賦予在鹽和氧化條件下生長的植物調節的生長速率和生物量的核苷酸序列及相應多肽的製作方法

2023-06-07 00:41:16

專利名稱：賦予在鹽和氧化條件下生長的植物調節的生長速率和生物量的核苷酸序列及相應多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及分離的核酸分子及其編碼的相應多肽，所述核酸分子和多肽能夠在鹽 和/或氧化脅迫條件下增強植物生長。本發明還涉及核酸分子和多肽製備與相似條件下生 長的野生型植物相比，在鹽和/或氧化脅迫條件下具有改進的生長速率、營養生長、幼苗活 力和/或生物量的轉基因植物、植物細胞、植物材料或植物種子的用途。
背景技術：
可以使用分子技術獲得用於農業、園藝、生物量轉化和其他工業(例如造紙工業， 植物作為蛋白質或其他化合物的生產工廠)的明確改進的植物。例如，在鹽和/或氧化脅 迫條件下增強植物生長可獲得巨大的農業價值。鹽度多種具有農業重要性的植物物種顯示對鹽和/或氧化脅迫條件的顯著敏感性。在 鹽濃度超過相對低的閾值後，許多植物遭受矮化的生長、壞死和死亡，這導致總體矮化的外 觀，和植物材料、種子、果實和其它有價值產物產量的降低。就生理學而言，用鹽度攻擊的植 物經歷離子和水體內穩態的破壞，代謝的抑制，和對細胞膜的損害，這導致發育停止和細胞 死亡(Huh 等(2002) Plant J, 29 (5) :649_59)在世界上最重要的許多生產性農業區域中，農業活動自身導致提高的水鹽度和土 壤鹽度，這威脅它們的持續生產力。一個例子是具有豐富陽光的乾旱區域中的作物灌溉。對 農田應用灌溉水後，所述灌溉水通過蒸發和蒸騰的過程被去除。儘管這些過程從土壤中去 除水，但是它們留下灌溉水中帶有的溶解鹽。因此，土壤和地下水鹽濃度隨時間而增加，使 得土地和淺表地下水變鹹，進而損害作物。除了人活動以外，天然的地質學過程產生了大量在非鹽時會非常高產的鹽田。總 計約20%被灌溉的田地受鹽度的負面影響(Yamaguchi和Blumwald，2005，Trends in Plant Science，10 =615-620) 0由於這些原因及其他，所以鑑定下述基因具有巨大的興趣和重要 性，所述基因賦予改進的鹽耐性特徵，從而使得能夠產生在鹽條件下具有增強的生長和/ 或生產力特徵的轉基因植物(例如作物植物)。儘管具有這一進步，但是目前仍然非常需要下述普遍適用的方法，所述方法促進 森林或農業植物生長，以適應取決於特定環境條件的具體需要。為此，本發明涉及有利地改 造植物對鹽的耐性，從而根據所搜尋的利益使多種作物的利益最大化，並且本發明的特徵 是在植物中表達重組的DNA分子。這些分子可來自植物自身，並簡單地以更高或更低的水 平表達，或者所述分子可以來自不同的植物物種。氧化脅迫植物進行固著的生活方式，因此通常注生活於它們的種子萌發的地方。因此，它們 可暴露於由於天氣、汙染和區域而導致的不良環境條件中。脅迫條件例如極端溫度、乾旱 和乾燥、鹽度、土壤養分含量、重金屬、UV輻射、汙染物例如臭氧和SO2、機械脅迫、強光和病原體攻擊對植物生長和發育具有巨大影響。這些類型的脅迫暴露誘導有毒氧物類(toxic oxygenspecies)形成，所述有毒氧物類在所有需氧細胞中產生，並且伴隨著細胞水平的氧 化損害。若干最近公開的報導表徵了非生物脅迫引起的有毒氧物類產生和隨後的氧化損 害(見 Larkindale 和 Knight (2002) ；Borsani 等(2001) ；Lee 等(2004) ；Aroca 等(2005)； Luna 等(2005) ；and Noctor 等(2002)。有毒氧物類被稱作活性氧物類(R0S)、活性氧中間產物(ROI)或活化的氧物類 (AOS)，並且是時部分還原或活化的氧衍生物。R0S/R0I/A0S包括以氧為中心的超氧化物 (O2)和羥基(·0Η)自由基，以及過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)和0Λ這些氧物類作為光 合作用、呼吸作用和光呼吸作用的反應副產物而產生，並且主要在葉綠體、線粒體、內質網、 微體(例如過氧化物酶體和乙醛酸循環體)、質膜和細胞壁中形成。儘管O2-和H2O2自身的 毒性相對低，但是它們的高毒性· OH的金屬依賴型轉化被認為是造成與這些分子有關的大 部分生物損傷的主要原因。氧化脅迫損傷細胞結構並影響細胞的代謝和分解代謝。膜脂通過R0S/R0I/A0S被 氧化，導致高分子量的、交聯的脂肪酸和磷脂的累積。對蛋白質的氧化攻擊導致位點特異性 胺基酸修飾、肽鏈的片段化、交聯的反應產物累積、改變的電荷和提高的蛋白酶解易感性， 這些均常常導致酶活性的消除。產生氧自由基的R0S/R0I/A0S (例如離子化輻射)也在DNA 的糖部分和鹼基部分中誘導大量損傷，所述損傷導致缺失、突變和其他致死的遺傳作用，例 如鹼基降解、單鏈斷裂和與蛋白質交聯。從形態學上，高水平ROS累積的不良影響證實為矮 化的生長和壞死損害。儘管能夠誘導損傷，但是R0S/R0I/A0S也是代謝和防禦通路的關鍵調節器，其發 揮信號發放(signaling)或第二信使分子的作用。例如，病原體誘導的R0S/R0I/A0S產生 在疾病抗性中是關鍵的，其中在三個不同的水平上涉及這些分子穿透抗性、高敏感度應答 (HR)和系統性獲得的抗性(Levine 等(1994) ；Lamb and Dixon(1997) ；Zhou 等(2000)； Aviv等(2002))。在穿透抗性中，R0S/R0I/A0S通過多酚類交聯強化細胞壁來發揮功能。對 高敏感度應答而言，H2O2是活性信號發放分子，其作用是劑量依賴型的。在高劑量下，H2O2 引起高敏感度細胞死亡，並因此將病原體限制於局部感染位點(Lamb和DiXOn(1997))，而 低劑量則阻斷細胞周期進程(Reichheld等(1999))和信號轉導二級壁分化(Potikha等 (1999))。最後，R0S/R0I/A0S分子通過在第一次病原體接種後系統性引發微小-HR而在廣 譜系統性獲得的疾病抗性中起作用。在導致氧化脅迫的信號轉導級聯放大中，水楊酸(SA)被鑑定為在多種脅迫條 件下介導R0S/R0I/A0S累積的重要信號發放分子，所述脅迫條件例如鹽和滲透壓脅迫 (Borsani 等(2001))、乾旱(Senaratna 等(2000))、熱(Dat 等(1998))、冷(Scott 等 (2004))、UV-光(Surplus等(1998))、百草枯(Kim等(2003))和針對不同病原體的疾病抗 性(Zhou等(2004))。高水平的SA誘導H2O2產生以及細胞死亡。SA-介導的R0S/R0I/A0S累積和基因表達需要的若干信號轉導組件已經表徵。例 如，SA誘導的I3R基因表達和疾病抗性需要NPRl (Cao等(1994))。edsl和eds5中的突變阻 斷SA-介導的信號發放並增強疾病易感性(Rusterucci等(2001))。多種植物物種中NahG 的過表達也阻抑SA-誘導的對非生物脅迫以及生物脅迫的應答(Delaney等(1994))。最 近，Scott和同事(2004)報導了冷凍處理在擬南芥(Arabidopsis)中誘導SA的累積，通過
7NahG的過表達降解SA增強了轉基因植物中的冷耐性。SA作為植物激素，也促進早期開花(Martinez等(2004))。多種水平的SA可在植 物生長和脅迫應答中起不同的作用。然而，大部分時間中，對高水平SA的提高的耐性似乎 是有益的，因為其降低了 SA累積的副作用，同時刺激SA介導的脅迫應答。類似地，NO能夠產生R0S/R0I/A0S，並且是一種植物信號發放分子，其涉及種子萌 發、氣孔關閉(Mata 和 Lamattina (2001) ；Desikan 等(2002))、開花時間(He 等(2004))、阻 抑細胞死亡的抗氧化反應(Beligni等(2002))和對生物和非生物脅迫條件的耐性(Mata 和Lamattina(2OOl))。儘管可以通過應用硝普納(sodium nitroprusside, SNP)模擬NO的 作用，但是植物中的內源NO產生由一氧化氮合酶的活性引起，所述一氧化氮合酶使用L-精 氨酸(Guo等(2003))以及硝酸鹽還原酶介導的反應(Desikan等(2002))。NO可與蛋白質 和膜中的氧化還原中心反應，從而引起細胞損傷並誘導細胞死亡。為了控制R0S/R0I/A0S分子的雙重性質，植物發育出複雜的調節系統，所述調節 系統涉及細胞中R0S/R0I/A0S的產生以及清除。在正常的生長和發育期間，該通路監測代 謝產生的R0S/R0I/A0S水平，並控制R0S/R0I/A0S清除通路的表達和活性。主要的R0S/R0I/ AOS清除機制包括超氧化物岐化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate perioxidase, APX)和過氧化氫酶(CAT)以及非酶組件例如抗壞血酸、α-生育酚和穀胱甘肽的作用。相信抗氧化的酶是預防氧化脅迫的關鍵性組件，部分因為用誘導這些酶表達的一 種脅迫形式預處理植物能夠提高對不同脅迫的耐性(交叉耐受MAllen (1995))。另外，針 對通過誘導R0S/R0I/A0S而發揮作用的除草劑的抗性所選擇的植物品系通常具有提高的 一種或多種這些抗氧化酶水平，並且也顯示交叉耐受(Gressel和Galun (1994))。植物發育和產量取決於植物通過信號發放或是清除通路來操控氧化脅迫的能力。 因此，改善植物抵抗氧化脅迫的能力或在經歷氧化脅迫後獲得更高程度交叉耐受的能力具 有顯著的農業價值。本發明的序列和方法提供了下述手段，通過所述手段能夠通過信號發 放或者清除通路改進對氧化脅迫的耐性。在人類文明歷史中人，和家養動物對食物和飼料流的可用性和可持續性已具有高 度優先級，並且展現於農業的起源。農學科學、農業、作物科學、園藝學和森林科學領域的專 家和研究人員甚至在今天仍持續地爭取尋找和產生具有提高的生長潛能的植物，以餵養越 來越多的世界人口並保證提供可再生的原材料。這些科學領域中強大的研究水平表明世界 上每種地理環境和氣候的領導人對提供合適的食物、飼料和能源來源所施加的重視水平。作物性能的控制已經通過選擇和植物育種常規地進行了數個世紀。然而育種過程 是既耗時又費力的。另外，對於各有關的植物物種必須特定地設計適當的育種程序。另一方面，在使用分子遺傳方法控制植物以提供更好的作物中獲得了長足的進 步。通過在植物中引入和表達重組的核酸分子，研究人員目前準備好了提供給社會下述植 物物種，所述植物物種被改造為即使在亞最優的地理和/或氣候環境下也能更有效地生長 和生產更多的產物。這些新的方法具有不局限於一個植物物種而是可應用於多個不同植物 物種的優點(Zhang 等(2004)Plant Physiol. 135 :615 ;Zhang 等(2001)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 98 12832)。發明概述本發明提供了與下述植物相關的方法和材料，所述植物對鹽度和/或氧化脅迫具有調節的耐性水平。例如，本發明提供了對鹽度和/或氧化脅迫具有提高的耐性水平的轉 基因植物和植物細胞，用於產生對鹽度和/或氧化脅迫具有提高的耐性水平的植物和植物 細胞的核酸，和用於製備對鹽度和/或氧化脅迫具有提高的耐性水平的植物和植物細胞的 方法。這類植物和植物細胞提供了在鹽和/或氧化脅迫條件下產生作物或植物而無矮化生 長和減少產率的機會。對鹽度和/或氧化脅迫的提高的耐性水平可用於在目前有較低生產 力的土地上產生可轉化為液體燃料或其他化學品的生物量和/或產生食物和飼料，導致可 耕土地的總體擴張。本文提供了產生植物和/或植物組織的方法。在一個方面中，方法包括培養包含 外源核酸的植物細胞。外源核酸包含與編碼多肽的核苷酸序列有效連接的調節區。使用由

圖1-6之一中所示胺基酸序列產生的HMM時，多肽胺基酸序列的隱蔽馬爾科夫模型(Hidden Markov Model,HMM) 二進位值(bit score)大於約30。植物和/或植物組織與不包含外源 核酸的對照植物對鹽度和/或氧化脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度和/或氧化脅迫的耐 性水平有差異。在一些實施方案中，使用圖1中所示胺基酸序列得到的HMM時，多肽的氨基 酸序列具有大於約400的HMM 二進位值。在一些實施方案中，使用圖2中所示胺基酸序列 得到的HMM時，多肽的胺基酸序列具有大於約30的HMM 二進位值。在一些實施方案中，使 用圖3中所示胺基酸序列得到的HMM時，多肽的胺基酸序列具有大於約120的HMM 二進位 值。在一些實施方案中，使用圖4中所示胺基酸序列得到的HMM時，多肽的胺基酸序列具有 大於約150的HMM 二進位值。在一些實施方案中，使用圖5中所示胺基酸序列得到的HMM 時，多肽的胺基酸序列具有大於約425的HMM 二進位值。在一些實施方案中，使用圖6中所 示胺基酸序列得到的HMM時，多肽的胺基酸序列具有大於約550的HMM 二進位值。在另一方面中，方法包括培養包含外源核酸的植物細胞。所述外源核酸包含與 編碼下述多肽的核苷酸序列有效連接的調節區，所述多肽與SEQID NO :2、4、6、8、9、11、13、 14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、 49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、 91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、 123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、 151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO 140 的胺基酸等同物 (coordinate) 1到135中所示的胺基酸序列具有85%或更高的序列同一性。由所述植物細 胞產生的植物與不包含外源核酸的對照植物中的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的 耐性水平有差異。在另一方面中，所述方法包括培養包含外源核酸的植物細胞。所述外源核酸包 含與下述核苷酸序列有效連接的調節區，所述核苷酸序列至少與SEQ ID N0. 1、3、5、7、10、 12、16、18、21、26、28、32、34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79、82、 85、87、89、92、95、97、99、103、105、108、111、113、115、117、120、124、131、133、135、137、139、 146、148、150、152、155、157、159、161和164中所示的核苷酸序列的片段和與編碼序列表中 公開的任何胺基酸序列的核苷酸序列具有85%或更高的序列同一性。由所述植物細胞產生 的植物和/或植物組織與不包含外源核酸的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽度和/或 氧化脅迫的耐性水平有差異。本文提供了調控植物對鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性水平的方法。在一個方面中，方法包括向植物細胞中引入外源核酸，所述外源核酸包含與編碼多肽的核苷酸序列有 效連接的調節區。使用由圖1-6中所示胺基酸序列產生的HMM時，所述多肽的胺基酸序列 的HMM 二進位值大於約30。由所述植物細胞產生的植物和/或植物組織與不包含外源核酸 的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。在一個方面中，方法包括向植物細胞中弓丨入外源核酸，所述外源核酸包含與編碼 下述多肽的核苷酸序列有效連接的調節區，其中所述多肽與SEQ ID N0:2、4、6、8、9、ll、13、 14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、 49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、
91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、 123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、 151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO 140 的胺基酸等同物 1到135中所示的胺基酸序列具有85%或更高的序列同一性。由所述植物細胞產生的植物 和/或植物組織與不包含外源核酸的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的 耐性水平有差異。在一些實施方案中，方法包括向植物細胞中引入編碼下述多肽的外源核酸，所述 多肽選自 SEQ ID NO :43、44、45、86、140、141、142、143、144 和 SEQ ID N0:140 的胺基酸等同 物1到135。由所述植物細胞產生的植物和/或植物組織與不包含外源核酸的對照植物的 相應耐性水平相比，對鹽度的耐性水平有差異。在一些實施方案中，方法包括向植物細胞中 引入編碼選自SEQ ID NO :136和141的多肽的外源核酸，並且由所述植物細胞產生的植物 和/或植物組織與不包含外源核酸的對照植物的相應耐性水平相比，對氧化脅迫的耐性水 平有差異。在另一方面中，方法包括向植物細胞中引入外源核酸，所述外源核酸包含與下述 核苷酸序列有效連接的調節區，其中所述核苷酸序列與SEQ IDN0:1、3、5、7、10、12、16、18、 21、26、28、32、34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79、82、85、87、89、
92、95、97、99、103、105、108、111、113、115、117、120、124、131、133、135、137、139、146、148、 150、152、155、157、159、161和164中所示的核苷酸序列和與編碼序列表中公開的任何氨基 酸序列的核苷酸序列具有85%或更高的序列同一性。由所述植物細胞產生的植物和/或植 物組織與不包含外源核酸的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平 有差異。本文提供了包含外源核酸的植物細胞。在一個方面中，外源核酸包含與編碼多肽 的核苷酸序列有效連接的調節區。使用基於圖1-6之一中所示胺基酸序列的HMM時，所述 多肽的胺基酸序列的HMM 二進位值大於約30。所述植物和/或植物組織與不包含外源核 酸的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。在另一方面中， 外源核酸包含與編碼下述多肽的核苷酸序列有效連接的調節區，所述多肽與選自SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、 41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、 81、83、84、86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、112、114、116、 118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、141、142、143、 144、145、147、149、151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO:
10140的胺基酸等同物1到135的胺基酸序列具有85%或更高的序列同一性。由所述植物 細胞產生的植物和/或植物組織與不包含外源核酸的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽 度或氧化脅迫的耐性水平有差異。在一個方面中，外源核酸包含與下述核苷酸序列有效連 接的調節區，所述核苷酸序列至少與選自SEQ ID NO. 1、3、5、7、10、12、16、18、21、26、28、32、 34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79、82、85、87、89、92、95、97、99、 103、105、108、111、113、115、117、120、124、131、133、135、137、139、146、148、150、152、155、 157、159、161和164的核苷酸序列的片段或編碼序列表中公開的任何胺基酸序列的核苷 酸序列具有85%或更高的序列同一性。由所述植物細胞產生的植物和/或植物組織與不 包含外源核酸的對照植物的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。還 提供了包含這類植物細胞的轉基因植物。在一些實施方案中，轉基因植物是選自以下的物 種成員柳枝稷(Panicumvirgatum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)(高粱，雙色高粱)、巨 芒草(Miscanthus giganteus)(芒屬)、甘蔗屬物種(Saccharum sp.)(能源蔗)、香脂白 楊(Populus balsamifera)(白楊)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max)(黃 豆)、歐洲油菜(Brassica napus)(卡諾拉油菜)、普通小麥(Triticum aestivum)(小麥)、 ^jftiS (Gossypium hirsutum) ( M^c )、禾g (Oryza sativa) ( /Jcfg ) ^ H^ (Helianthus annuus)、紫苜猜(Medicagosativa)(苜猜)、舌甘菜(Beta vulgaris)或御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)。一些實施方案涉及包含來自上述轉基因植物的種子或營養組織的制 品(product)。一些實施方案涉及來自上述轉基因植物的食品或飼料製品。在另一個方面中，分離的核酸包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與SEQ ID N0. 2、4、6、22、27、29、49、52、54、56、60、62、68、76、83、88、90、96、98、104、106、112、114、132、 134、149、151或160中所示的胺基酸序列具有80%或更高的序列同一性。在另一方面中，提供了鑑定與鹽度和/或氧化脅迫耐性水平變異相關的遺傳多態 性的方法。所述方法包括提供植物種群，並測定植物種群中一種或多種遺傳多態性是否與 下述多肽的基因座遺傳相關聯，所述多肽選自圖1-6中所示多肽及其功能性同源物。測量 種群植物和/或植物組織中鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性水平的變異與種群植物中一種或 多種多態性的存在之間的關聯，從而允許鑑定一種或多種多態性是否與這類變異相關。在另一方面中，提供了製備植物品系的方法。所述方法包括測定植物種群中一種 或多種遺傳多態性是否與下述多肽的基因座相關，所述多肽選自圖1-6中所示多肽及其功 能性同源物，鑑定種群中一種或多種植物，其中一種或多種多態性的存在與鹽耐性或氧化 脅迫耐性的變異相關，將一種或多種鑑定的植物的每一種與其自身或不同的植物雜交產生 種子，將用所述種子培養的至少一種後代植物與其自身或不同的植物雜交，將雜交步驟再 重複0-5代以製備植物品系。所述至少一種等位基因會存在於植物品系中。製備植物品系 的方法可應用於例如柳枝稷植物種群。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術 人員通常所理解的相同含義。儘管可以使用與本文所述方法和材料相似或等同的方法和材 料，但是仍在下文中描述合適的方法和材料。所有出版物、專利申請、專利和本文提到的其 他參考文獻通過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。另 外，材料、方法和實例僅用於闡述而非旨在限制。在附圖和下文的說明中公開了本發明的一個或多個實施方案的細節。從說明書和
11附圖以及權利要求書中會明白本發明的其他特徵、目的和優點。附圖概述圖1是(ME08768 ；SEQ ID NO 86)的同源物的胺基酸序列比對。在本文所示的所 有比對圖中，比對序列中的虛線表示缺口，即該位置上缺少胺基酸。比對序列間相同的氨基 酸或保守胺基酸替換用框標註。本文提供的圖1和其他比對圖使用3. 52版MUSCLE程序得 到。圖2是ME06748 (SEQ ID NO 41)的同源物的胺基酸序列比對。圖3是ME19173(SEQ ID NO 109)的同源物的胺基酸序列比對。圖4是ME02064C(SEQ ID NO 140)的同源物的胺基酸序列比對。圖5是Ceres克隆ID No. 1792354 (SEQ ID NO 2)的同源物的胺基酸序列比對。圖6是Ceres克隆ID No. 56784328 (SEQ ID NO 35)的同源物的胺基酸序列比對。發明詳述本發明涉及與調控植物和/或植物組織中鹽耐性和/或氧化脅迫耐性水平的方法 和材料。在一些實施方案中，植物也可以具有提高的生物量和/或產量。該方法可包括用編 碼鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽的核酸轉化植物細胞，其中所述多肽的表達導致受調 控的鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性。使用這類方法產生的植物細胞能夠被培養產生下述植 物，所述植物與相同條件下生長的野生型植物相比具有提高的鹽度耐性、氧化脅迫耐性和/ 或生物量。這類植物和這類植物的種子可用於生產例如用於生物燃料生產的產量和/或生 物量，所述生物燃料例如但不限於乙醇和丁醇。I.定義「胺基酸」是指二十種生物學上存在的胺基酸之一和合成胺基酸，包括D/L光學異 構體。「細胞類型優先的啟動子」或「組織優先的啟動子」是指下述啟動子，其分別優先在 目標細胞類型或組織中驅動表達，但是也同樣在其他細胞類型或組織中引起一些轉錄。「對照植物」是指不含有目的轉基因植物中存在的外源核酸，但是在其他方面具有 與這種轉基因植物相同或相似的遺傳背景的植物。合適的對照植物可以是非轉基因的野生 型植物、來自轉化實驗的非轉基因分離體，或含有除目的外源核酸之外的外源核酸的轉基 因植物。「結構域」是多肽中基本連續的胺基酸組，其能夠用於表徵蛋白質家族和/或蛋白 質部分。這類結構域具有「指紋」或「標記」，所述指紋或標記可包括保守的一級序列、二級 結構和/或三維構象。通常結構域與特定的體外和/或體內活性相關。結構域可具有10 個胺基酸到400個胺基酸、例如10到50個胺基酸、或25到100個胺基酸、或35到65個氨 基酸、或35到55個胺基酸、或45到60個胺基酸、或200到300個胺基酸、或300到400個 胺基酸的長度。「下調」是指相對於基底或固有狀態降低表達產物(mRNA、多肽或二者)產生的調 節。關於核酸的「外源的」是指核酸是重組核酸構建體的部分，或者不處於其天然環境 中。例如，外源核酸可以是來自一種物種、被引入另一物種的序列，即異源核酸。通常，這 樣的外源核酸通過重組核酸構建體被引入其他物種中。外源核酸也可以是生物固有並被再引入該生物細胞中的序列。包含固有序列的外源核酸通常可通過與外源核酸連接的非天然 序列的存在與天然存在的序列區分，所述外源核酸例如為重組核酸構建體中固有序列側接 側的非固有調節序列。另外，穩定轉化的外源核酸通常被整合在除固有序列存在位置之外 的其他位置上。應當明白，可以向祖細胞中引入外源核酸，而不是向正在考慮的細胞中引 入。例如，含有外源核酸的轉基因植物可以是穩定轉化的植物與非轉基因植物之間雜交的 後代。這樣的後代被認為含有外源核酸。「表達」是指通過轉錄將多核苷酸的遺傳信息轉化為RNA，並通過mRNA在核糖體上 的翻譯轉化為蛋白質，所述轉錄由酶(RNA聚合酶)催化。在本文中使用「異源多肽」是指非植物細胞中天然存在多肽的多肽，所述植物細胞 例如為用來自玉蜀黍植物的氮轉運蛋白多肽的編碼序列轉化並表達所述編碼序列的轉基 因柳枝稷植物。在本文中使用「分離的核酸」包括天然存在的核酸，條件是其天然存在的基因組中 所述核酸兩側緊鄰的序列之一或二者被去除或不存在。因此，分離的核酸包括但不限於，作 為純化的分子存在或作為摻入載體或病毒中的核酸分子存在的核酸。存在於例如cDNA文 庫、基因組文庫、或含有基因組DNA限制性消化產物的凝膠切片中數百到數百萬其他核酸 中間的核酸不認為是分離的核酸。化合物或組分水平的「調控(modulation) 」是指由於植物細胞中外源核酸的表達 或轉錄而觀察到所示化合物或組分的水平改變。水平的改變相對於對照植物中的相對水平 進行測量。「核酸」和「多核苷酸」在本文中可互換使用，並且表示RNA以及DNA，包括cDNA、基 因組DNA、合成DNA，和含有核酸類似物的DNA或RNA。多核苷酸可具有任何三維結構。核酸 可以是雙鏈或單鏈的(即有義鏈或反義鏈)。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片 段、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、siRNA、微小-RNA、核酶、cDNA、重 組多核苷酸、分支的多核苷酸、核酸探針和核酸引物。多核苷酸可含有非常規或經修飾的核 苷酸。「有效連接」是指在核酸中排列調節區和待轉錄的序列，使得調節區能夠有效調節 所述序列的轉錄或翻譯。例如，為了將編碼序列與調節區有效連接，通常將編碼序列的翻譯 讀碼框的翻譯起始位點置於調節區下遊1和約50個核苷酸之間。然而，調節區可以被置於 翻譯起始位點上遊多達約5，000個核苷酸處，或轉錄起始位點上遊約2，000個核苷酸處。本文中使用「多肽」是指兩個或更多亞基胺基酸的化合物、胺基酸類似物或其他肽 模擬物，與翻譯後修飾例如磷酸化或糖基化無關。亞基可以通過肽鍵或其他鍵例如酯鍵或 醚鍵連接。該定義包括全長多肽、截短的多肽、點突變體、插入突變體、剪接變體、嵌合蛋白 質及其片段。「後代」包括具體植物或植物品系的子孫。現有時(instant)植物的後代包括F1, F2、F3、F4、F5、F6和隨後世代植物上形成的種子，或BCp BC2、BC3和隨後世代植物上形成的種 子，或F1BCp F1BCy F1BC3和隨後世代植物上形成的種子。名稱F1是指遺傳上不同的兩個親 本之間雜交的後代。名稱F2、F3、F4、F5和F6是指F1植物自花傳粉後代或近親緣粉後代的隨 後世代。「調節區」是指具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列影響轉錄或翻譯起
13始和速率，和轉錄或翻譯產物的穩定性和/或遷移率。調節區包括但不限於啟動子序列、 增強子序列、應答元件、蛋白質識別位點、可誘導元件、蛋白質結合序列、5』和3』非翻譯區 (UTR)、轉錄起始位點、終止序列、聚腺苷酸化序列、內含子及其組合。調節區通常包含至少 一個核心(基礎)啟動子。調節區也可包含至少一個控制元件，例如增強子序列、上遊元件 或下遊激活區(UAR)。例如，合適的增強子是來自章魚鹼合酶(ocs)基因上遊區的順式調節 元件(-212 到-154)。Fromm 等，The Plant Cell，1 :977_984 (1989)。「上調」是指相對於基礎或固有狀態提高表達產物(mRNA、多肽或二者)水平的調 節。「載體」是指可以向其中插入另一 DNA區段從而導致插入的區段複製的複製子，例 如質粒、噬菌體或黏粒。通常，載體與正確的控制元件結合時能夠複製。術語「載體」包括 克隆和表達載體，以及病毒載體和整合載體。「表達載體」是包含調節區的載體。氧化脅迫植物物種耐受R0S/R0I/A0S的能力有所不同。「氧化脅迫」可以被定義 為下述環境條件的集合，在所述環境條件下植物會開始遭受提高的R0S/R0I/A0S濃度的影 響，例如酶活性的降低、DNA斷裂、DNA-蛋白質交聯、壞死和矮化的生長。因為這些原因，所 以經歷氧化脅迫的植物通常顯示顯著的生物量和/或產量降低。提高的氧化脅迫可由天然的、地質學的過程和人類活動(例如汙染)引起。因為 植物物種耐受氧化脅迫的能力有所不同，所以不能概括引起脅迫的精確環境條件。然而，在 氧化脅迫條件下，氧化脅迫耐性植物與非氧化脅迫耐性植物相比產生更高的生物量、產量 和存活度。可以定量生理外觀、回收率和產量。光合作用效率通過最大螢光信號Fm和可變螢光Fv之間的關係評估光合作用效 率或通過光系統II的電子運輸。最適量子產量(Fv/Fm)的降低表明脅迫，並可用於監測鹽 或氧化脅迫條件下與非轉基因植物相比轉基因植物的性能。水楊酸生長指數(SAGI):光合作用效率χ幼苗面積。鹽生長指數(SGI)光合作用效率χ幼苗面積(在鹽脅迫條件下)。鹽度植物物種耐受鹽度的能力有所不同。「鹽度」可以被定義為下述環境條件的 集合，所述環境條件下植物開始經受提高的鹽濃度的影響，例如例子失衡、降低的氣孔傳導 率、降低的光合作用、降低的生長速率、提高的細胞死亡、喪失膨壓(萎蔫)或胚珠敗育。由 於這些原因，所以經歷鹽度脅迫的植物通常顯示生物量和/或產量的顯著降低。提高的鹽度可由天然的、地理學過程和人類活動(例如汙染)引起。因為植物物 種耐受鹽度的能力有所不同，所以不能概括引起脅迫的精確環境條件。然而，在鹽條件下， 鹽度耐性植物比非鹽耐性植物產生更高的生物量、產量和存活率。可以定量物理外觀、回收 率和產量的差異。提高的鹽度可由天然的、地理學過程和人類活動(例如灌溉)引起。因為植物物 種耐受水缺乏的能力有所不同，所以不能概括引起脅迫的精確環境鹽條件。然而，在鹽條件 下，鹽耐性植物比非鹽耐性植物產生更高的生物量、產量和存活率。可以定量並使用公知的 測量和分析方法統計學分析物理外觀、回收率和產量的差異。II.多肽本文所述多肽包括鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽。鹽度耐性和/或氧 化脅迫耐性調控多肽在植物或植物細胞中表達時可以有效調控鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性水平。這類多肽通常含有至少一個鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽特徵性 (indicative)的結構域，如本文更詳細描述的。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽通 常具有大於30的HMM 二進位值，如本文更詳細描述的。在一些實施方案中，鹽度耐性和/ 或氧化脅迫耐性調控多肽與SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、 27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、 64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、 104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、 132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、156、158、160、162、 163、165、166、167、168和SEQ ID NO :140的胺基酸等同物1到135具有大於85%的同一 性，如本文更詳細描述的。A.請·禾口 /賄碰迫屋膽碰白■賭鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽可含有IQ鈣調蛋白結合基序結構域，所述 結構域被預測是鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽特徵性的。鈣調蛋白(CaM)被認為 是主要的鈣傳感器，並通過其與不同組的細胞蛋白質的相互作用管理(orchestrator)調 節事件。對許多已知的CaM結合蛋白而言存在三類識別基序；作為非Ca2+-依賴型結合共 有序列的IQ基序，和用於Ca2+-依賴型結合的兩種相關基序，其以保守的疏水殘基PUBMED 9141499的位置為基礎稱作18-14和1_5_10。例如，扇貝肌球蛋白的調節區是三鏈蛋白質複合物，其應答Ca2+結合而在該馬 達上開關。側鏈相互作用將兩條輕鏈與帶有IQ-序列基序的重鏈的相鄰區段串聯連接。 Ca2+_結合位點是主要輕鏈上新的EF-手基序，並且通過涉及重鏈和兩條輕鏈的連接被穩定 化，負責完整的肌球蛋白分子PUBMED =8127365中Ca2+結合和調節對所有三條鏈的要求。例如，SEQID NO :86 公開了本文中被鑑定為 Ceres SEEDLINE IDno. ME08768 的擬 南芥克隆的胺基酸序列，其被預測為編碼含有來自殘基116-136的IQ鈣調蛋白結合基序結 構域的多肽。在一些實施方案中，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽在天然存在的多肽的 氨基端或羧基端被截短。截短的多肽可保留天然存在的多肽的某些結構域，同時缺乏其他 結構域。因此，至多短或長5個胺基酸的長度變體通常顯示截短多肽的鹽度耐性和/或氧 化脅迫耐性調控活性。在一些實施方案中，截短的多肽是顯性負性多肽。SEQ ID N0:138公 開了相對於天然存在的多肽而言在5』端被截短的鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽 的胺基酸序列。與不包含截短的對照植物和/或其組織中的相應水平相比，這類截短多肽 在植物中的表達賦予植物和/或植物組織中鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性水平的差異。B.通過Reciprocal BLAST鑑定的功能性同源物在一些實施方案中，由上文指出的一種或多種pfam描述定義的參考鹽度耐性和/ 或氧化脅迫耐性調控多肽的一種或多種功能性同源物適合用作鹽度耐性和/或氧化脅迫 耐性調控多肽。功能性同源物是與參照多肽具有序列相似性並且發揮參照多肽的一種或多 種生物化學功能或生理功能的多肽。功能性同源物和參照多肽可以是天然存在的多肽，並 且序列相似性可歸因於趨同或趨異進化事件。同樣，功能性同源物有時在文獻中被稱作同 源物、或直系同源物、或旁系同源物。天然存在的功能性同源物的變體(例如野生型編碼序 列突變體所編碼的多肽)自身可以是功能性同源物。功能性同源物也可以通過鹽度耐性和
15/或氧化脅迫耐性調控多肽編碼序列的定點誘變產生，或通過將來自不同天然存在的鹽度 耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的編碼序列的結構域組合產生(「結構域交換」)。術語 「功能性同源物」有時適用於編碼功能同源性多肽的核酸。可以通過分析核苷酸和多肽序列比對來鑑定功能性同源物。例如，對核苷酸或多 肽序列的資料庫進行查詢能夠鑑定鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的同源物。序列 分析可涉及使用鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽胺基酸序列作為參照序列，對非冗 餘的資料庫進行BLAST、ReCipr0Cal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情況下，胺基酸序列 從核苷酸序列演繹而來。資料庫中具有大於40%序列同一性的這些多肽是進一步評價作為 鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的適應性的候選者。胺基酸相似性允許保守的氨基 酸替換，例如用一個疏水殘基替換另一個，或用一個極性殘基替換另一個。需要時可以進行 這類候選者的手檢，從而縮小有待進一步評價的候選者的數量。可以通過選擇顯示具有鹽 度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽中存在的結構域(例如保守的功能結構域)來進行手 檢。可以通過在鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的一級胺基酸序列中定位下 述區域來鑑定保守區域，所述區域是重複序列，形成一些二級結構(例如螺旋和β片層)， 建立帶正電或帶負電的結構域，或代表蛋白質基序或結構域。見，例如全球資訊網Sanger, ac. uk/Software/Pfam/和pfam. janeIia. org/上描述多種蛋白質基序和結構域的共有序 列的Pfam網站。Pfam資料庫中包含的信息的說明描述於Sonnhammer等，Nucl. AcidsRes.， 26 320-322(1998) ；Sonnhammer 等，Proteins, 28 405-420 (1997)；和 Bateman 等，Nucl. Acids Res. ,27 =260-262(1999)中。還可以通過比對來自密切相關物種的相同或相關多肽 的序列，來測定保守區。密切相關物種優選來自相同的科。在一些實施方案中，來自兩種不 同物種的序列比對就足夠。通常，顯示至少約40%胺基酸序列同一性的多肽可用於鑑定保守區。相關多肽 的保守區顯示至少45%的胺基酸序列同一性(例如至少50%、至少60%、至少70%、至少 80 %、或至少90 %的胺基酸序列同一性)。在一些實施方案中，保守區顯示至少92 %、94%、
96%、98 %或99 %的胺基酸序列同一性。圖1和序列表中提供了 SEQ ID NO 86中所示的多肽的功能性同源物的胺基酸序 列。這類功能性同源物包括(SEQ ID NO :88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、106 和 107)。在一些情況下，SEQ IDNO :86的功能性同源物具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列 與SEQ IDNO 86中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、52%、56%、 59%,61%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%^； 99%的序列同一性。圖2中提供了 SEQ ID NO 41中所示的多肽的功能性同源物的胺基酸序列。這類 功能性同源物包括(SEQ ID NO :42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、 68、69、71、73、74、76、78、80、81、83 和 84)。在一些情況下，SEQ ID NO 41 的功能性同源物具 有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO :41中所示的胺基酸序列具有至少50% 的序列同一性，例如 50%,52%,56%,59%,61%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,
97%、98 %或99 %的序列同一性。圖3中提供了 SEQ ID NO :109中所示的多肽的功能性同源物的胺基酸序列。這 類功能性同源物包括(SEQ ID NO :110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、132和134)。在一些情況下，SEQ ID NO 109的功能性同源物具有下述氨基 酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO :109中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一 性，例如 50%、52%、56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或99%的序列同一性。圖4中提供了 SEQ ID NO :140中所示的多肽的功能性同源物的胺基酸序列。這 類功能性同源物包括(SEQ ID NO :136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、 154、156、158、160、162、163、165、166、167 和 168)。在一些情況下，SEQ ID NO 140 的功能性 同源物具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO :140中所示的胺基酸序列具有 至少 50% 的序列同一性，例如 50%,52%, 56%,59%,61%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%、95%、97%、98%或 99% 的序列同一性。圖5中提供了 SEQ ID NO 2中所示的多肽的功能性同源物的胺基酸序列。這類功 能性同源物包括(SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、 31和33)。在一些情況下，SEQ ID NO :2的功能性同源物具有下述胺基酸序列，所述胺基酸 序列與SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、52%、 56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的序列同一 性。圖6中提供了 SEQ ID NO 35中所示的多肽的功能性同源物的胺基酸序列。這類 功能性同源物包括(SEQ ID NO :35、36、37、38和39)。在一些情況下，SEQ ID NO :35的功能 性同源物具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO :35中所示的胺基酸序列具有 至少 50% 的序列同一性，例如 50%,52%,56%,59%,61%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%、95%、97%、98%或 99% 的序列同一性。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽中保守區的鑑定有助於鹽度耐性和/或氧 化脅迫耐性調控多肽變體的產生。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的變體通常在一 級胺基酸序列中具有10個或更少的保守胺基酸替換，例如7個或更少的保守胺基酸替換， 5個或更少的保守胺基酸替換，或1個和5個之間的保守胺基酸替換。可以基於圖1到圖6 中所示的比對之一構建有用的變體多肽。這類多肽包括保守區，所述保守區以圖中所示從 氨基端到羧基端的順序排列。這類多肽也可在用虛線標記的位置中包含零個、一個或多於 一個的胺基酸。當虛線標記的位置上不存在胺基酸時，這類多肽的長度是所有保守區中氨 基酸殘基的總和。用虛線標記的所有位置中均存在胺基酸時，這類多肽的長度是所有保守 區和所有虛線中胺基酸殘基的總和。C.通過HMM鑑定的功能性同源物在一些實施方案中，有用的鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽包括適合以圖1-6 任一中所示的多肽為基礎的隱蔽馬爾科夫模型的多肽。隱蔽馬爾科夫模型(HMM)是一組功 能性同源物的共有序列的統計學模型。參閱Durbin等，Biological Sequence Analysis Probabilistic Models of Proteinsand Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK(1998)。使用功能性同源物組的序列作為輸入，通過程序HMMER 2. 3. 2用默 認程序參數產生HMM。使用一組默認參數通過1. 11版ProbCons (Do等，GenomeRes.，15(2) 330-40 (2005))產生多序列比對，所述參數為—c，一 一致性REPS為2 ；-ir,—迭代-細分 REPS為100 ；-pre,—pre-培訓REPS為0。ProbCons是由史丹福大學提供的公開結構域軟
17件程序。構建HMM(hmmbuild)的默認參數如下MAP體系結構使用的默認「體系結構優先 級」 (archpri)為0. 85，用於測定有效序列數的默認截止閾值(idlevel)為0. 62。HMMER 2. 3. 2在2003年10月3日在GNU —般公開許可證中準許，並且可在全球資訊網上的多個來源處 獲得。Hmmbuild作為文本文件輸出模型。可以使用一組功能性同源物的HMM來測定候選鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控 多肽序列比下述無效HMM更好地適合具體HMM的可能性，所述無效HMM使用非結構或功能 相關的一組序列產生。受試多肽序列比無效HMM更好地適合HMM的可能性由HMM 二進位值 表示，所述HMM 二進位值是使用HMMER hmmsearch程序將候選序列擬合至HMM圖譜時產生 的數字。運行hmmsearch時使用以下的默認參數默認E-值截止(E)為10. 0，默認二進位 值截止(T)為負無窮大，資料庫中默認的序列數(Z)是資料庫中的真實序列數，per-結構 域分級的hit列表的默認E值截止(domE)是無窮大，per-結構域分級的hit列表的默認 二進位值截止(domT)為負無窮大。高HMM 二進位值表示受試序列進行用於產生HMM的多 肽的一種或多種生物化學功能或生理學功能的可能性更大。高HMM 二進位值至少為20，通 吊更尚。本領域技術人員應當明白，序列表中提供的HMM得分僅用於舉例。因為多序列比 對算法例如ProbCons僅能產生接近最佳的結果，所以由於下述因素可能發生模型的輕微 變異，所述因素例如序列被加工用於比對的順序。然而，HMM得分變異性較小，因此序列表 中的HMM得分代表了用各個序列製備的模型。下文討論的鹽度和/或氧化脅迫調控多肽以大於20 (例如大於20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、300、400或500)的HMM 二進位值適合所示HMM。在一些實施方案中，下 文討論的鹽度和/或氧化脅迫調控多肽的HMM 二進位值約為序列表中提供的功能性同源物 HMM 二進位值的50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %。在一些實施方案中，下文討論的鹽度 和/或氧化脅迫調控多肽以大於20的HMM 二進位值適合所示HMM，並具有鹽度和/或氧化 脅迫調控多肽的特徵性結構域。在一些實施方案中，下文討論的鹽度和/或氧化脅迫調控 多肽以大於20的HMM 二進位值適合所示HMM，並且與圖1到6任一中所示胺基酸序列或序 列表中與圖1到6中任一相關的胺基酸序列具有85%或更高的序列同一性(75%、80%、 85%、90%、95%或100%的序列同一性)。序列表中提供了與圖1中所示的胺基酸序列產生的HMM擬合時，具有大於400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050 或 1100 的 HMM 二進位值的 多肽。這類多肽包括 CeresSEEDLINE ID no. ME08768、Ceres 克隆 ID no. 1943807、Ceres ANNOT IDno. 1471392,Public GI ID no. 6715635、Ceres 克隆 ID no. 910109、Public GIID no. 115474509、Ceres 克隆 ID no. 1780908、Ceres ANNOT ID no. 1520883、Ceres 克隆 ID no. 148018、Public GI ID no. 18378797、Public GI IDno. 21553500、Ceres ANNOT ID no. 1444522、Ceres ANNOT ID no.146751 和 Public GI ID no. 125559938(SEQ ID NO :86、 88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、106 和 107)。序列表中提供了與圖2中所示的胺基酸序列產生的HMM擬合時具有大於30、50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或 1000
的 HMM 二進位值的多肽。這類多肽包括 Ceres SEEDLINE ID no. ME06748,Ceres SEEDLINEIDno. ME20711、Ceres SEEDLINE ID no. ME18973、Ceres SEEDLINE IDno. ME08732、Ceres SEEDLINE ID no. ME19657, Ceres 克隆 ID no. 835818、Ceres 克隆 ID no. 1796745、Public GI ID no. 125543896、Ceres ANNOT IDno. 1483984、Ceres 克隆 ID no. 1924654、Ceres ANNOT ID no. 1468861、Ceres 克隆 ID no. 1641776、Ceres ANNOT ID no. 1438750、Ceres ANNOT IDno. 1447395、Public GI ID no. 79482785、Public GI ID no. 3292832、Ceres 克隆 ID no. 1559074、Ceres 克隆 ID no. 1726548、Public GI IDno. 115459996、Ceres 克隆 ID no. 697034、Ceres 克隆 ID no. 353438、PublicGI ID no. 125593074、Ceres 克 隆 ID no. 1920115、Ceres 克隆 ID no. 21821、Ceres 克隆 ID no. 560066、Public GI ID no. 115453071、Ceres 克隆 IDno. 1968211 和 Public GI ID no. 116310011_(SEQ ID NO :42、 43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83 和 84)。序列表中提供了與圖3中所示的胺基酸序列產生的HMM擬合時具有大於120、150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、 1100、1150 或 1200 的HMM二進位值的多肽。這類多肽包括Ceres SEEDLINE ID no. ME19173、 PublicGI ID no. 115435054、Ceres 克隆 ID no. 1847857、Ceres ANNOT IDno. 1455219、 Ceres 克隆 ID no. 352452、Ceres 克隆 ID no. 787908、CeresLOCUS ID no. 0s01m00929_ AP002743、Ceres 克隆 ID no. 246398、PublicGI ID no. 125527441、Public GI ID no. 125595056、Ceres 克隆 ID no. 236071、Public GI ID no. 125524760、Public GI ID no. 125569365、Public GI IDno. 115439499、Public GI ID no. 15225258、Public GI ID no.115465173、Ceres ANNOT ID no.1477059 和 Ceres ANNOT ID no.1530547 (SEQ IDNO 110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、132 和 134)。序列表中提供了與圖4中所示的胺基酸序列產生的HMM擬合時具有大於150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、 1150、1200、1250、1300或1350的HMM 二進位值的多肽。這類多肽包括Ceres SEEDLINE IDno. ME24091、Ceres 克隆 ID no. 375578、Ceres 克隆 ID no. 375578、CeresSEEDLINE ID no. ME10681、Ceres SEEDLINE ID no. ME03140, CeresSEEDLINE ID no. ME24076、Ceres SEEDLINE ID no. ME24217, Public GIID no. 115440873、Ceres 克隆 ID no. 826796、Ceres ANNOT ID no. 1465047、Ceres 克隆 ID no. 1919901、Ceres 克隆 ID no. 520008、Public GI IDno. 7413581、Ceres 克隆 ID no. 228069、Ceres 克隆 ID no. 467508、Ceres 克隆 ID no. 1829581、Ceres 克隆 ID no. 229668、Public GI ID no. 125550655、Ceres 克隆 ID no. 106263、Public GI ID no. 15231175、Public GI IDno. 145357576 和 Public GI ID no. 125528277(SEQ ID NO : 136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、 156、158、160、162、163、165、166、167 和 168)。序列表中提供了與圖5中所示的胺基酸序列產生的HMM擬合時具有大於425、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、 1300、1350、1400、1450、1500或1550的HMM 二進位值的多肽。這類多肽包括Ceres克 隆 IDno. 1792354、Ceres 克隆 ID no. 1925477、Ceres ANNOT ID no. 1521592、Ceres 克隆 ID no. 463594、Public GI ID no. 22330633、Ceres 克隆 IDno. 345954、Ceres LOCUS ID no. 0s01m05025 AP003288, GI ID no. 56784330、Public GI ID no. 125527495、PublicGI ID no. 125553119、Ceres 克隆 ID no. 236431、Ceres 克隆 ID no. 908518、Public GI ID no. 115465121、Ceres 克隆 ID no. 1791910、Public GI ID no. 125595019、Public GI IDno. 42568886、Public GI ID no. 2947062、Ceres ANNOT ID no. 1468228、Ceres 克隆 ID no. 1942388、Public GI ID no. 12324824、Public GI IDno. 5882749 和 Ceres 克隆 ID no. 325403(SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31 和 33)。序列表中提供了與圖6中所示的胺基酸序列產生的HMM擬合時具有大於550、600、 650或700的HMM 二進位值的多肽。這類多肽包括CeresGI ID no. 56784328、Public GI ID no. 56784330、Public GI IDno. 125528718、Public GI ID no.125572975 和 Public GI ID no. 125528716(SEQ ID NO :35、36、37、38 和 39)。P.同一件百分比在一些實施方案中，鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽具有與SEQ IDNO :2、4、6、 8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、 44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、 86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、 121、122、123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、 147、149、151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO 140 的氨 基酸等同物1到135中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性的胺基酸序列，例如 50%、52%、56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的 序列同一性的胺基酸序列。具有這類序列同一性百分比的多肽通常具有鹽度和/或氧化脅 迫調控多肽的特徵性結構域和/或具有大於20的HMM 二進位值，如上文所述。圖1-6中提 供了與SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、 36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、 74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、 112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、 141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO 140的胺基酸等同物1到135中所示的胺基酸序列之一具有至少85%序列同一 性的鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽的胺基酸序列的實例。「序列同一性百分比」是指任何給定的參照序列和候選的鹽度和/或氧化脅迫調 控序列之間的序列同一性程度，所述參照序列例如為SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、 17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、 52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、91、93、 94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、 126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、 154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO 140 的胺基酸等同物 1 到 135。 候選序列通常具有參照序列長度80%到200%的長度，例如參照序列長度的82%、85%、 87%,89%,90%,93%,95%,97%,99% ,100% ,105% ,110% ,115% ,120% ,130% ,140%, 150 % ,160% ,170%, 180 %、190 %、或200 %。可如下測定任何候選核酸或多肽相對於參 照核酸或多肽的同一性百分比。使用電腦程式Clustaiwa. 83版，默認參數)將參照序
20列(例如核酸序列或胺基酸序列)與一個或多個候選序列比對，所述電腦程式ClustalW 允許在核酸或多肽序列的整個長度上進行比對(全局比對)。Cherma等、Nucleic Acids Res. ,31(13) :3497_500 (2003)。Clustalff計算參照序列和一個或多個候選序列之間的最佳匹配，並對它們進行 比對，從而能夠測定同一性、相似性和差異。可以向參照序列、候選序列或該二者中插入一 個或多個殘基的缺口，以最大化序列比對。對核酸序列的快速配對比對而言，使用以下的 默認參數欄位長度(wordsize) 2 ；窗口尺寸4 ；記分法百分比；頂部對角線數(number of topdiagonal) :4;和缺口罰分5。對於核酸序列的多重比對而言，使用以下的參數缺 口開放罰分10.0 ；缺口延伸罰分5.0 ；權重轉換是。對於蛋白質序列的快速配對比對而 言，使用以下的參數欄位長度1 ；窗口尺寸5 ；記分法百分比；頂部對角線數5 ；和缺口 罰分3。對於蛋白質序列的多重比對而言，使用以下的參數權重矩陣(weight matrix) blosum ；缺口開放罰分:10. 0 ；缺口延伸罰分0. 05 ；親水缺口 開；親水殘基Gly、Pro、Ser、 Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys ；殘基特異的缺口罰分開。ClustalW輸出的是反映序列之 間相互關係的序列比對。ClustalW可以在全球資訊網上的例如Baylor College of Medicine Search Launcher 網頁(searchlauncher. bcm. tmc. edu/multi-align/multi-align. html) 上禾口 EuropeanBioinformatics Institute 網頁(ebi.ac.uk/clustalw)上運 。為了測定候選核酸或胺基酸序列與參照序列的同一性百分比，使用ClustalW比 對序列，用比對中相同匹配的數量除以參照序列的長度，並將結果乘以100。注意可以將同 一性百分比數值估值為最接近的十分之一。例如，可以將78. 11,78. 12,78. 13和78. 14估 值為 78. 1，將 78. 15,78. 16,78. 17,78. 18 和 78. 19 估值為 78. 2。在一些情況下，鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽具有下述胺基酸序列，所述氨 基酸序列與SEQ ID NO :86中所示的一種或多種胺基酸序列具有至少50%的序列同一性， 例如 50%、52%、56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99%的序列同一性。序列表中提供了與SEQ ID NO :86中所示的多肽具有高度序列同一性的 多肽的胺基酸序列。這類多肽包括 SEQ ID NO :88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、 106 和 107。在一些情況下，鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽具有下述胺基酸序列，所述氨 基酸序列與SEQ ID NO :41中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、 52%、56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的序列 同一性。序列表中提供了與SEQ ID Ν0:41中所示的多肽具有高度序列同一性的多肽的氨 基酸序列。這類多肽包括 SEQ ID NO :42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、 66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83 和 84。在一些情況下，鹽度和/或氧化脅迫調控多肽具有下述胺基酸序列，所述胺基酸 序列與SEQ ID NO :109中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、52%、 56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的序列同一 性。序列表中提供了與SEQ ID NO :109中所示的多肽具有高度序列同一性的多肽的胺基酸 序列。這類多肽包括 SEQ ID NO :110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、 128、129、130、132 和 134。在一些情況下，鹽度和/或氧化脅迫調控多肽具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO :140中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、52%、 56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的序列同一 性。序列表中提供了與SEQ ID NO :140中所示的多肽具有高度序列同一性的多肽的胺基酸 序列。這類多肽包括 SEQ ID NO :136、138、141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、 156、158、160、162、163、165、166、167 和 168。在一些情況下，鹽度和/或氧化脅迫調控多肽具有下述胺基酸序列，所述胺基酸 序列與SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、52%、 56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的序列同一 性。序列表中提供了與SEQ ID NO :2中所示的多肽具有高度序列同一性的多肽的胺基酸序 列。這類多肽包括 SEQ ID NO :4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、 31 禾口 33。在一些情況下，鹽度和/或氧化脅迫調控多肽具有下述胺基酸序列，所述胺基酸 序列與SEQ ID NO 35中所示的胺基酸序列具有至少50%的序列同一性，例如50%、52%、 56%、59%、61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的序列同一 性。序列表中提供了與SEQ ID NO :35中所示的多肽具有高度序列同一性的多肽的胺基酸 序列。這類多肽包括SEQ ID NO :36、37、38和39。E.其他序列應當明白，鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽可包括不涉及鹽度和/或氧化脅迫 耐性調控的其他胺基酸，因此這類多肽可能比其他情況下更長。例如，鹽度和/或氧化脅迫 耐性調控多肽可包含添加在氨基端或羧基端的純化標籤，葉綠體轉運肽、造粉體轉運肽、線 粒體轉運肽或前導序列。在一些實施方案中，鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽包含發揮 報導基因功能的胺基酸序列，例如綠色螢光蛋白或黃色螢光蛋白。III.核酸本文所述的核酸包括在植物或植物細胞中轉錄時有效調控鹽度和/或氧化脅迫 耐性的核酸。這類核酸包括但不限於編碼鹽度和/或氧化脅迫耐性調控多肽的核酸，和能 夠用於通過基於核酸的方法抑制鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽表達的核酸。A. ^^^jtat^^n / ^MAmmmim.^mmm本文描述了編碼鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的核酸。這類核酸包括 SEQ ID NO :1、3、5、7、10、12、16、18、21、26、28、32、34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、 67、70、72、75、77、79、82、85、87、89、92、95、97、99、103、105、108、111、113、115、117、120、 124、131、133、135、137、139、146、148、150、152、155、157、159、161 和 164，如下文更詳細描述的。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可包含SEQ ID NO 85中所示的核苷酸序 列。或者，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以是具有SEQ ID N0:85中所示的核 苷酸序列的核酸變體。例如，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以具有下述核苷酸 序列，所述核苷酸序列與SEQ IDN0 :85、87、89、92、95、97、99、103和105中所示的核苷酸序 列具有至少80%的序列同一性，例如81%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一 性。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可包含SEQ ID NO 40中所示的核苷酸序
22列。或者，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以是具有SEQ ID N0:40中所示的核 苷酸序列的核酸變體。例如，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以具有下述核苷酸 序列，所述核苷酸序列與SEQ IDN0 :40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79 和82中所示的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性，例如81%、85%、90%、95%、97%、 98%或99%的序列同一性。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可包含SEQ ID NO 108中所示的核苷酸序 列。或者，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以是具有SEQ ID N0:108中所示的核 苷酸序列的核酸變體。例如，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以具有下述核苷酸 序列，所述核苷酸序列與SEQID NO 108、111、113、115、117、120、124、131和133中所示的核 苷酸序列具有至少80%的序列同一性，例如81%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序 列同一性。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可包含SEQ ID NO 139中所示的核苷酸序 列。或者，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以是具有SEQ ID N0:139中所示的核苷 酸序列的核酸變體。例如，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以具有下述核苷酸序 列，所述核苷酸序列與 SEQID NO :135、137、139、146、148、150、152、155、157、159、161 和 164 中所示的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性，例如81%、85%、90%、95%、97%、98% 或99%序列同一性。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可包含SEQ ID NO :1中所示的核苷酸序 列。或者，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以是具有SEQID N0:1中所示的核苷 酸序列的核酸變體。例如，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以具有下述核苷酸序 列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO :1、3、5、7、10、12、16、18、21、26、28和32中所示的核苷酸 序列具有至少80%的序列同一性，例如81%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同 一性。鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可包含SEQ ID NO 34中所示的核苷酸序 列。或者，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以是具有SEQ ID N0:34中所示的核苷 酸序列的核酸變體。例如，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控核酸可以具有下述核苷酸序 列，所述核苷酸序列與SEQ IDN0 34中所示的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性，例 如 81%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的序列同一性。可以使用標準技術產生分離的核酸分子。例如，可以使用聚合酶鏈式反應(PCR) 技術獲得含有本文所述核苷酸序列的分離的核酸。可以使用PCR從DNA以及RNA(包括 來自總基因組DNA或總細胞RNA的序列)中擴增特定的序列。多種PCR方法描述於例如 PCR Primer :A LaboratoryManual, Dieffenbach and Dveksler 編，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1995中。通常，使用來自目的區域末端或之外的序列信息設計寡核苷酸 引物，所述引物在序列上與待擴增的模板的相對鏈相同或相似。還可以獲得多種PCR策略， 通過所述策略可以將位點特異性核苷酸序列修飾引入模板核酸中。還可以化學合成分離的 核酸，例如作為單一核酸分子合成(例如使用亞磷醯胺技術，在3'到5'方向上使用自動 化DNA合成)或作為一系列寡核苷酸合成。例如，可以合成含有預期序列的一對或多對長 寡核苷酸(例如> 100個核苷酸)，每個對含有短的互補性區段(例如約15個核苷酸)，使 得寡核苷酸對退火時形成雙鏈體。使用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每個寡核苷酸對得到單一的、雙鏈的核酸分子，所述核酸分子隨後可與載體連接。也可以通過誘變例如天然存在的 DNA來獲得本發明的分離的核酸。B.核酸調控多肽表汰的用塗i.艦讀禾口 /賄碰i白讀膽碰白腫汰多肽通常通過用下述核酸轉化植物細胞，用編碼本文所述鹽度耐性和/或氧化脅迫耐 性調控多肽的核酸在目的植物物種中表達多肽，所述核酸具有以有義方向與一個或多個調 節區有效連接的編碼多肽的序列。應當明白，由於遺傳密碼子的簡併性，大量核酸可編碼一 個特定的鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽，即對許多胺基酸而言，存在多於一種發 揮該胺基酸密碼子作用的核苷酸三聯體。因此，可以使用針對具體植物物種的合適密碼子 偏好表，修飾給定鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的編碼序列中的密碼子，從而獲 得所述植物物種中的最優表達。在一些情況下，鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的表達抑制內源多肽的一 種或多種功能。例如，可以使用編碼顯性負相多肽的核酸抑制蛋白質功能。顯性負相多肽 通常相對於內源野生型多肽而言是突變或截短的，並且其在細胞中的存在抑制細胞中野 生型多肽的一種或多種功能，即顯性負相多肽是遺傳顯性的，並且賦予功能的喪失。顯性 負相多肽賦予這種表型的機制可以變化，但是常常涉及蛋白質-蛋白質相互作用或蛋白 質-DNA相互作用。例如，顯性負相多肽可以是相對於固有野生型酶被截短的酶，從而截短 的多肽保留涉及與第一蛋白質結合的結構域但是缺乏涉及與第二蛋白質結合的結構域。因 此，截短的多肽不能正確地調控第二蛋白質的活性。見例如US 2007/0056058。作為另一 個例子，催化結構域中導致非保守胺基酸替代的點突變能夠導致顯性負相多肽。見例如US 2005/032221。作為另一個例子，顯性負相多肽可以是相對於固有的野生型轉錄因子被截短 的轉錄因子，從而截短的多肽保留一個或多個DNA結合結構域但是缺乏一個或多個活化結 構域。這類截短的多肽能夠抑制野生型轉錄因子與DNA結合，從而抑制轉錄活化。ii.抑制鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的表達本文所述的多核苷酸和重組構建體可用於抑制目的植物物種中鹽度耐性和/或 氧化脅迫耐性調控多肽的表達。見例如nature, com/reviews/focus/mai上的Matzke和 Birchler, Nature ReviewsGenetics 6 24~35 (2005) ；Akashi 等，Nature Reviews Mol. Cell BioloRy6 413~422(2005) ;Mittal, Nature Reviews Genetics 5:355-365(2004)； Dorsett 禾口 Tuschl， Nature Reviews PruR Discovery 3 :318_329(2004)；禾口 Nature Reviews RNA interference collection, 2005年10月。已知大量基於核酸抑制植物中的 基因表達，所述方法包括反義RNA、核酶定向RNA切割、轉錄後基因沉默(PTGS)的方法，例如 RNA幹擾(RNAi)和轉錄基因沉默(TGS)。反義技術是一種公知的方法。在這種方法中，將 來自要阻抑的基因的核酸區段克隆並與調節區和轉錄終止序列有效連接，使得RNA的反義 鏈被轉錄。然後將重組構建體轉化進植物中，如本文所述，並產生RNA的反義鏈。核酸區段 不需要是要阻抑的基因的整個序列，但是通常應與要阻抑的基因有義鏈的至少一部分基本 互補。通常，可以使用較高的同源性來補償較短序列的使用。通常使用至少30個核苷酸的 序列，例如至少40、50、80、100、200、500個核苷酸或更多。在另一種方法中，可以將核酸轉錄為影響mRNA表達的核酶或催化性RNA。見美國專利No. 6，423，885。核酶可以被設計為實際上與任何靶RNA特異性配對，並在特異性位 置上切割磷酸二酯主鏈，從而使靶RNA功能性失活。異源核酸能夠編碼被設計為切割具體 mRNA轉錄物的核酶，從而預防多肽的表達。錘頭狀核酶可用於破壞具體的mRNA，儘管可以 使用在位點特異性識別序列上切割mRNA的多種核酶。錘頭狀核酶在下述側翼區指定的位 置切割mRNA，所述側翼區與靶mRNA形成互補的鹼基對。唯一的要求是靶RNA含有5』_UG_3』 核苷酸序列。錘頭狀核酶的構建和產生是本領域已知的。見例如美國專利No. 5，254，678 和TO 02/46449及其中引用的參考文獻。錘頭狀核酶序列可以被植入穩定的RNA例如轉 運 RNA(tRNA)中，以提高體內切割效率。Perriman 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92(13) 6175-6179(1995) ；de Feyter 和 Gaudron，Methods inMolecular Biology，第 74 卷，第 43 章,"Expressing Ribozymes in Plants，，,Turner,P. C.編著，Humana Press Inc. ,Totowa, NJ.已描述的RNA內切核糖核酸酶例如嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)中天然存 在的RNA內切核糖核酸酶可以是有用的。見例如美國專利No. 4，987，071和6，423，885。PTGS例如RNAi也可以用於抑制基因的表達。例如，可以製備包含以下序列的構 建體，所述序列被轉錄為能夠自身退火的RNA，例如具有莖-環結構的雙鏈RNA。在一些實 施方案中，雙鏈RNA莖部分的一條鏈包含下述序列，所述序列與鹽度耐性和/或氧化脅迫耐 性調控多肽的有義編碼序列相似或相同並且長度為約10個核苷酸到約2，500個核苷酸。 與有義編碼序列相似或相同的序列的長度可以從10個核苷酸到500個核苷酸，從15個核 苷酸到300個核苷酸，從20個核苷酸到100個核苷酸，或從25個核苷酸到100個核苷酸。 雙鏈RNA莖部分的另一條鏈包含下述序列，所述序列與鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控 多肽編碼鏈的反義鏈相似或相同並且可以具有比有義序列相應長度更短、相同或更長的長 度。在一些情況下，雙鏈RNA莖部分的一條鏈包含與編碼鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調 控多肽的mRNA的3』或5』非翻譯區相似或相同的序列，並且雙鏈RNA莖部分的另一條鏈 包含分別與編碼鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的mRNA 3』或5』非翻譯區的互補 序列相似或相同的序列。在其他實施方案中，雙鏈RNA莖部分的一條鏈包含與編碼鹽度耐 性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的前-mRNA中內含子序列相似或相同的序列，並且莖部分 的另一條鏈包含與前-mRNA中內含子序列的互補序列相似或相同的序列。雙鏈RNA的環 部分可以是3個核苷酸到5，000個核苷酸，例如3個核苷酸到25個核苷酸、15個核苷酸到 1，000個核苷酸、20個核苷酸到500個核苷酸或25個核苷酸到200個核苷酸。RNA的環部 分可包含內含子。雙鏈RNA可具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個莖-環結構。將包 含下述序列的構建體轉化進本文所述的植物中，所述序列與調節區和轉錄終止序列有效連 接並且被轉錄為能夠形成雙鏈RNA的RNA。使用RNAi抑制基因表達的方法是本領域技術 人員已知的。見例如美國專利 5，034，323 ；6，326，527 ；6，452，067 ；6，573，099 ；6，753，139 ； 和 6，777，588。還見 W0 97/01952 ；W0 98/53083 ；W0 99/32619 ；W0 98/36083 ；和美國專利 公開 20030175965, 20030175783，20040214330 和 20030180945。也可以使用下述構建體抑制基因的表達，所述構建體含有以有義方向與核酸分子 有效連接的調節區。轉錄產物可以與鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的有義編碼序 列相似或相同。轉錄產物也可以是未聚腺苷酸化的、缺乏5』帽結構或含有不可剪接的內含 子。使用全長cDNA以及部分cDNA序列抑制基因表達的方法是本領域已知的。見例如美國 專利 No. 5，231，020。
25
在一些實施方案中，用含有下述核酸的構建體抑制基因的表達，所述核酸有至少 一條鏈是彼此互補的有義和反義序列的模板。有義和反義序列可以是更大核酸分子的部 分，或者可以是具有不互補序列的單獨核酸分子的部分。有義或反義序列可以是與編碼鹽 度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的mRNA序列、mRNA的3』或5』非翻譯區或前-mRNA中 的內含子相同或互補的序列。在一些實施方案中，有義或反義序列與下述調節區的序列相 同或互補，所述調節區驅動編碼鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的基因的轉錄。在 每種情況下，有義序列是與反義序列互補的序列。有義和反義序列可以是大於約12個核苷酸(例如13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸)的任何長度。例如，反義序列長度可以是 21或22個核苷酸。通常，有義和反義序列的長度範圍為從約15個核苷酸到約30個核苷 酸，例如從約18個核苷酸到約28個核苷酸，或從約21個核苷酸到約25個核苷酸。在一些實施方案中，反義序列是與編碼本文所述鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調 控多肽的mRNA序列互補的序列。與反義序列互補的有義序列可以是存在於鹽度耐性和/ 或氧化脅迫耐性調控多肽的mRNA中的序列。通常，有義和反義序列被設計為對應於靶mRNA 的15-30個核苷酸的序列，使得靶mRNA的水平降低。在一些實施方案中，可以使用含有下述核酸的構建體抑制基因的表達，所述核酸 有至少一條鏈是多於一條有義序列(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多有義序列)的模板。 類似地，可以使用含有下述核酸的構建體抑制基因的表達，所述核酸有至少一條鏈是多於 一條反義序列(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多反義序列)的模板。例如，構建體可含有 下述核酸，所述核酸有至少一條鏈是兩條有義序列和兩條反義序列的模板。多條有義序列 可以相同或不同，並且多條反義序列可以相同或不同。例如，構建體可具有下述核酸，所述 核酸有一條鏈是兩條相同有義序列和與所述兩條相同有義序列互補的兩條相同反義序列 的模板。或者，分離的核酸可具有一條鏈是以下的模板(1)長度為20個核苷酸的兩條相 同的有義序列，(2)長度為20個核苷酸的、與兩條相同有義序列互補的一條反義序列，(3) 長度為30個核苷酸的有義序列，和(4)長度為30個核苷酸的、與有義序列互補的三條相同 的反義序列。本文提供的構建體可以被設計為具有有義和反義序列的任何排列。例如，兩 條相同的有義序列可以緊跟兩條相同的反義序列，或者可以被置於兩條相同的反義序列之 間。具有至少一條鏈是一條或多條有義和/或反義序列模板的核酸可以與調節區有 效連接，以驅動含有一條或多條有義和/或反義序列的RNA分子的轉錄。另外，這樣的核 酸可與轉錄終止子序列例如胭脂鹼合酶(nos)基因的終止子有效連接。在一些情況下，兩 個調節區能夠指導兩個轉錄物的轉錄一個來自於頂部鏈，一個來自於底部鏈。見例如Yan 等，Plant Physiol.，141 :1508-1518 (2006)。兩個調節區可以相同或不同。兩個轉錄物可 形成誘導靶RNA降解的雙鏈RNA分子。在一些情況下，核酸可以置於T-DNA或來自植物的 轉化DNA (P-DNA)內，使得P-DNA的左側和右側T-DNA邊界序列或左側和右側邊界樣序列在 核酸的兩側或任一側。見US2006/0265788。兩個調節區之間的核酸序列長度可從約15個 到約30個核苷酸。在一些實施方案中，兩個調節區之間的核酸序列長度從約15到約200 個核苷酸，長度從約15到約100個核苷酸，長度從約15到約50個核苷酸，長度從約18到 約50個核苷酸，長度從約18到約40個核苷酸，長度從約18到約30個核苷酸，或長度從約
2618到約25個核苷酸。在用於抑制植物中基因表達的一些基於核酸的方法中，合適的核酸可以是核酸類 似物。核酸類似物可以在鹼基部分、糖部分或磷酸主鏈上被修飾，以提高核酸的例如穩定 性、雜交或溶解度。鹼基部分上的修飾包括脫氧尿苷替換脫氧胸苷，和5-甲基_2』 -脫氧 胞苷和5-溴-2』 -脫氧胞苷替換脫氧胞苷。糖部分的修飾包括修飾核糖的2』羥基形成 2』-0_甲基或2』-0_烯丙基糖。可以修飾脫氧核糖磷酸主鏈產生嗎啉代核酸，其中每個鹼基 部分與六元嗎啉代環連接，或產生肽核酸，其中用假肽主鏈替代脫氧磷酸主鏈並保留四個 喊基。見例如 Summerton禾PWeller，1997，Antisense Nucleic AcidDrug Dev. ,7 187-195 ； Hyrup等，Bioorgan. Med. Chem.，4 =5-23(1996)。另外，可以將脫氧磷酸主鏈替換為例如硫 代磷酸酯或二硫代磷酸酯主鏈，磷醯胺酯(phosphoroamidite)或烷基磷酸三酯主鏈。C.構津體/載體可以使用本文提供的重組構建體轉化植物或植物細胞，從而調控鹽度耐性和/或 氧化脅迫耐性水平。重組的核酸構建體可包含編碼本文所述鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性 調控多肽的核酸，其與適合在植物或細胞中表達鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的 調節區有效連接。因此，核酸可包含編碼SEQ ID NO :1、3、5、7、10、12、16、18、21、26、28、32、 34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79、82、85、87、89、92、95、97、99、 103、105、108、111、113、115、117、120、124、131、133、135、137、139、146、148、150、152、155、 157、159、161和164中所示的任何鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的編碼序列。編 碼鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的核酸的例子示於SEQID N0 2、4、6、8、9、11、13、 14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、 49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、 91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、 123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、 151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、168 和 SEQ ID NO 140 的胺基酸等同物 1到135中。重組核酸編碼的鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽可以是固有的鹽度耐 性和/或氧化脅迫耐性調控多肽，或者可以對細胞是異源的。在一些情況下，重組構建體含 有抑制鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽表達的核酸，其與調節區有效連接。合適的 調節區的例子描述於標題為「調節區」的部分中。還提供了含有重組核酸構建體(如本文所述重組核酸構建體)的載體。合適的 載體主鏈包括例如本領域常規使用的載體主鏈，例如質粒、病毒、人造染色體、BAC、YAC或 PAC。合適的表達載體包括但不限於，來自例如噬菌體、杆狀病毒和反轉錄病毒的質粒和 病毒載體。大量載體和表達系統可商業得自例如Novagen (Madison，WI)、Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene(La Jolla, CA)禾口 Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad, CA) 的公司。本文提供的載體可包含例如複製起點、支架附著區(SAR)和/或標記物。標記 物基因能夠賦予植物細胞可選擇的表型。例如，標記物能夠賦予抗生劑抗性，例如對抗生 素(例如卡那黴素、G418、博來黴素或潮黴素)的抗性，或對除草劑(例如草甘膦、氯磺隆 (chlorsulfuron)或草胺膦(phosphinothricin))的抗性。另外，表達載體可包含被設計 為便於操作或檢測(例如純化或定位)所表達的多肽的標籤序列。標籤序列例如螢光素
27酶、葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、綠色螢光蛋白(GFP)、穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、聚組氨酸、 c-myc、血凝素或Flag 標籤(Kodak，New Haven, CT)序列通常被表達為與所編碼的多肽的 融合物。這類標籤可以被插入多肽中任何地方，包括羧基或氨基任一端。D.調節區待包含在重組構建體中的調節區的選擇取決於若干因素，包括但不限於效率、選 擇性、可誘導性、期望的表達水平和細胞或組織優先表達。通過適當地選擇和放置與編碼序 列相關的調節區來調節編碼序列的表達對本領域技術人員而言是常規問題。可以通過類似 的方式調控核酸的轉錄。一些合適的啟動子僅在或主要在某些細胞類型中起始轉錄。待包含在重組構建體 中的調節區的選擇取決於若干因素，包括但不限於效率、選擇性、可誘導性、期望的表達水 平和細胞或組織優先表達。通過適當地選擇和放置與編碼序列相關的調節區來調節編碼序 列的表達對本領域技術人員而言是常規問題。可以通過類似的方式調控核酸的轉錄。一些合適的調節區僅在或主要在某些細胞類型中起始轉錄。用於在植物基因組 DNA中鑑定和表徵調節區的方法是已知的，包括例如以下參考文獻中描述的方法Jordano 等，Plant Cell, 1 :855_866 (1989) ；Bustos 等，Plant Cell, 1 :839_854 (1989) ；Green 等， EMBO J. ,7 4035-4044(1988) ；Meier 等，Plant Cell, 3 309-316 (1991)；和Zhang等，Plant Physiology, 110 1069-1079(1996)。多種調節區種類的實例在下文描述。下文指出的一些調節區以及其他調節區在 美國專利申請序列號 60/505，689 ；60/518，075 ；60/544，771 ；60/558，869 ；60/583，691 60/619，181 ；60/637，140 ；60/757，544 ；60/776，307 ；10/957，569 ；11/058，689 11/172，703 ； 11/208，308 ； 11/274，890 ；60/583，609 ；60/612, 891 ；11/097，589 11/233，726 ；11/408，791 ；11/414，142 ；10/950，321 ；11/360，017 ；PCT/US05/011105 PCT/US05/23639 ；PCT/US05/034308 ；PCT/US05/034343 ；禾口 PCT/US06/038236 ；PCT/ US06/040572 ；和 PCT/US07/62762 中更詳細地描述。例如，調節區p326、YP0144、YP0190、pl3879、YP0050、p32449、21876、YP0158、 YP0214、YP0380、PT0848、PT0633、YP0128、YP0275、PT0660、PT0683、PT0758、PT0613、PT0672、 PT0688、PT0837、YP0092、PT0676、PT0708、YP0396、YP0007、YP0111、YP0103、YP0028、YP0121、 YP0008、YP0039、YP0115、YP0119、YP0120、YP0374、YP0101、YP0102、YP0110、YP0117、YP0137、 YP0285、YP0212、YP0097、YP0107、YP0088、YP0143、YP0156、PT0650、PT0695、PT0723、PT0838、 PT0879、PT0740、PT0535、PT0668、PT0886、PT0585、YP0381、YP0337、PT0710、YP0356、YP0385、 YP0384、YP0286、YP0377、PD1367、PT0863、PT0829、PT0665、PT0678、YP0086、YP0188、YP0263、 PT0743和YP0096的序列示於PCT/US06/040572的序列表中；調節區PT0625的序列示於 PCT/US05/034343 的序列表中；調節區 PT0623、YP0388、YP0087、YP0093、YP0108、YP0022 和 YP0080的序列公開於美國專利申請序列號11/172，703的序列表中；調節區PR0924的序 列公開於 PCT/US07/62762 的序列表中；調節區 p530cl0、p0sFIE2_2、pOsMEA、p0sYpl02 和 p0sYp285的序列示於PCT/US06/038236的序列表中。應當明白調節區可以基於它在一種植物物種中的活性滿足一種分類標準，但是基 於它在另一種植物物種中的活性滿足不同的分類標準。i.廣泛表達的啟動子
當啟動子在許多(但不必須是全部)植物組織中促進轉錄時，其可以被稱作是 「廣泛表達的」。例如，廣泛表達的啟動子可以在一個或多個枝條、枝端(頂端)和葉中促 進有效連接的序列轉錄，但是在如根或莖的組織中弱促進或完全不促進轉錄。另一個實例 是，廣泛表達的啟動子能夠在一個或多個莖、枝條、枝端(頂端)和葉中促進有效連接的序 列轉錄，但是在如花和產生種子的生殖組織中能夠弱促進或完全不促進轉錄。可以包含在 本文提供的核酸構建體中的廣泛表達啟動子的非限制性實例包括P326、YP0144、YP0190、 pl3879、YP0050、p32449、21876、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848 和 PT0633 啟動子。其他 的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、甘露鹼合酶(MAS)啟動子、來自根瘤農桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA 的 1，或 2，啟動子、玄參(figmort)花葉病毒 34S 啟 動子、諸如稻肌動蛋白啟動子的肌動蛋白啟動子，以及諸如玉米泛素-1啟動子的泛素啟動 子。在一些情況下，CaMV 35S啟動子從廣泛表達的啟動子範疇中被排除。ii.根啟動子根活性啟動子在根組織(例如根內皮層、根表皮或根維管組織)中賦予轉錄。在 一些實施方案中，根活性啟動子是根優先的啟動子，即僅在或主要在根組織中賦予轉錄。根 優先的啟動子包括YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683和PT0758啟動子。其他根優 先的啟動子包括PT0613)、PT0672、PT0688和PT0837啟動子，其主要在根組織中驅動轉錄， 在胚珠和/或種子中較低程度地驅動轉錄。根優先的啟動子的其他實例包括CaMV 35S啟 動子的根特異的亞結構域(Lam等人，Proc. Natl. Acad. Sci.美國86 =7890-7894 (1989)), Conkling等人，Plant Physiol. 93 :1203_1211 (1990)報導的根細胞特異啟動子和菸草RD2 啟動子。iii.成熟胚乳啟動子在一些實施方案中，在成熟中的胚乳中驅動轉錄的啟動子可以是有用的。來自成 熟胚乳啟動子的轉錄通常在受精之後開始，並主要發生於種子發育期間的胚乳組織中，並 且通常在細胞化期(cellularization phase)最高。最合適的是主要在成熟中的胚乳中有 活性的啟動子，儘管有時能夠使用在其他組織中也有活性的啟動子。可以包含在本文提供 的核酸構建體中的成熟中胚乳啟動子的非限制性實例包括油菜籽蛋白啟動子、Arcelin-5 啟動子、菜豆蛋白啟動子(Bustos等人Plant Cell 1(9) :839_853 (1989))、大豆胰蛋白酶 抑制劑啟動子(Riggs 等人 Plant Cell 1(6) :609_621 (1989))、ACP 啟動子(Baerson 等 人 Plant Mol Biol, 22 (2) :255_267 (1993))、硬脂醯-ACP 去飽和酶啟動子(Slocombe 等人 Plant Physiol 104(4) 167-176 (1994) )、3 -伴大豆球蛋白(conglycinin)的大豆 a 『亞 基啟動子(Chen等人Proc. Natl. Acad. Sci.美國83 :8560_8564(1986))、油質蛋白啟動子 (Hong等人Plant MolBiol 34(3) :549_555 (1997))和玉米醇溶蛋白啟動子(如15kD玉米 醇溶蛋白啟動子、16kD玉米醇溶蛋白啟動子、19kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋 白啟動子和27kD玉米醇溶蛋白啟動子)。也合適的是來自稻穀蛋白-1基因的Osgt-1啟動 子(Zheng等人Mol. Cell Biol. 13 =5829-5842 (1993)), 3 -澱粉酶基因啟動子和大麥醇溶 蛋白基因啟動子。其他成熟中胚乳啟動子包括YP0092、PT0676和PT0708啟動子。iv.子房組織啟動子在子房組織如胚珠壁和中果皮中有活性的啟動子也可以是有用的，例如聚半乳糖 醛酸酐酶(polygalacturonidase)啟動子、香蕉TRX啟動子、瓜肌動蛋白啟動子、YP0396和
29PT0623。主要在胚珠中有活性的啟動子的實例為YP0007、YP0111、YP0092、YP0103、YP0028、 YP0121、YP0008、YP0039、YP0115、YP0119、YP0120 和 YP0374。v.胚囊/早期胚乳啟動子為了在胚囊/早期胚乳中實現表達，可以使用下述調節區，所述調節區在極核 (polar nuclei)和/或中央細胞中，或在極核前體中有活性，但不在卵細胞或卵細胞前體 中有活性。最合適的是僅在或主要在極核或其前體，和/或中央細胞中驅動表達的啟動子。 使用胚囊/早期胚乳優先的啟動子也可以發現從極核擴展進入早期胚乳發育的轉錄模式， 儘管在細胞化期期間和之後轉錄在晚期胚乳發育中通常顯著降低。合子或正在發育的胚中 的表達通常不與胚囊/早期胚乳啟動子一起存在。可適用的啟動子包括來自以下基因的啟動子擬南芥viviparous-1 (見 GenBank 號 U93215)；擬南芥 atmycl(見 Urao (1996)Plant Mol. Biol. ,32 :571_57 ； Conceicao (1994) Plant, 5 :493_505)；擬南芥 FIE (GenBank 號 AF129516)；擬南芥 MEA ；擬南 芥FIS2 (GenBank號AF096096)和FIE 1. 1 (美國專利6，906，244)。可適用的其他啟動子 可包括來自以下基因的啟動子玉米MAC1 (見Sheridan (1996)Genetics，142 1009-1020)； 玉米 Cat3(見 GenBank 號 L05934 ；Abler (1993) Plant Mol. Biol. ,22 10131-1038)。其他啟 動子包括以下的擬南芥啟動子YP0039、YP0101、YP0102、YP0110、YP0117、YP0119、YP0137、 DME、YP0285和YP0212。可適用的其他啟動子包括以下的稻啟動子p530cl0、p0sFIE2_2、 pOsMEA、p0sYpl02 和 p0sYp285。vi.胚啟動子優先在受精後的合子細胞中驅動轉錄的調節區能夠提供胚優先的表達。最合適的 是在心形階段之前優先在早期胚中驅動轉錄的啟動子，但是晚期和成熟胚中的表達也是合 適的。胚優先的啟動子包括大麥脂質轉移蛋白(Ltpl)啟動子(Plant Cell Rep (2001) 20 647-654)，YP0097、YP0107、YP0088、YP0143、YP0156、PT0650、PT0695、PT0723、PT0838、 PT0879 和 PT0740。vii.光合組織啟動子在光合組織中有活性的啟動子在綠色組織(如葉和莖)中賦予轉錄。最合適的是 僅在或主要在這類組織中驅動表達的啟動子。這類啟動子的實例包括核酮糖-1，5-二磷酸 羧化酶(RbcS)啟動子，如來自美洲落葉松(Larixlaricina)的RbcS啟動子、松樹cab6啟動 子(Yamamoto 等人Plant CellPhysiol. 35 :773_778 (1994))、來自小麥的 Cab_l 基因啟動子 (Fejes 等人Plant Mol. Biol. 15 :921_932 (1990))、來自菠菜的 CAB-1 啟動子(Lubberstedt 等人Plant Physiol. 104 :997_1006 (1994))、來自稻的 cablR啟動子(Luan等人Plant Cell 4 :971-981(1992))、來自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)啟動子(Matsuoka等人Proc Natl Acad. Sci 美國 90 :9586_9590 (1993))、菸草 Lhcbl*2 啟動子(Cerdan 等人Plant Mol. Biol. 33 :245-255(1997))、擬南芥SUC2蔗糖-H+同向轉運體啟動子(Truernit等人Planta 196 564-570(1995))和來自菠菜的類囊體膜蛋白質啟動子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、 atpC、atpD、cab、rbcS)。其他光合組織啟動子為 PT0535、PT0668、PT0886、PR0924、YP0144、 YP0380 和 PT0585。viii.維管組織啟動子在維管束中具有高活性或優先活性的啟動子的實例包括YP0087、YP0093、YP0108、
30YP0022和YP0080。其他維管組織優先的啟動子包括富含甘氨酸的細胞壁蛋白質GRP 1.8 啟動子(Keller 和 Baumgartner, PlantCell, 3 (10) 1051-1061 (1991))、鴨蹠草屬 (Commelina)黃斑病毒(CoYMV)啟動子(Medberry 等，Plant Cell,4(2) 185-192 (1992)) 和稻東格魯杆狀病毒(tungro bacilliform virus, RTBV))啟動子(Dai 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,101(2) :687_692(2004))。ix.誘導型啟動子誘導型啟動子響應外界刺激(如化學物質或環境刺激)而賦予轉錄。例如，誘 導型啟動子可響應激素(如赤黴素或乙烯)或響應光照或乾旱而賦予轉錄。乾旱誘導型 啟動子包括 YP0380、PT0848、YP0381、YP0337、YP0337、PT0633、YP0374、PT0710、YP0356、 YP0385、YP0396、YP0388、YP0384、PT0688、YP0286、YP0377、PD1367 和 PD0901。氮誘導型啟 動子的實例包括PT0863、PT0829、PT0665和PT0886。黑暗誘導型啟動子的實例包括PR0924 和PT0678。鹽誘導的啟動子的一個實例是rd29A(Kasuga等(1999)Nature Biotech 17: 287-291)。x.基礎啟動子基礎啟動子是轉錄起始所需的轉錄複合物裝配必需的最小序列。基礎啟動子常常 包含可位於轉錄起始位點上遊約15個到約35個核苷酸之間的「TATA盒」元件。基礎啟動 子還可包含「CCAAT盒」元件(一般為序列CCAAT)和/或GGGCG序列，其可位於轉錄起點上 遊約40和約200個核苷酸之間，一般為上遊約60到約120個核苷酸之間。xi.其他啟動子其他種類的啟動子包括但不僅限於枝條優先的、愈傷組織優先的、藻絲細胞優先 的、保衛細胞優先的如PT0678、塊莖優先的、薄壁組織細胞優先的和衰老優先的啟動子。如 上述參考專利申請中所述，被命名為YP0086、YP0188、YP0263、PT0758、PT0743、PT0829、 YP0119和YP0096的啟動子也可是有用的。xii.其他調節區5』非翻譯區(UTR)可以包含在本文所述的核酸構建體中。5』 UTR被轉錄，但是不 被翻譯，並位於轉錄物的起點和轉錄起始密碼子之間，並可包括+1核苷酸。3』 UTR可位於 轉錄終止密碼子和轉錄物末端之間。UTR可具有如提高mRNA穩定性或減弱翻譯的具體功 能。3』 UTR的實例包括但不限於聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列，例如胭脂氨酸合酶終止 序列。應當理解多於一種調節區可存在於重組多核苷酸中，例如內含子、增強子、上遊激 活區、轉錄終止子和誘導型元件。因此，例如多於一種調節區可以與編碼鹽和/或氧化脅迫 耐性調控多肽的多核苷酸序列有效連接。調節區(例如內源基因的啟動子)可以通過化學合成獲得，或通過從包含此類調 節區的基因組DNA中亞克隆獲得。包含這類調節區的核酸也可以包含含有限制性酶切位點 的側翼序列，所述限制性酶切位點有助於隨後的操作。或者，可以使用兩組分系統完成異常表達，其中第一組分由轉基因植物組成，所述 轉基因植物包含與啟動子有效連接的轉錄激活因子，第二組分由下述轉基因植物組成，所 述轉基因植物包含與轉錄激活因子的靶結合序列/區有效連接的本發明的核酸分子。將 兩種轉基因植物雜交，並且本發明的核酸分子在所述植物後代中表達。在本發明的另一備選的實施方案中，可以通過將兩組分系統的序列轉化進同一轉基因植物品系中完成異常表 達。IV.轉基因植物和植物細胞A.轉化本發明還涉及包含至少一種本文所述重組核酸構建體的轉基因植物細胞和植物。 植物或植物細胞可以通過將構建體整合進其基因組中來轉化，即能夠被穩定轉化。穩定轉 化的細胞通常在每次細胞分裂時保留引入的核酸。植物或植物細胞也可以被瞬時轉化，使 得構建體不整合進其基因組中。瞬時轉化的細胞通常在每次細胞分裂時丟失所有或部分引 入的核酸構建體，使得引入的核酸在足量的細胞分裂後不能在子細胞中檢出。瞬時轉化和 穩定轉化的轉基因植物和植物細胞卻可用於本文所述的方法中。本文所述方法中使用的轉基因植物可組成整株植物的部分或全部。這類植物可以 在培養箱中、溫室中或者大田中，以適合所述物種的方式生長。轉基因植物可以根據期望育 種來實現具體的目的，例如將重組核酸引入其他品系中，將重組核酸轉移至其他物種，或進 一步選擇其他想要的性狀。或者，對適合這類技術的物種而言，可以營養繁殖轉基因植物。 在本文中使用時，轉基因植物也表示具有轉基因的初始轉基因植物後代。可以培養轉基因 植物產生的種子，然後將其自交(或異型雜交和自交)，獲得對核酸構建體而言純合的種 子。可以在懸浮培養物或組織或器官培養物中培養轉基因植物。就本發明的目的而 言，可以使用固體和/或液體組織培養技術。使用固體培養基時，可以將轉基因植物細胞直 接置於培養基上，或置於濾器上，然後將該濾器與培養基接觸放置。使用液體培養基時，可 以將轉基因植物細胞置於漂浮設備(例如接觸液體培養基的多孔膜)上。固體培養基可以 是例如Murashige and Skoog(MS)培養基，其含有瓊脂和合適濃度的生長素例如2，4_ 二氯 苯氧乙酸(2，4-D)，和合適濃度的細胞分裂素(cytokinin)例如細胞分裂素(kinetin)。使用瞬時轉化的植物細胞時，轉化步驟中可包含編碼具有報導基因活性的報導基 因多肽的報導基因序列，並可在轉化後合適的時間進行報導基因活性或表達測定。進行測 定的合適時間通常為轉化後約1-21天，例如約1-14天、約1-7天或約1-3天。瞬時測定的 使用對不同物種中的快速分析而言尤其便利，或者用於證實具體受體細胞中先前未證實其 表達的異源鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽的表達。將核酸引入單子葉植物和雙子葉植物中的技術是本領域已知的，並且包括但 不限於農桿菌介導的轉化、病毒載體介導的轉化、電穿孔和粒子槍轉化，例如美國專利 5，538，880 ；5, 204，253 ；6, 329，571和6，013，863。如果使用細胞或培養的組織作為轉化的 受體組織，則需要時可以通過本領域技術人員已知的技術從轉化的培養物中再生植物。B.篩選/選擇可以在轉基因植物種群中篩選和/或選擇下述種群成員，其具有轉基因的表達所 賦予的性狀或表型。例如，可以從單次轉化事件的後代種群中篩選下述植物，所述植物具有 期望的鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性調控多肽或核酸的表達水平。可以使用物理和生物化 學方法鑑定表達水平。這些方法包括用於檢測多核苷酸的Southern分析或PCR擴增；用於 檢測RNA轉錄物的Northern印跡、SI RNase保護、引物延伸或RT-PCR擴增；用於檢測多肽 和多核苷酸的酶或核酶活性的酶測定；和用於檢測多肽的蛋白質凝膠電泳、Western印跡、
32免疫沉澱和酶聯免疫測定。也可以使用其他技術例如原位雜交、酶染色和免疫染色來檢測 多肽和/或多核苷酸的存在或表達。進行所有引用的技術的方法是已知的。作為一種備選 方案，可以在包含獨立轉化事件的植物種群中篩選具有期望性狀的植物，例如受調節的鹽 度耐性和/或氧化脅迫耐性水平。可以在一代或多代中、和/或多於一個地理位置中進行 選擇和/或篩選。在一些情況下，可以在下述條件下生長和選擇轉基因植物，所述條件誘導 期望表型或者以其他在轉基因植物中產生期望表型所必需的方式。另外，可以在具體的發 育階段期間應用選擇和/或篩選，所述發育階段中期望由植物表現所述表型。可以進行選 擇和/或篩選來選擇相對於缺乏轉基因的對照植物而言在鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性水 平中具有統計學顯著差異的轉基因植物。選擇或篩選的轉基因植物與相應的對照植物相比 具有改變的表型，如本文「轉基因植物表型」部分中所述。可以在轉基因植物種群中篩選和/或選擇下述種群成員，其具有轉基因的表達所 賦予的性狀或表型。例如，可以從單次轉化事件的後代種群中篩選下述植物，所述植物具有 期望的鹽和/或氧化脅迫耐性調控多肽和/或核酸的表達水平。可以使用物理和生物化學 方法鑑定表達水平。這些方法包括用於檢測多核苷酸的Southern分析或PCR擴增；用於檢 測RNA轉錄物的Northern印跡、SI RNase保護、引物延伸或RT-PCR擴增；用於檢測多肽和 多核苷酸的酶或核酶活性的酶測定；和用於檢測多肽的蛋白質凝膠電泳、Western印跡、免 疫沉澱和酶聯免疫測定。也可以使用其他技術例如原位雜交、酶染色和免疫染色來檢測多 肽和/或多核苷酸的存在或表達。進行所有引用的技術的方法是已知的。作為一種備選方 案，可以在包含獨立轉化事件的植物種群中篩選具有期望性狀的植物，例如受調節的鹽度 耐性和/或氧化脅迫耐性水平。可以在一代或多代中、和/或多於一個地理位置中進行選 擇和/或篩選。在一些情況下，可以在下述條件下生長和選擇轉基因植物，所述條件誘導期 望表型或者以其他方式是轉基因植物中產生期望表型所必需的。另外，可以在具體的發育 階段期間應用選擇和/或篩選，所述發育階段中期望由植物表現所述表型。可以進行選擇 和/或篩選來選擇相對於缺乏轉基因的對照植物而言，在鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性水 平中具有統計學顯著差異的轉基因植物。選擇或篩選的轉基因植物與相應的對照植物相比 具有改變的表型，如本文「轉基因植物表型」部分中所述。C.植物物種可以使用本文所述多核苷酸和載體轉化大量單子葉植物和雙子葉植物和植物 細胞體系，包括來自以下科之一的物種爵床科(Acanthaceae)、蔥科(Alliaceae)、六 出花禾鬥(Alstroemeriaceae)、石蒜禾鬥(Amaryllidaceae)、夾竹桃禾鬥(Apocynaceae)、掠 櫚禾鬥(Arecaceae)、菊禾鬥(Asteraceae)、小檗禾鬥(Berberidaceae)、紅木禾鬥(Bixaceae)、 十字花禾鬥(Brassicaceae)、鳳梨禾鬥(Bromeliaceae)、大麻禾鬥(Cannabaceae)、石竹 禾4" (Caryophy 1 laceae). ~ 4c ^ (Cephalotaxaceae)、胃禾4" (Chenopodiaceae) > ^C 7jC 仙禾鬥(Colchicaceae)、葫聲禾鬥(Cucurbitaceae)、薯裁禾鬥(Dioscoreaceae)、麻黃禾鬥 (Ephedraceae)、古柯禾鬥(Erythroxylaceae)、大戟禾鬥(Euphorbiaceae)、ii禾鬥(Fabaceae)、 唇形禾鬥(Lamiaceae)、亞麻禾鬥(Linaceae)、石松禾鬥(Lycopodiaceae)、錦葵禾鬥(Malvaceae) > 黑藥花科(Melanthiaceae)、芭蕉科(Musaceae)、桃金孃科(Myrtaceae)、珙桐科 (Nyssaceae)、S粟禾鬥(Papaveraceae)、松禾鬥(Pinaceae)、車前禾鬥(Plantaginaceae)、禾本 科(Poaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、楊柳科(Salicaceae)、無患子科(Sapindaceae)、爺禾鬥(Solanaceae)、紅ii杉禾鬥(Taxaceae)、山茶禾鬥(Theaceae)或葡萄禾鬥 (Vitaceae)。合適的物種可包括以下屬的成員秋葵屬(Abelmoschus)、冷杉屬(Abies)、 槭屬(Acer)、剪股穎屬(Agrostis)、蔥屬(Allium)、六出花屬(Alstroemeria)、風梨屬 (Ananas)、穿心蓮屬(Andrographis)、須芒草屬(Andropogon)、蒿屬(Artemisia)、聲竹 屬(Arundo)、顛茄屬(Atropa)、小檗屬(Berberis)、甜菜屬(Beta)、紅木屬(Bixa)、芸苔 屬(Brassica)、金蓋花屬(Calendula)、山茶屬(Camellia)、喜樹屬(Camptotheca)、大麻 屬(Cannabis) > M M (Capsicum) > il^lt^M (Carthamus) >(Catharanthus) > 三尖杉屬(Cephalotaxus)、商嵩屬(Chrysanthemum)、金雞納屬(Cinchona)、西瓜 屬(Citrullus)、咖啡屬(Cof f ea)、秋水仙屬(Colchicum)、錦紫蘇屬(Coleus)、香瓜 屬(Cucumis)、南瓜屬(Cucurbita)、狗牙根屬(Cynodon)、曼陀羅屬(Datura)、石竹 屬(Dianthus)、毛地黃屬(Digitalis)、薯蕷屬(Dioscorea)、油棕屬(Elaeis)、麻黃 屬(Ephedra)、！^茅屬(Erianthus)、古柯屬(Erythroxylum)、按屬(Eucalyptus)、羊 茅屬(Festuca)、草莓屬(Fragaria)、雪花蓮屬(Galanthus)、大豆屬(Glycine)、草棉 屬(Gossypium)、向日葵屬(Helianthus)、橡膠樹屬(Hevea)、大麥屬(Hordeum)、天仙 子屬(Hyoscyamus)、麻風樹屬(Jatropha)、萵苣屬(Lactuca)、亞麻屬(Linum)、黑麥 草屬(Lolium)、羽扇豆屬(Lupinus)、番爺屬(Lycopersicon)、石松屬(Lycopodium)、 木薯屬(Manihot)、苜蓿屬(Medicago)、薄荷屬(Mentha)、芒屬(Miscanthus)、芭蕉屬 (Musa)、菸草屬(Nicotiana)、稻屬(Oryza)、黍屬(Panicum)、罌粟屬(Papaver)、銀膠菊屬 (Parthenium)、狼尾草屬(Pennisetum)、矮牽牛屬(Petunia)、草蘆屬(Phalaris)、梯牧草 屬(Phleum)、松屬(Pinus)、早熟禾屬(Poa)、大戟屬(Poinsettia)、楊屬(Populus)、蘿芙木 屬(Rauwolfia)、蓖麻屬(Ricinus)、薔薇屬(Rosa)、甘蔗屬(Saccharum)、楊柳屬(Salix)、 血根草屬(Sanguinaria)、賽直菪屬(Scopolia)、黑麥屬(Secale)、爺屬(Solanum)、高 梁(sorghum)、大米草屬(Spartina)、菠菜屬(Spinacea)、菊蒿屬(Tanacetum)、紅豆杉屬 (Taxus)、可可屬(Theobroma)、小黑麥屬(Triticosecale)、小麥屬(Triticum)、Uniola、藜 蘆屬(Veratrum)、蔓長春花屬(Vinca)、葡萄屬(Vitis)和玉蜀黍屬(Zea)。合適的物種包括黍屬物種、高粱屬物種、芒屬物種、甘蔗屬物種、蔗茅屬物種、 楊屬物禾中、大須芒草(Andropogon gerardii)、象草(Pennisetumpurpureum)、絲帶草 (Phalaris arundinacea)(草聲)、狗牙根(Cynodondactylon)(鐵線草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(Spartinapectinata)(Medicago sativa)(Arundo donax)、黑麥(Secalecereale)、楊柳屬物種(柳樹)、桉屬物種(尤加利樹)、小黑麥屬(小 麥屬-小麥X黑麥)和竹子。白勺 禾中日,(Helianthus annuus) ^X^E (Carthamustinctorius) > 麻風樹(Jatropha curcas)、蓖麻(Ricinus communis)、油掠櫚(Elaeis guineensis)、亞麻 (Linum usitatissimum)禾口#胃(Brassicajuncea)。合適的物種還包括甜菜(Beta vulgaris)和木薯(Manihot esculenta)。合適的物種還包括番爺(Lycopersicon esculentum)、萵苣(Lactucasativa)、 ^； ^ (Musa paradisiacal) ( # ^ ), S, # W (Solanum tuberosum) ( ± M ) > M
(Brassica oleracea)(花莖甘藍、花椰菜、抱子甘藍)、茶樹(Camellia sinensis)(茶)、草
34莓(Fragaria ananassa)、可可(Theobromacacao)、小果咖啡(Coffea arabica)(咖啡)、 葡萄(Vitis vinifera)、鳳梨(Ananas comosus)(菠蘿)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒 禾口舌甘椒)、洋蔥(Allium cepa)、舌甘瓜(Cucumis melo)(瓜)、黃瓜(Cucumis sativus)、輿 瓜(Cucurbita maxima)(南瓜)、南瓜(Cucurbita moschata)(南瓜)、菠菜(Spinacea oleracea)、西瓜(Citrullus lanatus)、咖啡黃葵(Abelmoschusesculentus)(羊角豆)禾口 ^p (Solanum melongena)。合適的物種還包括罌粟(Papaver somniferum)、東方罌粟(Papaverorientale)、 歐洲紅豆杉(Taxus baccata)、短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)、青蒿(Artemisia annua) >(Cannabis sativa)(Camptothecaacuminate)(Catharanthus roseus)、長春花(Vinca rosea)、金雞納樹(Cinchona officinalis) > 秋 7jC 仙 (Colchicum autumnale)、Veratrumcalifornica.、狹葉毛地黃(Digitalis lanata)、毛 地黃(Digitalis purpurea)、暮！i 屬物禾中、穿蓮(Andrographis paniculata)、真頁 (Atropabelladonna)、Datura stomonium、小檗屬物種、三尖杉屬物種、草麻黃(Ephedra sinica)、j^HM 禾中、(Erythroxylum coca) > Galanthuswornorii> ^^HM^fK 千層塔(Lycopodium serratum = Huperziaserrata)、石松屬物禾中、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、蘿芙木屬物禾中、血卞艮草(Sanguinaria canadensis)、天il]子屬物禾中、金
^ (Calendulaoff icinalis) >^ (Chrysanthemum parthenium)、^；喉#
(Coleusforskohlii)禾口zj、白菊(Tanacetum parthenium)。合適的物種還包括銀膠菊(Parthenium argentatum)、橡膠樹屬物種(橡膠)、 留蘭香(Mentha spicata)(薄荷)、歐薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、胭脂樹(Bixa orellana)和六出花屬物種。合適的物種還包括薔薇屬物種(玫瑰)、麝香石竹(Dianthuscaryophyllus)(康乃 馨)、矮牽牛屬物種(矮牽牛)和猩猩草(Poinsettiapulcherrima)。合適的物種還包括菸草(Nicotiana tabacum)、白羽扇豆(Lupinusalbus)(羽扇 豆)、Uniola paniculata (燕麥)、bentgrass (剪股穎屬物禾中)、Populus tremuloides (白 楊)、松屬物種(松樹)、冷杉屬物種(冷杉)、槭屬物種(槭樹)、大麥(Hordeum vulgare)、 草地早熟禾(Poa pratensis)(藍草)、黑麥草屬物種(黑麥草)和貓尾草(Phleum pratense)(梯牧草)。因此，可以在寬泛的植物物種範圍中使用所述方法和組合物，包括來自雙子葉屬 芸苔屬、紅藍花屬、大豆屬、草棉屬、向日葵屬、麻風樹屬、銀膠菊屬、楊屬和蓖麻屬；和單子 葉屬油棕屬、羊茅屬、大麥屬、黑麥草屬、稻屬、黍屬、狼尾草屬、梯牧草屬、早熟禾屬、甘蔗 屬、黑麥屬、茄屬、小黑麥屬、小麥屬和玉蜀黍屬的物種。在一些實施方案中，植物是柳枝稷、 兩色蜀黍(高粱，雙色高粱)、巨芒草(芒屬)、甘蔗屬物種(能源蔗)、香脂白楊(白楊)、玉 蜀黍(玉米)、大豆(黃豆)、歐洲油菜(卡諾拉油菜)、普通小麥(小麥)、陸地棉(棉花)、 稻(水稻)、向日葵、紫苜蓿(苜蓿)、甜菜或御谷(珍珠粟)物種的成員。在某些實施方案中，可以使用本文所述多核苷酸和載體轉化大量單子葉和雙子葉 植物和植物細胞體系，其中這類植物是不同物種或物種變種(例如甘蔗屬物種X芒屬物種) 的雜種。D.轉基因植物表型
在一些實施方案中，其中鹽度和/或氧化脅迫調控多肽的表達得到調控的植物可 具有提高的鹽度和/或氧化脅迫耐性水平。例如，可以在轉基因植物中表達本文所述的鹽 度和/或氧化脅迫調控多肽，得到提高的鹽度和/或氧化脅迫耐性水平。與不表達轉基 因的相應對照植物中的水平相比，鹽度和/或氧化脅迫耐性水平可以提高至少2%，例如 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%, 19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或大於 60%。本發明的核酸分子和多肽是感興趣的，因為當核酸分子被異常表達(即在非天然 位點表達，或相對於野生型以被提高或降低的量表達)時，它們產生下述植物，所述植物與 野生型植物相比，顯示提高的鹽耐性和/或氧化脅迫耐性，如下文公開的多個實驗的結果 所部分證實。具體地，用本發明的核酸分子和多肽轉化的植物可具有大量與野生型植物相 比經修飾的特徵。經修飾的特徵的實例包括可以通過植物高度、葉或蓮座面積或乾物質測 量的光合效率、幼苗面積和生物量。可以在不同的植物發育階段例如種子、幼苗、抽苔、衰老 等等中觀察和測量經修飾的特徵。通常，鹽或氧化耐性可以被表述為測量的比例或組合，例 如鹽生長指數值或水楊酸生長指數值。例如，用本發明序列轉化的植物可顯示至少5%、至 少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少200%、至少300%、至少400% 或甚至至少500%的SGI、幼苗面積和/或SAGI值提高。這些性狀可以被用於開發或最大 化植物產品。例如，本發明的核酸分子和多肽被用於提高基因的表達，這引起植物在鹽和/ 或氧化條件下與相同條件下的野生型植物相比具有提高的生物量、生長速率和/或幼苗活 力。因為公開的序列和方法提高鹽和/或氧化脅迫條件下的營養生長和生長速率，所 以公開的方法能夠用於增加在鹽和/或氧化條件下生長的植物中的植物生長。例如，本發 明的植物在鹽和/或氧化條件下與下述植物相比顯示提高的光合成效率和提高的幼苗面 積，所述植物是相同物種但是未經遺傳修飾為主要是營養生長。生物量產生提高的實例包 括與相同條件下相同物種的野生型植物的生物量產生相比，至少5%、至少20%、或甚至至 少50%的提高。通常，使用適當參數或非參數統計學(例如x方檢驗、學生t_檢驗、 Marm-Whitney檢驗或F-檢驗)時，轉基因植物或細胞相對於對照植物或細胞而言對鹽度和 /或氧化脅迫耐性量的差異在p < 0. 05時被認為是統計學顯著的。在一些實施方案中，鹽 度和/或氧化脅迫耐性量的差異在P < 0. 01、p < 0. 005或？ < 0. 001時是統計學顯著的。相對於對照植物評價轉基因植物的表型。當植物顯示的多肽量或編碼多肽的 mRNA量少於目的植物顯示量的10%，例如少於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、 0.5%、0.1%、0.01%或0.001%時，植物被稱作「不表達」所述多肽。可以使用下述方法評價 表達，所述方法包括例如RT-PCR、Northern印跡、SI RNase保護、引物延伸、Western印跡、 蛋白質凝膠電泳、免疫沉澱、酶聯免疫測定、晶片測定和質譜法。應當注意，如果多肽在組織 優先或廣泛表達啟動子的控制下表達，則可以在整株植物或選擇的組織中評價表達。類似 地，如果多肽在特定時間(例如發育或誘導後的特定時間)表達，則可以在期望的時間段中 選擇性地評價表達。V.植物育種遺傳多態性是種群中離散的等位基因序列差異。通常，以或更多存在的等位基因被認為是遺傳多態性。本文公開的多肽能夠調控鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性含量的發 現可用於植物育種，因為對這類多肽的基因座顯示一定程度連鎖的遺傳多態性更可能與鹽 度耐性和/或氧化脅迫耐性性狀的變異相關。例如，與這類多肽基因座關聯的遺傳多態性 更可能用於標記物輔助的育種程序中，產生在鹽度耐性和/或氧化脅迫耐性性狀中具有期 望調控的品系。因此，本發明的一個方面包括鑑定一種或多種遺傳多態性是否與鹽度耐性和/或 氧化脅迫耐性性狀的變異相關的方法。這類方法涉及測定給定種群內的遺傳多態性是否與 圖1到6中所示多肽之一和/或其功能性同源物(例如但不限於序列表中所示功能性同源 物)的基因座顯示連鎖。測量植物種群中鹽度耐性性狀和/或氧化脅迫耐性性狀的變異和 種群植物中一個或多個遺傳多態性的存在之間的關聯，從而鑑定一個或多個遺傳多態性是 否與性狀的變異相關。如果具體等位基因的存在統計學顯著地與鹽度耐性和/或氧化脅迫 耐性性狀的期望調控相關，則等位基因與所述一種或兩種性狀的變異相關，並可用作一種 或多種所述性狀的標記物。另一方面，如果具體等位基因的存在不與期望的調控顯著相關， 則等位基因不與一種或多種所述性狀的變異相關，並且不可用作標記物。一些方法可用於下述種群，所述種群含有天然存在的內源多肽而不是編碼所述多 肽的外源核酸，即所述種群對外源核酸而言不是轉基因的。然而，應當理解，適用於所述方 法的種群可含有針對另一不同性狀(例如除草劑抗性)的轉基因。適用於這類方法中的遺傳多態性包括簡單序列重複(SSR，或微衛星)、多態DNA的 快速擴增(RAPD)、單核苷酸多態性(SNP)、擴增的片段長度多態性(AFLP)和限制性片段長 度多態性(RFLP)。例如可以如下鑑定SSR多態性製備序列特異性探針，並通過PCR從目 的種群中的個體擴增模板DNA。如果探針在種群中SSR的兩側，則會產生不同大小的PCR 產物。見例如美國專利5，766，847。或者，可以通過使用一個或多個PCR產物作為探針， 針對來自種群中不同個體的Southern印跡鑑定SSR多態性。見U. H. Refseth等，(1997) Electrophoresis 18 1519。RFLP 的鑑定例如在 Alonso-Blanco 等(Methods in Molecular Biology,第 82 卷，"ArabidopsisProtocols，，，第 137-146 頁，J. M. Martinez-Zapater 禾口 J.Salinas 編，c. 1998, Humana Press, Totowa, NJ) ；Burr( "Mapping Genes with Recombinantlnbreds，，，第 249-254頁，Freeling，M.禾口 V. Walbot (編)，The MaizeHandbook, c.1994, Springer-Verlag New York, Inc. :New York, NY, USA ；Berlin Germany ;Burr 等 Genetics (1998) 118 :519 ；和 Gardiner，J. (1993) Genetics 134:917)中討論。AFLP 的 鑑定在例如EP 0 534 858和美國專利5，878，215中討論。在一些實施方案中，該方法涉及對植物品系育種。這類方法在標記物輔助的育種 程序中使用如上文所述鑑定的遺傳多態性以便於開發下述品系，所述品系在一種或多種鹽 度耐性和/或氧化脅迫耐性性狀中具有期望的改變。一旦合適的遺傳多態性被鑑定為與性 狀的變異相關，則鑑定具有與期望的變異相關的多態等位基因的一株或多株個體植物。然 後在育種程序中使用這些植物，將多態等位基因和與期望變異相關的其他基因座上的大量 其他等位基因組合。適用於植物育種程序中的技術是本領域已知的，並且包括但不限於， 回交、混合選擇(mass selection)、系譜育種、混合選擇(bulkselection)、與其他種群雜 交和輪迴選擇。這些技術可以單獨使用或者與育種程序中的一種或多種其他技術組合使 用。因此，使每株鑑定的植物自交或與不同的植物雜交產生種子，隨後使所述種子萌發形成
37後代植物。然後使至少一株這類後代植物自交或與不同的植物雜交形成後繼的後代世代 (subsequent progeny generation)。育種程序可以適當地將自交或異型雜交再重複0到 5個世代，從而在得到的植物品系中實現期望的均一性和穩定性，所述得到的植物品系保留 多態等位基因。在大部分育種程序中，應當在每個世代中進行具體的多態等位基因分析，盡 管需要時可以在交替的世代中進行分析。在一些情況下，還進行對其他有用性狀到選擇，例如選擇真菌抗性或細菌抗性。針 對這類其他性狀的選擇可以在鑑定具有期望多態等位基因的個體植物之前、期間或之後進 行。VI.製造物品(article of manufacture)本文提供的轉基因植物在農業和能源生產工業中具有多種用途。例如，本文所述 轉基因植物可用於製造動物飼料和食品。然而這類植物通常尤其可用作能源生產的原料。本文所述轉基因植物相對於缺乏外源核酸的對照植物而言，通常每公頃產生更高 的穀物和/或生物量產量。在一些實施方案中，在降低的投入(例如肥料和/或水)的條 件下生長時，這類轉基因植物相對於對照植物而言每公頃提供相等或甚至提高的穀物和/ 或生物量產量。因此，可以使用這類轉基因植物在更低的投入成本和/或環境脅迫的條件 例如乾旱下提供產量穩定性。在一些實施方案中，本文所述植物具有下述組成，所述組成允 許被更有效地加工成游離糖隨後加工成醇，用於能源生產。在一些實施方案中，這類植物相 對於對照植物而言每千克植物材料提供更高的乙醇、丁醇、其他生物燃料分子和/或糖衍 生的副產物的產量。通過在相等或甚至降低的生產成本下提供相對於對照更高的產量，本 文所述的轉基因植物對農民和加工者而言提高了收益率，並且對消費者而言降低了成本。可以通過本領域已知的手段使來自本文所述轉基因植物的種子保持良好狀態並 裝袋在包裝材料中，形成製造物品。包裝材料例如紙和布是本領域公知的。種子的包裝可 具有描述其中種子特質的標記，例如縫在包裝材料上的標籤或標記、印製在包裝材料上的 標記、或插入包裝內的標記。增強的鹽和/或氧化脅迫耐性提供了下述機會在鹽或氧化脅迫條件下培養作物 而沒有鹽誘導的離子失衡、水內穩態的破壞、代謝的抑制、對膜的損害和/或細胞死亡導致 的矮化生長和減少的產量。在鹽或氧化脅迫條件下培養植物的能力會導致可耕田地的全面 擴張，和目前由於提高的鹽度或氧化脅迫條件而具有較低生產力的土地的提高的產出。種子或幼苗活力是能夠大幅影響植物(例如作物植物)成功生長的一個重要特 徵。不利的環境條件例如鹽和/或氧化條件能夠影響植物生長周期、種子萌發和幼苗活力 (即在這類條件下成功和失敗的植物生長之間生活力和強度會有差異)。幼苗活力通常被 定義為包括下述種子特性，所述種子特性確定「在大範圍大田條件下正常幼苗快速、均一發 生和發育的潛能」。因此，開發下述植物種子是有利的，所述植物種子具有提高的活力，尤其 是在提高的鹽度和/或氧化脅迫條件下。例如，對於穀物植物例如稻、玉米、小麥等等的產生而言，提高的種子活力會是有 利的。對這些作物而言，鹽化和/或氧化通常會減緩或終止萌發和生長。因此尋找與鹽和 /或氧化脅迫條件下提高的種子活力相關的基因來產生改進的植物變種(Walia等(2005) Plant Physiology 139 :822_835)。本發明將在以下實施例中進一步描述，所述實施例不限制權利要求書中所述本發
38明的範圍。VII.實施例實施例1 農桿菌介導的擬南芥轉化宿主植物和轉基因用含有下述克隆的Ti質粒獨立轉化野生型擬南芥 ffassilewskija(WS)植物，所述克隆編碼 SEQ ID NO :43、44、45、86、136、138、140、141、 142、143、144和SEQ ID NO 140的胺基酸等同物1到135的多肽。實例包括Ceres克隆 ID no. 1792354、Ceres SEEDLINE IDno. ME06748、Ceres SEEDLINE ID no. ME08768、Ceres SEEDLINE IDno. ME19173 和 Ceres 克隆 ID no. 375578。除非另有說明，每個 Ceres 克隆和 / 或來自克隆的幼苗處於相對於Ti質粒中任一 35S啟動子而言有義的方向上。適用於這類 構建體的Ti質粒載體CRS 338含有Ceres-構建的植物可選擇標記基因膦絲菌素乙醯轉移 酶(PAT)，其賦予被轉化的植物除草劑抗性。土壤混合物的製備將 24L SunshineMix#5 土壤(Sun Gro Horticulture, Ltd.， Bellevue, WA)與 16L Therm-0-Rock 蛭石(Therm-0-Rock West, Inc.，Chandler, AZ)在水 泥混合機(cement mixer)中混合，製備60 40的土壤混合物。向該土壤混合物中添加2 Tbsp Marathon 顆粒(Hummert，EarthCity，M0)、3Tbsp 0SM0C0TE 14-14-14 (Hummert， Earth City, M0)和 lTbsp Peters 肥料 20-20-20 (J. R. Peters, Inc.，Allentown, PA)，這些 被添加 的成分首先被添加進3加侖水中，然後添加進土壤中並充分混合。一般用土壤混合 物填充4-英寸直徑的花盆。然後用8-英寸的尼龍膜方塊覆蓋花盆。種植使用60mL注射器抽吸35mL的種子混合物。向每盆中添加25滴。在花盆頂 部放置透明的繁殖蓋子(propagation dome)，然後將盆置於55%陰影的編織物下並通過添 加1英寸水進行地下灌溉(subirrigated)。植物培養種植後3到4天，去除蓋子和陰影編織物。根據需要給植物澆水。7-10 天后，使用鑷子將花盆間苗至每盆20株植物。2周後，用Peters肥料以每加侖水ITsp的 比率對所有的植物進行地下灌溉。當花芽(bolt)約5-10釐米長時，將其在第一節和莖底 部之間修剪以誘導次生花芽(secondary bolt)。修剪後6到7天進行浸泡浸潤(Dipping infiltration)。農桿菌的製備向150mL新鮮的YEB中添加各0. lmL的羧苄西林、壯觀黴素和利福 平(各為100mg/ml的儲存濃度)。獲得農桿菌起子板(starter block)(含有生長至0D_ 約1. 0的農桿菌培養物的96-孔板)並通過從起子板的適當孔中轉移lmL來接種每種構建 體一個培養瓶。然後將培養物在27°C振蕩培養。達到約1. 0的0D6TO(約24小時)後將培 養物離心。向重懸的農桿菌沉澱物中添加200mL浸潤培養基。浸潤培養基通過向900mL水 中添加2. 2g MS鹽、50g蔗糖和5 u 1 2mg/ml苄氨基嘌呤製備。浸泡浸潤將花盆倒置並浸入水中5分鐘，從而植物的地上部分被置於農桿菌懸 浮液中。允許植物正常生長並收集種子。實施例2 鹽條件篩選鹽條件篩選篩選常規地通過高鹽瓊脂平板測定以及高鹽土壤測定進行。在高鹽 條件下評價的性狀包括幼苗面積、光合效率、鹽生長指數和再生能力。幼苗面積約2周齡幼小植物的總葉面積。光合效率(Fv/Fm)通過最大螢光信號Fm和可變螢光Fv之間的關係評價幼苗光合效率或通過光系統II的電子傳遞。本文中，最適量子產率(Fv/Fm)的降低表示脅迫，因 此可以被用於監測鹽脅迫條件下與非轉基因植物相比轉基因植物的性能。鹽牛長指數=幼苗面積x光合效率(Fv/Fm)。再牛能力將莖切除後植物在鹽土壤中再生枝條的能力，土壤用200mM NaCl溶液 灌溉。轉化體鑑定使用PCR在一個隨機選擇的T2植物中擴增cDNA插入片段。然後測 序該PCR產物來證實植物中的序列。鑑定鹽脅迫耐件棺物在種子的超級池(superpool)中篩選對SA(如下文詳 述)和高鹽顯示增強耐性的轉基因植物。對三個獨立的候選植物測序，並且轉基因序列與 ME02064 匹配。評價對鹽脅迫的耐件通常選擇四到十個獨立轉化的植物品系並定性評價它們在 1\世代中對鹽脅迫的耐性。選擇兩個或三個在世代中定性地顯示最強鹽脅迫耐性的轉化 品系，在T2和T3世代中進行進一步評價。該評價涉及將來自所選擇的轉化植物品系的種子 播種在含lOOmM或150mM NaCl的MS瓊脂平板上，並將種子孵育5到14天，允許其萌發和 生長。例如，對ME02064而言，在鹽平板上比較五個T2事件與野生型Ws的鹽脅迫。與對照 Ws相比，基於對每個事件36株植物幼苗面積的測量選擇三個事件ME02064-01、-03和-04。 用T2和T3世代在ME02064-01、-03和-04中進行鹽耐性的進一步評價。計算SGI 在萌發和牛長後，測定轉化品系和野牛型對照的幼苗面積和光合效率。 從這些測量中計算鹽生長指數(SGI)，並在野生型和轉化的幼苗之間比較。通過用每個轉化 品系和野生型對照的36株幼苗一式兩份獲得的幼苗面積乘以光合效率測量(結果)來計 算SGI，並進行t-檢驗。測定轉基因拷貝數在BASTA 平板上測試T2世代轉化植物，從而測定每個轉化品 系的轉基因拷貝數。15 1的BASTA 抗性BASTA 敏感分離比通常表明兩個拷貝的轉 基因，3 1的這類分離比通常表明一個拷貝的轉基因。實施例3 氧化脅迫條件篩選在正常的生長條件下，擬南芥蓮座包含約0. g/g鮮重的游離SA。應答脅迫條 件或病原體攻擊時，游離SA水平可達到高達10 u g/g鮮重，大約等於60 u M。通過噴霧向 擬南芥葉上外源應用100-500 yM SA能夠誘導強防禦應答而不引發明顯的壞死損害形成。 一旦SA濃度提高至5mM或更高，壞死損害形式的細胞死亡會出現在被噴霧的葉上。如果通 過生長培養基應用SA，則擬南芥對SA-誘導的氧化脅迫更加敏感，可能歸因於持續的吸收。 向生長培養基中添加100-150 yM SA足以降低植物生長，但是不殺死野生型擬南芥Ws中的 植物。因此，我們使用這一範圍的SA篩選增強的氧化脅迫耐性。水楊酸篩選常規地，使用100 ii M或150 u M外源水楊酸鈉，通過瓊脂平板測定進 行篩選。培養基含有1/2X MS (Sigma)、150 iiM水楊酸鈉(Sigma) ,0. 5g MES水合物(Sigma) 和 0. 7% phytagar (EM Science)，使用 ION K0H 調節至 pH 5. 7。為了篩選超級池，將種子在30%漂白溶液中表面滅菌5分鐘，然後用無菌水重複 衝洗。以每個平板850粒種子的密度，將約2500粒種子單層播種在培養基平板上。在相當 的平板上培養野生型和陽性對照。用通氣帶纏繞平板，並在4°C暗中放置三天使其成層。這 段時間結束時，將平板轉移至Conviron培養箱中，所述培養箱設定為22°C、16 8小時的
40光暗循環、70%溼度、具有發射 100 y愛因斯坦光強度的白熾燈和銀光燈的組合。從第6天開始每天篩選幼苗。選擇與WS對照植物相比生長得更大並且保持更綠 的幼苗作為陽性候選者，並轉移至土壤中進行恢復和結籽。通過將來自每個候選者的36粒種子與WS對照一起置於相同的水楊酸鈉平板上， 對候選植物進行再篩選。如上文所述處理植物，並在萌發後4天開始幼苗篩選。從確認有 耐性的候選者中收穫葉組織用於DNA提取，並通過PCR擴增轉基因。或者，將超級池直接播種在土壤上並用10mM SA噴霧。從耐性候選植物中收穫葉 組織以分離用於PCR擴增轉基因的DNA，隨後對PCR產物測序。在水楊酸鈉條件下評價的性狀包括幼苗面積、光合效率、水楊酸生長指數(SAG) 和再生能力。幼苗面積約2周齡的幼小植物的總葉面積。光合效率(Fv/Fm)通過最大螢光信號Fm和可變螢光Fv之間的關係評價幼苗光 合效率或通過光系統II的電子傳遞。本文中，最適量子產率(Fv/Fm)的降低表示脅迫，因 此可以被用於監測氧化脅迫條件下與非轉基因植物相比轉基因植物的性能。水楊酸牛長(SAG)指數=幼苗面積(cm2) x光合效率(Fv/Fm)。在一株隨機選擇的T2植物中使用PCR擴增cDNA插入片段。然後對該PCR產物測 序以驗證植物中的序列。評價對氧化脅迫的耐性最初針對所有可獲得的獨立轉化的T2植物品系定性評 價它們與野生型對照相比對氧化脅迫的耐性。選擇定性顯示對氧化脅迫最強耐性的陽性轉 基因品系，用於使用內部非轉基因分離體作為對照在T2和T3世代中進一步評價。該評價涉 及將來自所選擇的轉化植物品系的種子播種在含lOOyM或150PM水楊酸鈉的MS瓊脂平 板上，並將種子孵育至少4天，允許萌發和生長以及轉基因狀態分析。計算SAG 萌發和生長後，測定轉化品系和野生型對照的幼苗面積和光合效率。從 這些測量結果中計算水楊酸生長指數(SAG)並在野生型和轉化幼苗之間比較。通過用每個 轉化品系和野生型對照的36株幼苗一式兩份獲得的幼苗面積乘以光合效率測量結果來計 算SAG，並進行t-檢驗。測定轉基因拷貝數在BASTA 平板上測試T2世代轉化植物，從而測定每個轉化品 系的轉基因拷貝數。15 1的BASTA 抗性BASTA 敏感分離比通常表明兩個拷貝的轉 基因，3 1的這類分離比通常表明一個拷貝的轉基因。在一些情況下，使用還補充了 100 u M SNP的培養基進行驗證。實施例4 :ME02064 (Ceres 克隆 375578 ;SEQ ID No. 138)用帶有35S啟動子和Ceres克隆375578的Ti質粒轉化野生型擬南芥 Wassilewskija。在預驗證實驗中，三個轉化品系 ME02064-01 和 ME02064-03、ME02064-04 顯示對鹽脅迫最強的定性耐性(表4-1)。在兩代驗證實驗中進一步評價它們對150mM NaCl 的耐性。分離比(BASTA 抗性BASTA 敏感)表明 ME02064-01 和 ME02064-03、ME02064_04 轉化品系各自帶有一個拷貝的轉基因。表4-1 與野生型Ws相比ME02064鹽耐性的預驗證實驗
4權利要求
產生具有提高的鹽度耐性或提高的氧化脅迫耐性的植物的方法，所述方法包括培養包含外源核酸的植物細胞，所述外源核酸包含與編碼多肽的核苷酸序列有效連接的調節區，並且其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約30，所述HMM以圖1 6之一中所示的胺基酸序列為基礎，並且其中所述植物與不包含所述核酸的對照植物對鹽度或氧化脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
2.根據權利要求1的方法，其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約 400，所述HMM以圖1中所示胺基酸序列為基礎。
3.根據權利要求1的方法，其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約 30，所述HMM以圖2中所示胺基酸序列為基礎。
4.根據權利要求1的方法，其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約 120，所述HMM以圖3中所示胺基酸序列為基礎。
5.根據權利要求1的方法，其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約 150，所述HMM以圖4中所示胺基酸序列為基礎。
6.根據權利要求1的方法，其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約 425，所述HMM以圖5中所示胺基酸序列為基礎。
7.根據權利要求1的方法，其中編碼所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約 550，所述HMM以圖6中所示胺基酸序列為基礎。
8.產生具有提高的鹽度耐性或提高的氧化脅迫耐性的植物的方法，所述方法包括培養 包含外源核酸的植物細胞，所述外源核酸包含與編碼下述多肽的核苷酸序列有效連接的調 節區，所述多Jft與選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、 29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、 66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、 106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、132、 134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、156、158、160、162、163、 165、166、167、168 JPSEQ ID NO :140的胺基酸等同物1到135的胺基酸序列具有至少85% 或更高的序列同一性，其中由所述植物細胞產生的所述植物與不包含所述核酸的對照植物 中的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
9.產生植物的方法，所述方法包括培養包含外源核酸的植物細胞，所述外源核酸包含 與下述核苷酸序列有效連接的調節區，所述核苷酸序列與選自SEQ ID N0:l、3、5、7、10、 12、16、18、21、26、28、32、34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79、82、 85、87、89、92、95、97、99、103、105、108、111、113、115、117、120、124、131、133、135、137、139、 146、148、150、152、155、157、159、161和164的核苷酸序列具有85%或更高的序列同一性， 其中由所述植物細胞產生的植物與不包含所述核酸的對照植物對鹽度或氧化脅迫的相應 耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
10.調控植物對鹽度或氧化脅迫耐性水平的方法，所述方法包括向植物細胞中引入外 源核酸，所述外源核酸包含與編碼多肽的核苷酸序列有效連接的調節區，其中編碼所述多 肽的胺基酸序列的HMM 二進位值大於約30，所述HMM以圖1-6之一中所示的胺基酸序列為 基礎，並且其中由所述植物細胞產生的植物與不包含所述外源核酸的對照植物對鹽度或氧 化脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
11.調控植物對鹽度或氧化脅迫耐性水平的方法，所述方法包括向植物細胞中引入外 源核酸，所述外源核酸包含與編碼下述多肽的核苷酸序列有效連接的調節區，其中所述多 肽與選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、24、25、27、29、30、31、33、 35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、62、63、64、66、68、69、71、 73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、102、104、106、107、109、 110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、130、132、134、136、138、 140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、156、158、160、162、163、165、166、167、 168，和SEQ ID NO 140的胺基酸等同物1到135的胺基酸序列具有85%或更高的序列同 一性，其中由所述植物細胞產生的植物與不包含所述核酸的對照植物對鹽度或氧化脅迫的 相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
12.權利要求1-8、10或11中任一項的方法，其中所述多肽選自SEQIDNO :43、44、45、 86、140、141、142、143、144和SEQ ID NO 140的胺基酸等同物1到135，並且所述植物與不 包含所述核酸的對照植物對鹽度的相應耐性水平相比，對鹽度的耐性水平有差異。
13.權利要求1-8、10或11中任一項的方法，其中所述多肽選自SEQIDN0:136和141， 並且所述植物與不包含所述核酸的對照植物對氧化脅迫的相應耐性水平相比，對氧化脅迫 的耐性水平有差異。
14.調控植物對鹽度或氧化脅迫耐性水平的方法，所述方法包括向植物細胞中引入外 源核酸，所述外源核酸包含與下述核苷酸序列有效連接的調節區，其中所述核苷酸序列與 選自 SEQ ID NO :1、3、5、7、10、12、16、18、21、26、28、32、34、40、46、48、51、53、55、57、59、61、 65、67、70、72、75、77、79、82、85、87、89、92、95、97、99、103、105、108、111、113、115、117、120、 124、131、133、135、137、139、146、148、150、152、155、157、159、161 和 164 的核苷酸序列具有 85%或更高的序列同一性，其中由所述植物細胞產生的植物與不包含所述核酸的對照植物 對鹽度或氧化脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
15.包含外源核酸的植物細胞，所述外源核酸包含與編碼多肽的核苷酸序列有效連接 的調節區，其中所述多肽的胺基酸序列的HMM二進位值大於約30，所述HMM以圖1-6之一中 所示的胺基酸序列為基礎，並且其中所述植物與不包含所述核酸的對照植物對鹽度或氧化 脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
16.包含外源核酸的植物細胞，所述外源核酸包含與編碼多肽的核苷酸序列有效連接 的調節區，其中所述多肽與選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、9、11、13、14、15、17、19、20、22、23、 24、25、27、29、30、31、33、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、47、49、50、52、54、56、58、60、 62、63、64、66、68、69、71、73、74、76、78、80、81、83、84、86、88、90、91、93、94、96、98、100、101、 102、104、106、107、109、110、112、114、116、118、119、121、122、123、125、126、127、128、129、 130、132、134、136、138、140、141、142、143、144、145、147、149、151、153、154、156、158、160、 162、163、165、166、167、168和SEQ ID NO 140的胺基酸等同物1到135的胺基酸序列具有 至少85%或更高的序列同一性，其中由所述植物細胞產生的植物與不包含所述核酸的對照 植物中對鹽度或氧化脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性水平有差異。
17.包含外源核酸的植物細胞，所述外源核酸包含與下述核苷酸序列有效連接的調節 區，所述核苷酸序列與選自 SEQ ID NO :1、3、5、7、10、12、16、18、21、26、28、32、34、40、46、48、 51、53、55、57、59、61、65、67、70、72、75、77、79、82、85、87、89、92、95、97、99、103、105、108、`111、113、115、117、120、124、131、133、135、137、139、146、148、150、152、155、157、159、161和`164的核苷酸序列具有85%或更高的序列同一性，其中由所述植物細胞產生的植物與不包 含所述核酸的對照植物對鹽度或氧化脅迫的相應耐性水平相比，對鹽度或氧化脅迫的耐性 水平有差異。
18.包含權利要求15-17中任一項的植物細胞的轉基因植物。
19.權利要求18的轉基因植物，其中所述植物是選自以下的物種成員柳枝稷、兩色蜀 黍(高粱，雙色高粱)、巨芒草(芒屬)、甘蔗屬物種(能源蔗)、香脂白楊(白楊)、玉蜀黍 (玉米)、大豆(黃豆)、歐洲油菜(卡諾拉油菜)、普通小麥(小麥)、陸地棉(棉花)、稻 (水稻)、向日葵、紫苜蓿(苜蓿)、甜菜或御谷(珍珠粟)。
20.包含來自根據權利要求15-17中任一項的轉基因植物的種子或營養組織的製品。
21.權利要求20的製品，其中所述製品是食品或飼料製品。
22.包含編碼下述多肽的核苷酸序列的分離的核酸，所述多肽與SEQIDN0:2、4、6、22、 27、29、49、52、54、56、60、62、68、76、83、88、90、96、98、104、106、112、114、132、134、149、151或160中所示的胺基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
23.鑑定多態性是否與性狀變異相關的方法，所述方法包括a)測定植物種群中一種或多種遺傳多態性是否與下述多肽的基因座相關，所述多肽選 自圖1-6中所示多肽及其功能性同源物；和b)測量所述種群的植物中所述性狀的變異與所述種群的植物中所述一種或多種多態 性的存在的相關性，從而鑑定是否所述一種或多種多態性與所述性狀的變異相關。
24.權利要求23的方法，其中所述性狀是提高的對鹽度的耐性，提高的對氧化脅迫的 耐性，或提高的生物量。
25.製備植物品系的方法，所述方法包括a)測定植物種群中一種或多種遺傳多態性是否與下述多肽的基因座相關，所述多肽選 自圖1-6中所示多肽及其功能性同源物；b)在所述種群中鑑定一種或多種植物，其中所述一種或多種多態性中至少一種等位基 因的存在與鹽耐性或氧化脅迫耐性的變異相關；c)將所述一種或多種鑑定的植物的每一種與其自身或不同的植物雜交，產生種子；d)將從所述種子生長的至少一株後代植物與其自身或不同的植物雜交；和e)將步驟c)和d)再重複0-5代來製備所述植物品系，其中所述至少一種等位基因存 在於所述植物品系中。
26.權利要求24或25的方法，其中所述種群是柳枝稷植物的種群。
27.權利要求1、8、10或11中任一項的方法，前提是編碼多肽的所述核苷酸序列不編碼 PCT/US2007/06544的序列表中明確描述的多肽。
28.權利要求1、8、10或11中任一項的方法，前提是編碼多肽的所述核苷酸序列不編 碼 PCT/US2007/06544 的以下多月太序列之一SEQ IDNO 99、SEQ ID NO 100、SEQ ID NO: 102,SEQ ID NO 103,SEQ IDNO 104,SEQ ID NO 180,SEQ ID NO 252,SEQ ID NO 298,SEQ IDNO 300, SEQ ID N0:301、SEQ ID NO 306 和 SEQ ID NO :312。
29.權利要求9或14的方法，前提是所述核苷酸序列不明確描述於PCT/US2007/06544 的序列表中。
30.權利要求9或14的方法，前提是所述核苷酸序列不是PCT/US2007/06544的以下核 苷酸序列之一 :SEQ ID NO :98、SEQ IDNO 101、SEQ ID NO 225 和 SEQ ID NO :299。
31.權利要求15或16的植物細胞，前提是編碼多肽的所述核苷酸序列不編碼PCT/ US2007/06544的序列表中明確描述的多肽。
32.權利要求15或16的植物細胞，前提是編碼多肽的核苷酸序列不編碼PCT/ US2007/06544 的以下多肽序列之一 :SEQ ID NO :99、SEQ IDNO :100、SEQ ID NO :102、SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 104,SEQ IDNO 180,SEQ ID N0:252、SEQ ID NO 298,SEQ ID NO: 300、SEQ IDNO 30U SEQ ID NO 306 禾口 SEQ ID NO :312。
33.權利要求17的植物細胞，前提是所述核苷酸序列不明確描述於PCT/US2007/06544 的序列表中。
34.權利要求17的植物細胞，前提是所述核苷酸序列不是PCT/US2007/06544的以下核 苷酸序列之一 SEQ ID N0:98、SEQ IDNO =IOUSEQ ID NO 225 禾Π SEQ ID NO 299。
35.權利要求22的核酸序列，前提是所述核苷酸序列不明確描述於PCT/US2007/06544 的序列表中。
36.權利要求22的核酸，前提是所述核苷酸序列不是PCT/US2007/06544的以下核苷酸 序列之一 SEQ ID NO :98、SEQ IDNO =IOUSEQ ID NO 225 和 SEQ ID NO :299。
37.權利要求23或25的方法，前提是所述多肽不明確描述於PCT/US2007/06544的序 列表中。
38.權利要求23或25的方法，前提是所述多肽不是PCT/US2007/06544的以下多肽序 列之一 SEQ ID NO 99, SEQ IDNO 100, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104、 SEQ IDNO :180、SEQ ID NO :252、SEQ ID NO :298、SEQ ID NO :300、SEQ IDNO :301、SEQ ID NO 306 和 SEQ ID NO :312。
全文摘要
本發明涉及分離的核酸分子及其編碼的相應多肽，所述核酸分子和多肽能夠在鹽和/或氧化脅迫條件下賦予下述性狀改進的植物尺寸、營養生長、生長速率、幼苗活力和/或生物量。本發明還涉及這些核酸分子和多肽製備與相似條件下生長的野生型植物相比，在鹽和/或氧化脅迫條件下具有改進的植物尺寸、營養生長、生長速率、幼苗活力和/或生物量的轉基因植物、植物細胞、植物材料或植物種子的用途。
文檔編號C12N15/09GK101981191SQ200780101616
公開日2011年2月23日 申請日期2007年9月19日 優先權日2007年9月19日
發明者F·周, J·索薩, K·費爾德曼 申請人:塞瑞斯公司