一種代謝症候群的大鼠模型建立方法與流程

2023-06-06 17:10:36 7

本發明屬於生物技術領域，具體地說，涉及一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯合暴露致大鼠代謝症候群模型的建立方法。

背景技術：

代謝症候群，是指人體的蛋白質、脂肪、碳水化合物等物質發生代謝紊亂，是一組複雜的代謝紊亂症候群，在臨床上出現一系列症候群，即稱代謝症候群。其病因目前認為是多基因和環境相互作用的結果，與遺傳、免疫等均有密切關係。其具有以下特點：1.多種代謝紊亂集於一身，包括肥胖、高血糖、高血壓、血脂異常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝發生率和高胰島素血症，這些代謝紊亂是心、腦血管病變以及糖尿病的病理基礎。可見糖尿病不是一個孤立的病，而是代謝症候群的組成部分之一。2.有共同的病理基礎，目前多認為它們的共同原因就是肥胖尤其是中心性肥胖所造成的胰島素抵抗和高胰島素血症。3.可造成多種疾病增加，如高血壓、冠心病、腦卒中、甚至某些癌症，包括與性激素有關的乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌，以及消化系統的胰腺癌、肝膽癌、結腸癌等。4.有共同的預防及治療措施，防治住一種代謝紊亂，也就有利於其他代謝紊亂的防治。由於代謝症候群中的每一種成分都是心血管病的危險因素，它們的聯合作用更強，所以有人將代謝症候群稱為「死亡四重奏」(中心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血症和高血壓)，因此代謝症候群是對一組高度相關疾病的概括性和經濟的診斷與治療的整體概念。在實驗中建造代謝性綜合症的模型為實驗研究提供科學指導。

技術實現要素：

為了研究和學習代謝症候群導致的病理特徵，製備其大鼠模型，本發明提供了一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯合暴露致大鼠代謝症候群模型的建立方法，包括以下步驟：

步驟1：購買spf級sd大鼠40隻，適應性飼養一周後隨機分為兩組，分別為高脂飼料的造模組、普通飼料的對照組；

步驟2：按照配方進行製備高脂飼料和普通飼料，對造模組給予高脂飼料飼養，對照組給予普通飼料飼養；每日按飼料/體重=8g/100g投放飼料，自由攝食、飲水；

步驟3：每周定時對大鼠體重進行空腹監測；每四周對大鼠進行空腹血糖水平監測；

步驟4：每日早8點對大鼠按體重每kg進行空腹灌胃玉米油5ml；

步驟5：飼養到第10周對每組隨機抽取4隻大鼠進行肝臟b超檢測是否有脂肪肝形成；

步驟6：飼養90天後，將大鼠禁食12h，按大鼠體重每kg進行空腹灌50%葡萄糖溶液2mg，分別於葡萄糖負荷後0min，15min，30min，60min，120min採血用血糖分析儀測定葡萄糖水平，繪製ogtt曲線；飼養90天後，將大鼠禁食12h，按大鼠體重每kg進行腹腔注射生物合成胰島素0.75iu，分別於胰島素注射後0min，15min，30min，60min，120min尾靜脈採血，利用血糖分析儀測定血糖水平；然後將大鼠進行剖殺取材。

所述步驟2中飼料配方為：

普通組飼料：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白質，12.05%脂肪；

高脂高糖組飼料：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白質，23.53%脂肪。

本發明實驗為一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯合暴露致大鼠代謝症候群模型的建立。在飼養大鼠的過程以5ml/kg體重進行玉米油灌胃，模擬人群高脂高糖不良飲食習慣的生活方式、誘導代謝症候群模型的建立，與人群代謝症候群的發生、發展較為接近。且實驗動物代謝症候群相關症狀和機體內環境改變也與人類相似，動物模型穩定性較好，更有助於代謝症候群機制及藥物治療研究。實驗對象選擇sd大鼠，種屬純正，是動物實驗中最為常見的大鼠類別，該動物模型可向外界提供一定的參考。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發明中實施例大鼠的體重趨勢圖。

圖2是本發明中實施例大鼠的肝臟b超圖。

圖3是本發明中實施例大鼠的肝臟視覺檢查照片。

圖4是是本發明中實施例大鼠的肝he染色鏡下病理學檢測。

圖5是本發明中實施例大鼠的ogtt曲線圖。

圖6是本發明中實施例大鼠的itt變化。

圖7是本發明中實施例大鼠的胰腺he染色鏡下病理學檢測。

圖8是本發明中實施例大鼠的脂肪he染色鏡下病理學檢測。

圖9是本發明中實施例大鼠的脂肪組織鏡下細胞計數變化。

具體實施方式

本發明提供了一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯合暴露致大鼠代謝症候群模型的建立方法，包括以下步驟：

spf級sd大鼠40隻，雌雄各半，體重150g±10g，購買第三軍醫大學醫學實驗動物中心（合格證號：（scxk（渝）2012-0005））。適應性飼養一周後隨機分為兩組，分別為高脂飼料造模組（造模組）、普通飼料對照組（對照組）。

按照配方進行製備高脂高糖飼料和普通飼料。對造模組給予高脂飼料飼養，對照組給予普通飼料飼養。每日按8g/100g幹飼料投放飼料，自由攝食、飲水。普通組飼料：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白質，12.05%脂肪；高脂高糖組飼料：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白質，23.53%脂肪；飲水為spring純水系統所制去離子水。

體重檢測，每周定時對大鼠體重進行空腹監測

每日早八點對大鼠以5ml/kg進行空腹灌胃玉米油。玉米油為山東魯花牌非轉基因物理壓榨玉米油。

飼養至第10周每組隨機抽取4隻大鼠進行肝臟b超測定是否有脂肪肝形成。動物房備皮後送至遵義市第一人民醫院行彩色超聲檢查，檢查由主治醫師進行並報告結果。結果包括有無脂肪肝及肝斜徑，肝斜徑測量方法如下：參考《超聲醫學》第六版，2014，388。實驗大鼠10%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉後取仰臥位，以肝右靜脈和肝中靜脈匯入下腔靜脈的右肋緣下肝臟測量肝臟右葉為標準測量切面測量。測量位置為：測量點分別置於肝右葉前、後緣之肝包膜處，測量其最大垂直距離即為肝斜徑。

空腹血糖水平實驗開始後，於第0天、30天、60天、90天定期檢測空腹血糖水平（血糖儀檢測尾靜脈血）。

口服葡萄糖耐量試驗(oralglueosetolerancetest，ogtt)於實驗開始第90天對大鼠禁12h後，按2mg/kg劑量灌胃,給予50%葡萄糖溶液，分別於葡萄糖負荷後0min，15min，30min，60min，120min採血用血糖分析儀測定0min，15min，30min，60min，120min葡萄糖水平，繪製ogtt曲線。

胰島素耐量試驗(insulintolerancetest，itt)於實驗開始第90天對大鼠禁食12h後，按0.75iu/kg劑量腹腔注射方式給予生物合成胰島素，於胰島素注射後0min，15min，30min，60min，120min尾靜脈採血。利用血糖分析儀測定0min，15min，30min，60min，120min的血糖水平。計算胰島素注射後各時間點血糖值相對於注射前的血糖值的比率。

飼養大鼠至90天後，隔夜空腹稱重後麻醉剖殺取材，取腹主動脈全血靜置兩小時後離心全自動血生化分析檢測肝功、脂代謝指標，取完整肝臟、胰腺、脂肪仔細觀察肉眼形態，放入生理鹽水中洗淨血液並用濾紙吸乾，稱溼重計算臟器指數，適當組織於10%的多聚甲醛中固定，以石蠟包埋，連續切片，he染色鏡下觀察肝臟組織病理學改變。

本發明中，一種由高脂高糖飲食與玉米油灌胃致大鼠代謝性綜合症的模型建立詳述如下：

（1）體重變化每7天定期監測體重。

（2）b超檢測大鼠灌胃至第70天，每組隨機抽取4隻大鼠，動物房備皮後送至遵義市第一人民醫院行彩色超聲檢查，檢查由主治醫師進行並報告結果。結果包括有無脂肪肝及肝斜徑，肝斜徑測量方法如下：參考《超聲醫學》第六版，2014，388。實驗大鼠10%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉後取仰臥位，以肝右靜脈和肝中靜脈匯入下腔靜脈的右肋緣下肝臟測量肝臟右葉為標準測量切面測量。測量位置為：測量點分別置於肝右葉前、後緣之肝包膜處，測量其最大垂直距離即為肝斜徑。

（3）肝臟視覺檢查剖殺大鼠時，開腹後行肉眼觀察肝臟大體形態、大小，顏色，食指、中指併攏，以指腹觸摸感受肝臟質地，取血後取肝臟觸摸肝臟切面。與對照組比較，普通飲食組低、中劑量組肝臟大小無肉眼可見區別，肝臟呈深紅色，質軟，肝韌帶附近無明顯脂肪組織，高劑量則呈現出輕度包膜緊張，切面輕微油膩感。

（4）臟器係數灌胃飼養90天後隔夜空腹稱重後麻醉大取完整肝臟於生理鹽水中洗淨，用濾紙擦乾稱重並計算肝體指數。肝臟係數=肝溼重/末次體重×100%

（5）空腹血糖水平實驗開始後，於第0天、30天、60天、90天定期檢測空腹血糖水平（血糖儀檢測尾靜脈血）。

（6）口服葡萄糖耐量試驗(oralglueosetolerancetest，ogtt)於實驗開始第90天對大鼠禁12h後，按2mg/kg劑量灌胃,給予50%葡萄糖溶液，分別於葡萄糖負荷後0min，15min，30min，60min，120min採血用血糖分析儀測定0min，15min，30min，60min，120min葡萄糖水平，繪製ogtt曲線。

（7）胰島素耐量試驗(insulintolerancetest，itt)於實驗開始第90天對大鼠禁食12h後，按0.75iu/kg劑量腹腔注射方式給予生物合成胰島素，於胰島素注射後0min，15min，30min，60min，120min尾靜脈採血。利用血糖分析儀測定0min，15min，30min，60min，120min的血糖水平。計算胰島素注射後各時間點血糖值相對於注射前的血糖值的比率。

（8）組織病理學改變取肝臟、胰腺、脂肪組織於10%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、連續石蠟切片，蘇木精染色並用中性樹脂封片在在光鏡下觀察組織病理學改變。

代謝性綜合症模型建造成功的標準：

2型糖尿病動物模型建造成功的標準：實驗性嚙齒類大、小鼠2型糖尿病動物模型血糖值的確立標準各文獻報導不一，近年來通過國內外學者基本傾向於認定空腹或非空腹血糖值>11.1mmoll或>16.7mmoll,還要伴有胰島素抵抗等2型糖尿病特徵,通過灌胃葡萄糖耐量試驗,依據空腹血糖和葡萄糖負荷結果來判斷。肥胖的模型建立成功主要體現在體重和血脂，脂肪重量上。實驗性嚙齒類大、小鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功的金標準為肝臟細肝臟細胞有脂肪泡大面積的脂肪樣變性。

統計學方法數據錄入spss18.0進行統計分析，結果描述以均數±標準差表示，組間比較採用單因素方差分析，有差異再用snk法進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05,p<0.05表示差異有統計學意義。

結果分析

（1）一般情況：實驗過程中c組大鼠精神狀態，飲水攝食正常，活動靈敏，皮毛潔白，墊料5天更換一次；ch組飲水攝食變化不明顯，實驗約90天，行動稍顯遲緩，皮毛逐漸泛黃，失去光澤。墊料易潮溼，平均3天更換一次。

（2）體重：在1周、4周、8周、12周、13周體重均無統計學差異，隨著時間變化造模組體重均大於對照組的趨勢。

（3）b超結果本發明b超超聲結果顯示，對照組沒有發現明顯的強回聲區域，提示沒有脂肪肝形成。造模組發現有明顯的回聲區域，提示有脂肪肝形成。

（4）肝臟視覺檢查剖殺大鼠時，開腹後行肉眼觀察肝臟大體形態、大小，顏色，食指、中指併攏，以指腹觸摸感受肝臟質地，取血後取肝臟觸摸肝臟切面。與對照組比較，普通飲食組低、中劑量組肝臟大小無肉眼可見區別，肝臟呈深紅色，質軟，肝韌帶附近無明顯脂肪組織，高劑量則呈現出輕度包膜緊張，切面輕微油膩感。

（5）臟器係數造模組肝體指數稍大於對照組。卻無統計學差異。

（6）肝功變化區腹主動脈全血靜置兩小時離心取上清液於遵義醫學院附屬醫院檢驗科全自動生化分析儀做肝功能檢測。

（7）空腹血糖水平：在第0月、1月、2月空腹血糖水平無統計學差異；第90天、100天、110天、120天ch組空腹血糖水平均大於c組（p＜0.05）；90天c組血糖水平（6.32±0.56mmol/l），ch組血糖水平（9.05±0.81mmol/l）；100天c組血糖水平（6.38±0.72mmol/l），ch組血糖水平（10.35±0.86mmol/l）；110天c組血糖水平（6.56±0.91mmol/l），ch組血糖水平（11.25±1.29mmol/l）；120天c組血糖水平（6.32±0.65mmol/l），ch組血糖水平（11.93±0.85mmol/l）。從110天開始，結合下述ogtt實驗結果，可以認為糖尿病動物模型造模成功。

（8）ogtt：灌胃葡萄糖後，兩組大鼠血糖值均顯著升高。與c組比較，ch組大鼠糖耐量曲線明顯上抬，曲線下面積顯著增加；ch組大鼠出現糖耐量異常。如圖1所示。

（9）itt:腹腔注射胰島素後，各組大鼠血糖水平有不同程度降低。與c組比較，ch組大鼠胰島素耐量曲線下面積顯著增加。胰島素耐量異常，如圖2所示。

（6）組織病理學改變：肝臟組織he染色鏡下觀察組織病理學改變時發現，對照組對照組匯管區無明顯炎性細胞浸潤，細胞間極少量充血，未發現明顯的脂肪病變，而造模組可發現明顯大泡性脂肪變肝細胞逐漸增多；如圖4。對照組胰腺組織細胞胞質緊密，排列整齊，細胞未見明顯水腫、壞死等病變；造模組胰腺組織細胞胞質疏鬆，出現不同程度的細胞水腫、壞死，胰腺細胞發現淋巴細胞浸潤，胰島細胞數減少；如圖7所示。，可以看出，造模組的細胞比較飽滿，對照組脂肪組織的細胞面積小於造模組細胞面積；如圖8所示。

（7）對脂肪組織鏡下細胞計數發現，對照組平均鏡下細胞計數明顯的大於對造模組，說明對照組的細胞面積和體積是小於造模組的。

本發明實驗為一種由高脂高糖飲食與玉米油灌胃致大鼠代謝性綜合症的模型建立，與人群肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等代謝綜合症的發生、發展較為接近。且實驗代謝性綜合症相關症狀和機體內環境改變也與人類相似，動物模型穩定性較好，更有助於代謝性綜合症機制及藥物治療研究。實驗對象選擇sd大鼠，種屬純正，是動物實驗中最為常見的大鼠類別，該動物模型可向外界提供一定的參考。

應當指出，綜上所述僅是本發明的優選實驗方法，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本實驗原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。