粒pMCUP得到CUP1片段，然後與用KpnI和SalI酶切的線性質粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koemer TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9163-167.)連接，得到質粒pYCUP(圖2)。並利用EcoRI，SacI，KpnI和XbaI進行單酶切驗證pMCUP，結果如圖3所示，pMCUP經EcoRI酶切後，得到4060bp的DNA片段(泳道2)；pMCUP經SacI酶切後，得到4060bp的DNA片段(泳道3)；pMCUP經KpnI酶切後，得到4060bp的DNA片段(泳道4)；pMCUP經XbaI酶切後，得到3200bp片段和660bp的DNA片段(泳道5)。酶切驗證結果表明pMCUP的結構正確。圖3中，1為DNA分子量標準sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，)。
用穿梭質粒pYCUP通過完整酵母轉化法(Adams A.Gottschling DE，Kaiser CA，Steams T.Methods in Yeast Geneticsa cold spring harbor laboratory course manual.New YorkCold Spring Harbor；1997.Cold Spring Harbor Laboratory)轉化實驗室酵母菌株YS58(Teunissen ARH，Holub E，Hucht JVD.Physical localization of theflocculation gene FLO1 on chromosome I of Saccharomyces cerevisiae.Yeast，1993，91-10)，轉化時用含有20mg/L Leu，Ura和Trp的YNB培養基進行篩選，因質粒中含有URA3基因，所以含有質粒pYCUP的轉化子YS58(pYCUP)在不含Ura的YNB培養基上也能生長，而YS58不能生長(圖4)。圖4中，兩個平板中的第一行的五個菌落為受體菌，其餘各行的五個菌落均為轉化子YS58(pYCUP)。左側平板中的培養基為含有20mg/L Leu和20mg/L Trp的YNB培養基，右側平板為含有20mg/LLeu，20mg/L Ura和20mg/L Trp的YNB培養基。
得到轉化子YS58(pYCUP)後用含有不同Cu2+濃度的YEPD培養基驗證。結果是在含有3mM Cu2+的平皿中YS58與轉化子YS58(pYCUP)都能生長，而在5-9mM Cu2+的平皿中只有轉化子YS58(pYCUP)能夠生長，YS58不能生長(圖5)。圖5中，四個平板中的第一行的五個菌落為受體菌，其餘各行的五個菌落均為轉化子YS58(pYCUP)。實驗結果表明CUP1基因具有銅抗性功能，可以用作篩選標記。
4、重組質粒pICG的構建用BglII和SalI酶切質粒pYCUP得到CUP1片段，用SalI和XbaI酶切質粒pGF-2(Fan X，He X，Guo X，Qu N，Wang Ch，Zhang B.Increasing glutathioneformation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetasegene in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Lett.2004，26415-417)得到片段GSH1，用BglII和XbaI酶切質粒pLZ-2(李豔，鐵翠娟，王正祥，張博潤，諸葛健。低雙乙醯啤酒酵母菌的構建。釀酒，2002，2977-79)，將三個片段連接，構成質粒pICG(圖6)。並利用SalI、BamHI、EcoRI、BglII或SacI單酶切，SalI和SacI雙酶切驗證pICG，結果如圖7所示，pICG經SalI酶切後，得到7000bp片段和4300bp片段(泳道2)；pICG經BamHI酶切後，得到6100bp片段，3600bp片段和1600bp片段(泳道3)；pICG經EcoRI酶切後，得到6200bp片段，2900bp片段和2200bp片段(泳道4)；pICG經BglII酶切後，得到9820bp片段和990bp片段和490bp片段(泳道5)；pICG經SacI酶切後，得到5700bp和5600bp片段(泳道6)；pICG經SalI和SacI雙酶切後，得到5200bp片段，4600bp片段和1500bp片段(泳道7)。酶切驗證結果表明pICG的結構正確。圖7中，1為DNA分子量標準sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，)。
二、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2CGMCC №1377的構建1、工程菌YSF31(pICG)-2的構建用KpnI和PstI酶切重組質粒pICG得到一個6.0kb大小的DNA片段。此片段含有銅抗性基因和γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因，γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位鹼基的263bp核苷酸片段，γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位鹼基的379bp的核苷酸片段。用該DNA片段轉化(Adams A.Gottschling DE，Kaiser CA，Stearns T.Methods in Yeast Geneticsa cold spring harbor laboratory course manual.New YorkCold Spring Harbor；1997.Cold Spring Harbor Laboratory)工業啤酒酵母菌YSF-31，在含有硫酸銅的YEPD培養基平板上篩選轉化子，獲得硫酸銅抗性明顯提高的轉化子YSF31(pICG)-2。該6.0kb片段和YSF-31基因組上的ILV2發生同源重組，結果，銅抗性基因和穀胱甘肽基因被整合到染色體上。這樣，在重組酵母菌株中，ILV2基因被破壞，而同時銅抗性基因和穀氨酸半胱氨酸合成酶基因都增加了一個拷貝(圖8)。
用引物ILV2-1(5′-GCAGGATCCTGGCTTCAGTTGCTGTCT-3′)和CUP1的引物P2，以工程菌YSF31(pICG)-2的基因組DNA為模板，進行PCR擴增驗證，結果在受體菌YSF-31中沒有任何片段生成，而在挑選的工程菌YSF31(pICG)-2中擴增出了大小為1.3kb的片段(圖9)。圖9中，1為1kb ladder marker；2-4轉化子YSF31(pICG)-2的PCR產物；5受體菌YSF-31的PCR產物；6陽性對照pICG為模板的PCR產物。
2、工程菌YSF31(pICG)-2的γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶(AHAS)酶活測定菌株接於YEPD培養基中，在28℃培養36小時，離心收集細胞，按照細胞通透測定法測定工程菌YSF31(pICG)-2和受體菌YSF-31的AHAS酶活(Magee PT，Robichon-Szulmajster DH.The regulation of isoleucine-valine biosynthesisin Saccharomyces cerevisiae.2.Identification and characterization ofmutants lacking acteohydroxyacid synthase.Eur.J.Biochem.1968，3502-506)。測定結果表明，在工程菌YSF31(pICG)-2中AHAS的酶的活性是受體菌的50％(表1)，證明在工程菌YSF31(plCG)-2中ILV2基因被破壞掉一個等位基因。
表1轉化子YSF31(pICG)-2和受體菌YSF-31的AHAS酶活比較

3、搖瓶發酵實驗結果將受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2分別接入5ml麥芽汁培養基，25℃培養12小時，以10％的接種量接種於10ml麥芽汁培養基，25℃培養36小時，全部接於含有270ml麥芽汁的三角瓶中，9℃靜置培養10天。每兩天取樣，每次用無菌移液管取10ml培養液，用兩層3MM濾紙過濾，分別檢測細胞內穀胱甘肽含量(Fan X，He X，Guo X，Qu N，Wang Ch，Zhang B.Increasing glutathioneformation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetasegene in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Lett.2004，26415-417)和濾液中雙乙醯含量(管敦儀。啤酒工業手冊，中冊，p234，輕工業出版社)。結果表明工程菌的穀胱甘肽的含量比受體菌的高，而在發酵液中，工程菌的雙乙醯含量比受體菌的低，特別是工程茵的峰值是YSF-31的75％。這充分說明在工程菌中GSH1基因得到了高表達而ILV2基因被破壞掉一個拷貝(圖10)。圖10中，YSF-31的GSH含量(■)工程菌YSF31(pICG)-2的GSH含量(□)；YSF-31的雙乙醯含量(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙醯含量(△)。
4、小試(百升)發酵實驗將酵母菌接入5mL麥芽汁培養基，25℃培養12小時，以10％的接種量接種於10mL麥芽汁培養基，25℃培養36小時，培養液全部接於270mL麥芽汁中，25℃培養36小時，然後將培養液接入2000ml大三角瓶，20℃培養36小時，接至100L發酵罐(裝有80L麥芽汁培養基)中。啟發後10℃培養，當糖度降到2.6時，降溫到0℃後儲。
(1)穀胱甘肽含量檢測將發酵液離心收集菌體，然後測細胞中的GSH含量，結果表明轉化子YSF31(pICG)-2細胞中的GSH含量是受體YSF31細胞的1.38倍，說明在轉化子YSF31(pICG)-2細胞中GSH1基因得到了高表達(表2)。
表2受體菌和工程菌的穀胱甘肽含量的比較

(2)雙乙醯含量檢測將發酵液用濾紙過濾，然後測濾液中的雙乙醯含量，在百升發酵實驗中，工程菌YSF31(pICG)-2的發酵速度比受體菌的快得多，工程菌YSF31(pICG)-2從第10天開始進入後儲期，受體菌YSF-31從第14天開始進入後儲期，工程菌提前4天進入後儲期。工程菌的雙乙醯含量的峰值比受體的低(圖11)。圖11中，受體菌YSF-31的雙乙醯含量(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙醯含量檢測(△)。
(3)糖度檢測從發酵罐中取500ml發酵液，通過反覆傾倒排除二氧化碳，用糖度計檢測發酵液的糖度。糖度檢測實驗表明，工程菌YSF31(pICG)-2的糖發酵速度比受體菌YSF-31的快，提前六天達到2.5(圖12)。圖12中，受體菌YSF-31的糖度檢測(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的糖度檢測(△)。
(4)發酵結束後其他指標的檢測百升實驗在後儲期(工程菌YSF31(pICG)-2和受體菌YSF-31的後儲期均為14天)取樣檢測pH、絮凝性、α-N同化率和發酵度，結果表明pH、絮凝性、α-N同化率和發酵度，受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2基本相同，說明染色體上的整合沒有改變酵母的其他特性(表3)。
表3其他發酵指標的檢測

5、中試(兩噸)發酵實驗將酵母菌接入5mL麥芽汁培養基，25℃培養12小時，以10％的接種量接種於10mL麥芽汁培養基，25℃培養36小時，培養液全部接於270mL麥芽汁中，25℃培養36小時，然後將培養液接入2000ml大三角瓶，20℃培養36小時，接至15L的卡氏罐中，20℃培養36小時，菌液全部接於兩噸發酵罐(裝有1600L麥芽汁培養基)中，10℃發酵，當糖度降到2.6時，降溫到0℃後儲。
(1)穀胱甘肽含量與雙乙醯含量檢測在兩噸發酵實驗中，工程菌YSF31(pICG)-2的穀胱甘肽的含量比受體菌YSF-31的高，而工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙醯的含量比受體菌YSF-31的低。跟小試實驗結果和百升發酵實驗結果一致(圖13)。圖13中，受體菌YSF-31的雙乙醯含量(■)；工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙醯含量(□)；受體菌YSF-31穀胱甘肽含量(○)；工程菌YSF31(pICG)-2的穀胱甘肽含量(●)。
(2)抗老化實驗硫代巴比妥酸(TBA)法測定羰基化合物的檢測報告表明，用工程菌YSF31(pICG)-2生產的成品酒的保鮮時間是受體菌YSF-31生產的成品酒保鮮時間的1.5倍左右(表4)。
表4受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的抗老化實驗

注1和1』樣品為兩噸中試工程菌YSF31(pICG)-2及其平行樣，2和2』為兩噸中試受體菌YSF-31及其平行樣。說明RSV值越大，表示成品啤酒的保鮮時間越長。
(3)受體菌和工程菌發酵生產的啤酒經過陳化以後，品評結果如下10位評委品評結果是認為工程菌YSF31(pICG)-2發酵生產的啤酒優於受體菌YSF-31生產的啤酒的有7位評委；認為工程菌YSF31(pICG)-2發酵生產的啤酒同於受體菌YSF-31生產的啤酒的有1位評委；認為工程菌發酵生產的啤酒遜於受體菌YSF-31生產的啤酒的有2位評委。
6、工程菌YSF31(pICG)-2的穩定性檢測將工程菌YSF31(pICG)-2分別在有選擇壓力(YEPD+3mmol/L CuSO4)及無選擇壓力(YEPD)的液體培養基中連續傳代培養120h(24小時傳一次代)，每天取樣檢測插入的DNA片段的丟失情況，結果表明，無論在有選擇壓力條件下，還是在無選擇壓力條件下，連續培養120h後，100％的工程菌細胞帶有插入DNA片段，未發生丟失現象。
通過上述實驗步驟，獲得高穀胱甘肽含量低雙乙醯生成量的工業啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2。啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2已於2005年05月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1377。
權利要求
1.一種啤酒酵母工程菌，是將γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因導入釀酒酵母YSF-31中，得到的高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的菌株；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位鹼基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位鹼基的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特徵在於所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的胺基酸序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列如GenBank號D90220。
3.根據權利要求2所述的啤酒酵母工程菌，其特徵在於所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位鹼基的263bp核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位鹼基的379bp的核苷酸片段。
4.根據權利要求1、2或3所述的啤酒酵母工程菌，其特徵在於在導入所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導入釀酒酵母YSF-31；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列如GenBank號K02204。
5.根據權利要求4所述的啤酒酵母工程菌，其特徵在於所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導入釀酒酵母YSF-31；所述重組質粒pICG的物理圖譜如圖7。
6.根據權利要求5所述的啤酒酵母工程菌，其特徵在於所述啤酒酵母工程菌是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
7.一種構建權利要求1所述啤酒酵母工程菌的方法，是將γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因導入釀酒酵母YSF-31中，得到的高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的菌株即為啤酒酵母工程菌；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位鹼基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位鹼基的核苷酸序列。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的胺基酸序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列如GenBank號D90220。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位鹼基的263bp核苷酸片段，所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位鹼基的379bp的核苷酸片段；在導入所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導入釀酒酵母YSF-31；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank號為K02204。
10.根據權利要求7、8或9所述的方法，其特徵在於所述γ-穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導入釀酒酵母YSF-31；所述重組質粒pICG的物理圖譜如圖7；所述啤酒酵母工程菌優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
全文摘要
本發明公開了一種啤酒酵母工程菌及其構建方法。該工程菌，是將γ－穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因導入釀酒酵母YSF－31中，得到的高穀胱甘肽含量低雙乙醯含量的菌株；所述γ－穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70－705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ－穀氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70－539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1－705位鹼基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983－3522位鹼基的核苷酸序列。該工程菌因雙乙醯產生量降低而縮短發酵周期，生產的啤酒保鮮時間明顯增長；因增加穀胱甘肽的形成，改善了啤酒的風味，增強了啤酒的抗老化能力。
文檔編號C12N1/19GK1699552SQ20051007778
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月24日 優先權日2005年6月24日
發明者張博潤, 張吉娜, 何秀萍, 郭雪娜, 傅秀輝 申請人:中國科學院微生物研究所