一種提高植物耐鹽性能的方法
2023-06-07 00:48:26 2
專利名稱：一種提高植物耐鹽性能的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高植物耐鹽性能的方法。
背景技術：
海藻糖(Trehalose)是由兩個葡萄糖分子以a，a，1-1糖苷鍵結合的非還原性雙糖，在自然界中廣泛分布於藻類，細菌，真菌，昆蟲，無脊椎動物和酵母中，在休眠細胞、孢子和菌核中的含量尤其高。海藻糖是一種應激代謝物，它賦予生物體抵抗乾燥、乾旱、寒冷、高溫以及氧自由基等惡劣環境的能力，對各種不同生物的抗逆耐受性起著重要作用。例如在高溫和乾燥條件下，酵母(Saccharomyces cerevisiea)細胞合成海藻糖以抵抗逆境的脅迫，其合成量與抗逆能力呈正比關係。此外已經證明外加的海藻糖也能保護乾燥狀態下的酶、蛋白質和細胞膜。海藻糖這些獨特的生物學特性使其在醫藥、食品、化妝品、農業等方面具有廣闊的應用前景。而且隨著對其研究的不斷深入，發現海藻糖的功能還遠不止這些。因此自上世紀90年代以來，越來越多的學者開始關注這一奇妙的雙糖。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種提高植物耐鹽性能的方法，通過海藻糖水解酶基因AtTRE特異性高效沉默載體的克隆，利用花序滴浸，農桿菌介導轉化的方法，降低了植物中海藻糖水解酶基因AtTRE的表達，從而提高植物耐鹽性能。
海藻糖的代謝途徑在細菌和酵母中這一途徑已被闡明。大腸桿菌(Escherichia coli)中由滲透壓引起的海藻糖的合成由otsA基因編碼的海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，再經otsB基因編碼的海藻糖磷酸酯酶脫磷酸後生成海藻糖。在大多植物，真菌，動物和細菌中海藻糖的分解代謝是通過海藻糖酶進行的，海藻糖酶可以將一個海藻糖分子水解成兩個分子的葡萄糖。
RNA幹涉(RNAi)技術是近年來發展的用於基因沉默的一種技術，目前被廣泛應用於基因功能研究，基因工程，基因表達調控等方面。RNAi是真核生物體中普遍存在的一種對RNA進行轉錄後降解的機制，是生物體調控內源基因表達，阻抑外源遺傳物質的侵入，抵禦病毒入侵，抑制體內轉座子頻繁轉座的防禦性機制。機體通過dsRNA或莖環結構的剪切形成小分子RNA，最終利用小分子RNA與靶基因的mRNA特定區發生互補配對，使mRNA發生翻譯抑制或者使mRNA發生剪切，導致基因表達量的下降。
脫落酸ABA是五大植物激素之一，它在植物的生長發育中發揮著重要的作用。絕大多數植物在受到脅迫時都會在短期內合成ABA，這些由ABA介導的逆境反應對於植物的生存和生產至關重要。ABA通過和ABA應答元件(ABRE)或ABA應答覆合體相互作用，實現對目的基因脅迫誘導的。這些順式作用元件都含有一段一致序列(C/T)ACGTGGC，存在於各種ABA誘導或脅迫誘導的基因。RD29A和RD29B受乾旱，低溫，高鹽，或外源ABA處理誘導表達。RD29A至少含有兩個順勢作用元件，ABRE一個參與ABA相關的乾旱應答過程，另一個DRE受到滲透調節，並且DRE和ABRE之間具有相互作用，是偶聯元件。RD29B含有至少一個參與ABA應答的順勢元件，受誘導比較遲緩。
植物在生長發育過程中，能夠依據代謝的需求，「感知」並改變碳類物質代謝。這種敏感性使植物在碳水化合物匱乏時能夠及時調整光合作用。葡萄糖是碳代謝的關鍵分子，也是信號轉導途徑中的初始信號分子。高濃度的葡萄糖對植物的萌發，和幼苗的早期生長具有嚴重的負面影響。己糖激酶(HXK)是葡萄糖的感受器，能夠磷酸化葡萄糖，磷酸化葡萄糖作為信使物質，調節糖感應的下遊途徑。海藻糖的前體海藻糖-6-磷酸能夠可逆性的抑制己糖激酶(HXK)的活性。實驗證明，利用基因工程手段，過表達海藻糖合成酶，可使轉基因苗缺失對葡萄糖的敏感性，轉基因苗在含葡萄糖的培養基上仍可正常萌發生長，野生型幼苗在葡萄糖培養基上則無法正常生長。這說明海藻糖和海藻糖-6-磷酸，在植物的葡萄糖感應調節中起著重要的作用，海藻糖的積累可以增強植物在發育早期對葡萄糖的承受能力。
根據上述機理，本發明採用如下技術方案一種提高植物耐鹽性能的方法，其特徵在於該方法具有如下步驟i.選定目標植物，根據該植物的核苷酸序列AtTER和啟動子核苷酸序列RD29A，RD29B，構建基因沉默載體RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27；ii.採用Floral dip法轉化法，將上述基因沉默載體RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27轉化到目標植物的花序上，培養出轉基因植株；iii.用卡那黴素篩選上述轉基因植株。
上述的構建基因沉默載體的方法具體為
a.根據目標植物的AtTER的編碼區核苷酸序列，選擇不含保守區段的位於AtTRE全長cDNA的5』端，長度約500bp，用Primer Premier軟體設計兩對引物ATREP1、ATREP2和ATREP3、ATREP4；b.根據目標植物的RD29A，RD29B啟動子核苷酸序列，用Primer Premier軟體設計兩對引物RD29AP1、RD29AP2和RD29BP1、RD29BP2；c.PCR反應以第一對引物ATREP1、ATREP2進行高保真PCR反應，用PCR產物快速膠回收試劑盒回收PCR產物；d.酶切反應KpnI酶切上述的PCR回收產物，酶切完全後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物，即K片斷，同時用KpnI酶切pHANNIBAL載體，酶切完全後用SAP去磷酸反應，然後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物；e.連接反應取適量的上述酶切產物，用T4DNA連接酶16℃連接過夜；f.檢測連接產物轉化大腸桿菌DH5a，塗LB固體培養基平板(含50mg/L Kana)，37℃培養約16小時，挑單克隆，擴大培養後提質粒，用鑑定引物進行PCR檢測，用限制性內切酶PstI酶切檢測AtTRE插入片段，驗證K片斷是否正確到pHANNIBAL載體上，選取陽性克隆測序；g.第二片斷(C片斷)的插入以第二對引物ATREP3、ATREP4限制性內切酶PstI重複上述反應；h.將經檢測證明該基因的K片斷和C片斷以正確方向插入到pHANNIBAL載體上的重組子AtTRE-pHANNIBAL，轉化DH5a，提質粒檢測後-80℃保存質粒及菌種；i.啟動子的替換分別以攜帶限制性內切酶StuI，Xhol位點的引物，限制性內切酶StuI，Xhol重複上述反應；j.基因沉默載體的構建NotI酶切AtTRE-pHANNIBAL和pART27載體，回收酶切產物，進行連接反應。NotI酶切AtTRE-pHANNIBAL產生兩個片斷，如果K和C片斷都已正確插入，大片斷長度約為3600bp，回收該大片斷進行連接反應；k.連接產物轉化大腸桿菌DH5a，擴大培養(Kana、Spec抗性)，提質粒，進行PCR、酶切檢測，回收PCR及酶切產物，測序驗證K、C片斷是否已正確插入pART27載體中，檢測外源片斷插入正確無誤的質粒分別稱為RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27質粒，保存菌種。
上述的Floral dip法培養出轉基因植株的方法具體為a.農桿菌的轉化將構建好的基因沉默載體RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27質粒通過電擊轉化導入農桿菌GV3101；b.轉化用農桿菌菌液的製備挑取農桿菌GV3101單克隆，50ml液體LB培養基中擴大培養(加相應的抗生素)，28℃，250rpm震蕩培養至菌液OD600為0.8左右，倒入大離心管中，3000rpm離心10分鐘，棄上清，沉澱用滲透培養基重懸，最終菌液OD600在0.8～1.0左右，即可用於轉化臨轉化前在農桿菌菌液中加入Silwet L-77(300μl/L)；c.轉化用槍頭將菌液滴在目標植物的花序上，用保鮮膜封好保持溼度，25℃暗培養過夜後，再移至溫室正常培養。
本發明首次利用基因工程手段，構建受ABA誘導的海藻糖水解酶基因AtTRE的特異性高效沉默基因載體，通過農桿菌介導法，用卡那黴素作為篩選標記成功將沉默基因載體轉化目標植物。逆境下成功地下調了海藻糖水解酶基因AtTRE的表達，改變了植物體內海藻糖代謝狀況，達到了提高植物耐鹽性能的目的。本方法有望進一步推廣應用於農作物，經濟作物的品種改良，因而本發明有一定的理論意義和科研應用價值。
圖1為RD29A基因啟動子調控的重組載體RD29A::AtTRE-pART27；圖2為RD29B基因啟動子調控的重組載體RD29B::AtTRE-pART27；圖3為35S啟動子調控的重組載體35S:AtTRE-pART27；圖4為300mMNaCl高鹽培養基處理轉基因擬南芥RD29B::AtTRE-pART27和RD29A::AtTRE-pART27與轉入空載體的擬南芥生長狀況的比較；圖5為對照擬南芥在300mMNaCl處理2天內，海藻糖水解酶基因相對持家基因UBQ10的表達量的變化；圖6為轉基因苗RD29B::AtTRE-pART27在300mMNaCl處理2天內，海藻糖水解酶基因相對持家基因UBQ10的表達量的變化；圖7為轉基因苗RD29A::AtTRE-pART27在300mMNaCl處理2天內，海藻糖水解酶基因相對持家基因UBQ10的表達量的變化；圖8為轉基因擬南芥RD29A::AtTRE-pART27在300mMNaCl處理2天內，海藻糖水解酶基因相對持家基因UBQ10的表達量的變化；
圖9為轉基因擬南芥RD29B::AtTRE-pART27在300mMNaCl處理2天內，海藻糖水解酶基因相對持家基因UBQ10的表達量的變化；圖10對照擬南芥在300mMNaCl處理2天內，海藻糖水解酶基因相對持家基因UBQ10的表達量的變化；圖11為Validamycin A(海藻糖酶抑制劑)處理的對照擬南芥在250mMNaCl高鹽培養基上生長狀況。BII-4轉基因苗RD29B::AtTRE-pART27；w(+)對照擬南芥(培養基添加ValidamycinA)；w(-)對照擬南芥(培養基沒有添加ValidamycinA)。
圖12為轉基因苗和對照擬南芥在6％葡萄糖培養基上的生長狀況的比較。BII-4轉基因苗RD29B::AtTRE-pART27(培養基中添加葡萄糖)；w(+)對照擬南芥(培養基中添加葡萄糖)；w(-)對照擬南芥(普通培養基)。
具體實施例方式實施例一本實施例以擬南芥為目標植物，具體步驟如下(一)基因沉默載體的構建應用NTI VECTOR軟體分析擬南芥AtTER的編碼區核苷酸序列，選擇不含保守區段、長度合適的一段位於AtTRE全長cDNA的5』端，長度約500bp，用Primer Premier軟體設計兩對引物，如下ATREP15′ggggtaccatgttggactcggacaca3′ATREP25′ggggtaccttgatgacccaataaga3′ATREP35′ccatcgatatgttggactcggacaca3′ATREP45′gctctagattgatgacccaataaga3′應用NTI VECTOR軟體分析擬南芥基因RD29A，RD29B啟動子核苷酸序列，用Primer Premier軟體設計兩對引物，如下RD29AP15′aaggcctcgttcttgacatcattca3′RD29AP25′gcatatttgtgagtaaaacagagg3′RD29BP15′aaggcctccgtcttgggagctcaga3′RD29BP25′cgtgtctctgagaaaatcagaa3′載體構建具體步驟如下A、PCR反應以第一對引物進行高保真PCR反應，用PCR產物快速膠回收試劑盒回收PCR產物；
B、酶切反應KpnI酶切PCR回收產物，酶切完全後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物(K片斷)，同時用KpnI酶切pHANNIBAL載體，酶切完全後用SAP去磷酸反應，然後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物；C、連接反應取適量的酶切產物，用T4DNA連接酶16℃連接過夜；D、檢測連接產物轉化大腸桿菌DH5a，塗LB固體培養基平板(含50mg/L Kana)，37℃培養約16小時，挑單克隆，擴大培養後提質粒，用鑑定引物進行PCR檢測，用限制性內切酶PstI酶切檢測AtTRE插入片段，驗證K片斷是否正確到pHANNIBAL載體上，選取陽性克隆測序；E、第二片斷(C片斷)的插入以第二對引物、限制性內切酶PstI重複上述反應；F、將經檢測證明該基因的K片斷和C片斷以正確方向插入到pHANNIBAL載體上的重組子(AtTRE-pHANNIBAL)轉化DH5a，提質粒檢測後-80℃保存質粒及菌種；G、啟動子的替換分別以攜帶限制性內切酶StuI，Xhol位點的引物，限制性內切酶StuI，Xhol重複上述反應；H、基因沉默載體的構建NotI酶切AtTRE-pHANNIBAL和pART27載體，回收酶切產物，進行連接反應。NotI酶切AtTRE-pHANNIBAL產生兩個片斷，如果K和C片斷都已正確插入，大片斷長度約為3600bp，回收該大片斷進行連接反應；I、連接產物轉化大腸桿菌DH5a，擴大培養(Kana、Spec抗性)，提質粒，進行PCR、酶切檢測，回收PCR及酶切產物，測序驗證K、C片斷是否已正確插入pART27載體中，檢測外源片斷插入正確無誤的質粒分別稱為RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27質粒，保存菌種。結構示意圖見圖1、圖2和圖3。
(二)Floral dip法轉化擬南芥1.農桿菌的轉化將構建好的RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27質粒通過電擊轉化導入農桿菌GV3101；2.轉化用農桿菌菌液的製備挑取農桿菌GV3101單克隆，50ml液體LB培養基中擴大培養(加相應的抗生素)，28℃，250rpm震蕩培養至菌液OD600為0.8左右，倒入大離心管中，3000rpm離心10分鐘，棄上清，沉澱用滲透培養基重懸，最終菌液OD600在0.8～1.0左右，即可用於轉化臨轉化前在農桿菌菌液中加入SilwetL-77(300μl/L)。
3.轉化用槍頭將菌液滴在擬南芥花序上，用保鮮膜封好保持溼度，25℃暗培養過夜後，再移至溫室正常培養。
(三)卡那黴素篩選轉基因植株種子放於1.5mlEP管中，開口晾乾，除去果莢皮等雜質，只留種子。擬南芥種子滅菌後種於含50mg/L Kana的1/2MS培養基上，篩選轉基因苗。擬南芥要放在23℃光照培養箱中，三天發芽，一個月後移到23℃培養室。
(四)轉基因植株的抗逆表型1.轉入空載體的對照擬南芥可耐受的最高鹽濃度為200mMNaCl，在300mMNaCl培養條件下，生長受到嚴重阻滯，無法完成整個生命周期。觀察後，轉基因植株在300mMNaCl培養條件下生長較為正常，可完成整個生命周期。在350mMNaCl培養條件下生長受到阻滯，但仍可進行短期營養生長，抽苔開花。因此，轉基因植株可耐受的最高鹽濃度提高了100mM，耐鹽能力得到極大提高。(參見圖4)2.高濃度的葡萄糖對植物的萌發，和幼苗的早期生長具有負面影響。海藻糖和海藻糖-6-磷酸，在植物的葡萄糖感應調節中起著重要的作用，海藻糖的積累可以增強植物在發育早期對葡萄糖的承受能力。本實施例中轉入空載體的對照擬南芥在葡萄糖濃度為6％培養條件下生長受到嚴重阻滯，無法完成整個生命周期。相比較來看，轉基因植株在同等培養條件下則可正常生長(參見圖11)現象說明轉基因苗對葡萄糖的敏感性有所降低，證實海藻糖水解酶基因的確被有效沉默，海藻糖得到較高水平的積累。
3.轉入空載體的對照擬南芥在不含有Validamycin A(海藻糖水解酶抑制劑)200μg/ml的250mMNaCl高鹽培養條件下根本無法生長，三天內即死亡；在含有Validamycin A(海藻糖水解酶抑制劑)200μg/ml的250mMNaCl高鹽培養條件下生長受到阻滯，但仍可進行短期營養生長，該情況類似強啟動了35S調控的轉基因植株的生理表型；轉基因苗在不含有Validamycin A(海藻糖水解酶抑制劑)200μg/ml的250mMNaCl高鹽培養條件下生長較為正常(見圖10)。轉基因苗在高鹽培養基上的生長狀況，和對照擬南芥在Validamycin A(海藻糖水解酶抑制劑)處理的高鹽培養基上的生長狀況極為相似，進一步驗證了轉基因苗中的海藻糖水解酶基因被沉默，海藻糖積累事件。
實施例二檢測高鹽逆境下轉基因苗RD29A::AtTRE-PART27海藻糖水解酶基因的表達(1)材料處理將生長3周的對照擬南芥和轉基因苗RD29A::AtTRE-PART27移栽至300mMNaCl培養基，分0h，1h，2h，5h，12h，1d，2d各時間點取材各5～10棵，-80℃保存。
(2)抽取各個時間點的材料的總RNA(3)測OD值後，精確吸取0.5ug總RNA反轉錄(4)以cDNA為模板，半定量PCR，引物為AtTREp8 5′ggagaacgaagaagtcagagaatg3′AtTREp9 5′cctttggcggtagtgaacatttg3′UBQ10rp15′caagatccaagacaaagagggt3′UBQ10rp25′ggataccctctttgtcctggat 3′(5)凝膠電泳(6)結果參見圖7(7)以cDNA為模板，螢光定量PCR，引物同上。
(8)結果參見圖8實施例三檢測高鹽逆境下轉基因苗RD29B::AtTRE-PART27海藻糖水解酶基因的表達(1)材料處理將生長3周的對照擬南芥和RD29B::AtTRE-PART27移栽至300mMNaCl培養基，分0h，1h，2h，5h，12h，1d，2d各時間點取材各5～10棵，-80℃保存。
(2)抽取各個時間點的材料的總RNA。
(3)測OD值後，精確吸取0.5ug總RNA反轉錄(4)以cDNA為模板，半定量PCR，引物為AtTREp8 5′ggagaacgaagaagtcagagaatg3′AtTREp9 5′cctttggcggtagtgaacatttg3′UBQ10rp15′caagatccaagacaaagagggt3′UBQ10rp25′ggataccctctttgtcctggat3′(5)凝膠電泳(6)結果參見圖6)(7)以cDNA為模板，螢光定量PCR，引物同上。
(8)結果參見圖9
選用擬南芥內源的UBQ10基因作為內參，與對照擬南芥相比，AtTRE基因的表達明顯被抑制，說明在轉基因苗裡，本發明構建的沉默載體有效的發揮了沉默作用，從分子水平上驗證並解釋了轉基因苗的耐鹽性。在高鹽培養條件下，RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27兩種轉基因苗中AtTRE基因的表達也存在差異。RD29A::AtTRE-pART27轉基因苗高鹽處理1小時，AtTRE基因表達即出現下降，而RD29B::AtTRE-pART27轉基因苗在高鹽處理5小時左右，AtTRE基因表達才出現下降。這也驗證了前人對兩種ABA應答型啟動子研究的結果RD29A基因的表達是ABA非依賴的，而RD29B基因的表達是ABA依賴的。
綜上所述，本發明首次利用基因工程手段，構建受ABA誘導的海藻糖水解酶基因AtTRE的特異性高效沉默載體，通過農桿菌介導法，用卡那黴素作為篩選標記成功轉化擬南芥。逆境下成功地下調了海藻糖水解酶基因AtTRE的表達，改變了植物體內海藻糖代謝狀況，培育出耐鹽的新型擬南芥。本方法有望進一步推廣應用於農作物，經濟作物的品種改良，因而本發明有一定的理論意義和科研應用價值。
序列表110上海大學120一種提高植物耐鹽性能的方法16019210121126212DNA213人工序列(artificial)220
221misc_feature223引物4001ggggtaccat gttggactcg gacaca262102
21125212DNA213人工序列(artificial)220
221misc_feature223引物4002ggggtacctt gatgacccaa taaga25210321126212DNA213人工序列(artificial)220
221misc_feature223引物4003ccatcgatat gttggactcg gacaca26210421125212DNA213人工序列(artificial)220
221misc_feature223引物4004gctctagatt gatgacccaa taaga252105
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211503212DNA213擬南芥220
40017actcggacac agacacggac tcaggtcctg tggttgcaac aaccaaactc gtcactttcc60tccagcgtgt gcagcacacg gcacttcgat cataccctaa aaaacaaacg cctgatccca120aatcctacat tgatctatct ctcaaacgtc cctacagtct ctccaccatc gaatcagcct180tcgatgatct cacgagcgag tcacatgacc agccagtgcc agtggagacg cttgaaaagt240tcgtcaagga atattttgac ggtgcagggg aggatctgct gcaccacgaa ccagtagatt300tcgtctcaga tccctccggc ttcctctcca acgtggagaa cgaagaagtc agagaatggg360cgcgtgaggt acacggtctt tggagaaatc tgagctgcag agtctctgac tcagtaagag400agtctgccga ccggcacacg cttctaccgt tgccggaacc ggttatcatt cccggttcga460gattcagaga agtctattac tgggattctt attgggtcat caa 50321018211452212DNA213擬南芥220
40018tcgttctt gacatcattc aattttaatt ttacgtataa aataaaagat catacctatt 58agaacgatta aggagaaata caattcgaat gagaaggatg tgccgtttgt 108tataataaac agccacacga cgtaaacgta aaatgaccac atgatgggcc 158aatagacatg gaccgactac taataatagt aagttacatt ttaggatgga 208ataaatatca taccgacatc agtttgaaag aaaagggaaa aaaagaaaaa 258ataaataaaa gatatactac cgacatgagt tccaaaaagc aaaaaaaaag 308atcaagccga cacagacacg cgtagagagc aaaatgactt tgacgtcaca 358ccacgaaaac agacgcttca tacgtgtccc tttatctctc tcagtctctc 408tataaactta gtgagaccct cctctgtttt actcacaaat atgc 452
21019211556212DNA213擬南芥220
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1.一種提高植物耐鹽性能的方法，其特徵在於該方法具有如下步驟a.選定目標植物，根據該植物的核苷酸序列AtTER和啟動子核苷酸序列RD29A，RD29B，構建基因沉默載體RD29AAtTRE-pART27和RD29BAtTRE-pART27；b.採用Floral dip法轉化法，將上述基因沉默載體RD29AAtTRE-pART27和RD29BAtTRE-pART27轉化到目標植物的花序上，培養出轉基因植株；c.用卡那黴素篩選上述轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的一種提高植物耐鹽性能的方法，其特徵在於所述的構建基因沉默載體的方法具體為a.根據目標植物的AtTER的編碼區核苷酸序列，選擇不含保守區段的位於AtTRE全長cDNA的5』端，長度約500bp，用Primer Premier軟體設計兩對引物ATREP1、ATREP2和ATREP3、ATREP4；b.根據目標植物的RD29A，RD29B啟動子核苷酸序列，用Primer Premier軟體設計兩對引物RD29AP1、RD29AP2和RD29BP1、RD29BP2；c.PCR反應以第一對引物ATREP1、ATREP2進行高保真PCR反應，用PCR產物快速膠回收試劑盒回收PCR產物；d.酶切反應KpnI酶切上述的PCR回收產物，酶切完全後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物，即K片斷，同時用KpnI酶切pHANNIBAL載體，酶切完全後用SAP去磷酸反應，然後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物；e.連接反應取適量的上述酶切產物，用T4DNA連接酶16℃連接過夜；f.檢測連接產物轉化大腸桿菌DH5a，塗LB固體培養基平板(含50mg/L Kana)，37℃培養約16小時，挑單克隆，擴大培養後提質粒，用鑑定引物進行PCR檢測，用限制性內切酶PstI酶切檢測AtTRE插入片段，驗證K片斷是否正確到pHANNIBAL載體上，選取陽性克隆測序；g.第二片斷(C片斷)的插入以第二對引物ATREP3、ATREP4限制性內切酶PstI重複上述反應；h.將經檢測證明該基因的K片斷和C片斷以正確方向插入到pHANNIBAL載體上的重組子AtTRE-pHANNIBAL，轉化DH5a，提質粒檢測後-80℃保存質粒及菌種；i.啟動子的替換分別以攜帶限制性內切酶StuI，Xhol位點的引物，限制性內切酶StuI，Xhol重複上述反應；j.基因沉默載體的構建NotI酶切AtTRE-pHANNIBAL和pART27載體，回收酶切產物，進行連接反應。NotI酶切AtTRE-pHANNIBAL產生兩個片斷，如果K和C片斷都已正確插入，大片斷長度約為3600bp，回收該大片斷進行連接反應；k.連接產物轉化大腸桿菌DH5a，擴大培養(Kana、Spec抗性)，提質粒，進行PCR、酶切檢測，回收PCR及酶切產物，測序驗證K、C片斷是否已正確插入pART27載體中，檢測外源片斷插入正確無誤的質粒分別稱為RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27質粒，保存菌種。
3.根據權利要求1所述的一種提高植物耐鹽性能的方法，其特徵在於所述的Floraldip法培養出轉基因植株的方法具體為a.農桿菌的轉化將構建好的基因沉默載體RD29A::AtTRE-pART27和RD29B::AtTRE-pART27質粒通過電擊轉化導入農桿菌GV3101；b.2轉化用農桿菌菌液的製備挑取農桿菌GV3101單克隆，50ml液體LB培養基中擴大培養(加相應的抗生素)，28℃，250rpm震蕩培養至菌液OD600為0.8左右，倒入大離心管中，3000rpm離心10分鐘，棄上清，沉澱用滲透培養基重懸，最終菌液OD600在0.8～1.0左右，即可用於轉化臨轉化前在農桿菌菌液中加入Silwet L-77(300μl/L)；c.轉化用槍頭將菌液滴在目標植物的花序上，用保鮮膜封好保持溼度，25℃暗培養過夜後，再移至溫室正常培養。
全文摘要
本發明涉及一種提高植物耐鹽性能的方法。本發明首次利用基因工程手段，構建受ABA誘導的海藻糖水解酶基因AtTRE的特異性高效沉默載體，通過農桿菌介導法，用卡那黴素作為篩選標記成功轉化擬南芥。逆境下成功地下調了海藻糖水解酶基因AtTRE的表達，改變了植物體內海藻糖代謝狀況，培育出耐鹽的新型擬南芥。本方法有望進一步推廣應用於農作物，經濟作物的品種改良，因而本發明有一定的理論意義和科研應用價值。
文檔編號C12N15/70GK1869240SQ20061002698
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月26日 優先權日2006年5月26日
發明者宋任濤, 許政暟, 趙雅瑞 申請人:上海大學