保存溶液中目標的檢測的製作方法

2023-06-06 22:38:11 7

專利名稱：保存溶液中目標的檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於在醇保存溶液(preservative solution)中檢測目標物質和 用於識別用於與這些目標結合的傳感器(sensor)的方法、物品和組合物。發明背景醫學診斷測試方法是病理狀態早期檢測的關鍵篩選工具。早期檢測能 夠在更可能進行成功治療的階段確定這些病症。通常早期治療也涉及較小 破壞性或較小侵襲性的治療方法，降低對患者的影響。除了常規篩選之外， 診斷測試也有許多其他應用，包括生物活組織檢査分析和監測進行中的醫 學治療的結果。分析樣品如醫學樣品中存在的特定成分的典型方法可以包括多步處理 步驟如固定、染色、透化、原位雜交以及其他酶學和/或化學處理，這取決 於進行的具體測定法。對可從樣品獲得的診斷信息量的限制因素包括可獲得和易於操作的樣 品的數量、進行多重檢測所需的處理時間、樣品在不失去信號的情況下對 多重處理步驟的耐受性以及進行多重分析方法的費用。醫學樣品經常使用本領域已知的多種技術染色。許多染色液含有固定劑如醇，不過很多方法也需要固定步驟。通常希望獲得關於各種存在於或 可能存在於樣品中的物質(species)的其它信息和/或獲得關於較小成分如病 毒或其它細胞成分或其它可能存在於樣品中但通過染色方法不能充分檢測 的物質的信息。 '使用更精確的分子技術如原位雜交可以從樣品中提供比染色技術甚至 更為詳細的信息。但是，原位雜交需要對樣品進行多重繁瑣的操作，包括 固定、轉移至載玻片上、通過溶液梯度逐步操作、加蓋玻片、過長的雜交步驟、洗滌、乾燥和其它處理步驟。這些方法耗費時間，對多重步驟需要 嚴格的注意。本領域需要改進的樣品分析方法以及改進的用於這些方法的組合物和 物品的製備方法。發明內容本發明涉及用於在醇保存溶液中檢測目標物質和用於識別用於與這些 目標結合的傳感器的方法、物品和組合物。該方法使得樣品的充分固定和 可檢測的傳感器與樣品中感興趣的目標的結合同時進行。 一方面，本發明 提供一種方法，其包括使懷疑含有目標的樣品與已知與這種目標結合的可 檢測的傳感器分子在醇保存溶液中接觸。該方法可以以多重的形式(multiplex form)進行以同時分析多種目標。本發明還提供識別在醇保存溶液 中能夠與期望的目標結合的傳感器的方法。本發明還提供含有一種或多種 這種可檢測的傳感器的醇保存溶液。本發明還提供含有由這種方法提供的 結合傳感器的樣品。本發明還提供用於這些方法的試劑盒。附圖簡述

圖1表示用50 x油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對偶濾波器觀察到 的與對金黃色葡萄球菌CS. w^""rRNA特異的異硫氰酸螢光素(FITC)標記 的PNA探針雜交的金黃色葡萄球菌陰性表皮葡萄球菌(51.印/^rm/^)標本 在PreservCyt溶液中雜交90分鐘後的影像。圖2表示用50 x油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對偶濾波器觀察到 的與對金黃色葡萄球菌rRNA特異的FITC標記的PNA探針雜交的金黃色 葡萄球菌陽性標本在PreservCyt溶液中雜交90分鐘後的影像。圖3表示用50 x油浸鏡頭和Omega對偶濾波器觀察到的與對白色念珠 菌(C a/Wca"力rRNA特異的FITC標記的PNA探針雜交的酵母陰性 ThinPrep製備樣品的影像。圖4表示用50 x油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對偶濾波器觀察到 的與對白色念珠菌rRNA特異的FITC標記的PNA探針雜交的酵母陽性 ThinPrep製備樣品的影像。該ThinPrep標本於1999年收集，在PreservCyt中儲存四年後雜交。
具體實施例方式
本發明的發明人有利地發現將傳感器分子引入含醇保存溶液中允許多 重細胞學操作在同一溶液中進行，從而減少處理樣品所需的步驟數目和時 間量並增加在給定時間內對於給定樣品可以進行的測定法的數目。
例如，繁瑣且需要多重步驟和操作的FISH方法如果在醇保存溶液例如 含有傳感器如檢測核酸目標的PNA探針的PreservCyt中進行就可以被簡 化。這有利地消除對費時且不必要的固定步驟的需要，因為PreservCyt中 的甲醇也能充當固定劑。
我們進行了研究，顯示了通過FISH (螢光原位雜交)利用PNA探針對 PreservCyt中的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌進行微生物檢測。我們證明了 使用PNA探針FISH可以在PreservCyt的溶液基質中有效地進行。在常規 方法中，雜交事件在由血液培養物標本製備的載玻片上進行，為達到最佳 效果血液培養物標本需要是新鮮的。由於PreservCyt具有保存性質因而很 好地保持PNA目標(rRNA序列)的穩定性。我們的研究表明，在PreservCyt 中rRNA的完整性至少保持四年且可被PNA FISH檢測到。我們還確定了 在室溫下PreservCyt中的雜交事件至少在23日內保持穩定。這有利地提供 了對以前採集的樣品進行回顧分析的方法。因此，還提供了用於在醇保存 溶液中對長期儲存後的目標的檢測方法。檢測目標的方法可以在l、 2或3 周后，或者l、 2、 3、 4、 6或9個月後，或者l、 2、 3、 4或更多年後進行。
雖然使用PNA FISH檢測白色念珠菌和金黃色葡萄球菌作為模型系統 來舉例說明本發明，但本發明不限於檢測這些微生物的方法。該方法可以 用於檢測其它感染或致病性物質(agent)(包括病毒)以及遺傳分析如點突變 或其它染色體異常的識別(即檢測非整倍性的著絲粒探針)。
該方法還用於在醇保存溶液中進行分子測定，例如擴增反應如PCR， 其包括使用一種或多種PNA探針阻斷不期望的目標的擴增，例如檢測特定 選擇的人乳頭瘤病毒(HPV)的菌株如致病性菌株，而同時避免檢測到其它未 選擇的菌株如非致病性菌株。該方法可以以多重的形式使用。該方法還可 以用於測試候選傳感器與期望的目標的結合能力，這種測試可以以多重的形式進行，例如使用化合物庫如小分子、有機分子和/或無機分子或測試寡
核苷酸的混合物來從混合物中識別具有希望的結合特徵(profile)的適體 (aptamer)。
癌症的病理診斷通常需要單細胞或組織活檢物的顯微鏡檢查以識別指 示惡性的形態異常。輔助的實驗室檢査可以有助於形態學檢查。這些檢查
包括以下檢測染色體異常(如擴增、缺失或易位)、表達異常的酶、蛋白質 或脂質或碳水化合物。儘管為證實異常的細胞成分可以使用不同的分析方 法，但它們的共同點是分析在與最初的形態學檢査中所使用的細胞不同的 組織切片、懸浮液或顯微鏡載玻片上的一組細胞中進行。這可能給診斷過 程帶來挑戰。
本文所述的方法可以用於通過使用中心體特異的傳感器分析樣品中存 在的中心體。目前中心體計數還沒有在實際中用於對惡性腫瘤或其前體的 輔助診斷。在一個實施方案中，本發明提供同時進行細胞形態學評價和中 心體數目計數的方法，這樣通過將兩種因素的信息結合就可以更準確地確
定正常或異常的分類。例如可以用保存的細胞製備ThinPrep載玻片，進行 巴氏染色操作。可以使細胞在染色操作之前或之後與可檢測的對中心體目 標特異的傳感器接觸。通過特定的光波長檢查載玻片以測定形態學特徵和 中心體特異的傳感器的特異性結合。可以使用自動成像系統如ThinPrep 成像系統根據可檢測的傳感器的結合而定量中心體的數目。
在保存溶液中接觸傳感器之後，可以對樣品進行檢測以確定傳感器是 否己經與目標結合。檢測可以在含有於溶液中的樣品的容器中進行，或者 可以在將部分或全部樣品轉移至另一容器中或基材如濾紙、載玻片或蓋玻 片上之後再進行。可以用一種或多種特定的光波長測定樣品的形態學特徵 和目標的特異性結合和傳感器的存在來檢測樣品。
樣品可以通過手動和/或通過合適的裝置如自動成像系統來進行分析。 自動成《象系統的實例包括Cytyc Corporation的ThinPrep Imaging System、 TriPath FocalPoint Profiler、 ChromaVision Acis System、 CompuCyt iCyte Imaging System 、 Applied Imaging CytoVision System禾卩Veracel Verasys Imaging System。諸如上述這些的裝置可以經過改造引入一種或多種檢測系 統以檢測引入含醇保存染色溶液中的傳感器上使用的附加標記。例如可以使裝置適用於檢測和/或分析由加入保存溶液中的傳感器(和/或它們的標記) 所提供的一種或多種特定的波長。當目標是中心體時，可使用自動成像系 統通過檢測與樣品結合的中心體特異的傳感器的量或數目來定量中心體數 目。
在進一步詳細描述本發明之前，應理解本發明不限於所描述的具體方 法、溶液或裝置，因為這些方法、溶液或裝置當然可以改變。還應理解本 文使用的術語僅僅是為了描述具體的實施方案，而無意於限制本發明的範 圍。
若非另外明確指出，使用單數形式"一"、"這"或"那"包括複數 的意思。因此，例如所指的"一個樣品"包括多個樣品，所指的"一個傳 感器"包括多個這種傳感器，所指的"一個目標"包括多個目標等等。此 外，若非另外明確指出，使用明確的複數形式如"兩"、"三"等，以同 主題中較大的數字為準。
若非另外明確指出，術語如"連接的(connected)"、"連接的(attached)" 和"連接的(linked)"在本文中可互換地使用，並且包括直接以及間接的連 接或綴合。當描述數值範圍時，應理解任何介於該範圍的所述上限和下限 之間的整數值及其分數，以及在這些值之間的任何子範圍也均被具體公開。 任何範圍的上限和下限可以獨立地包含在該範圍之內或排除於該範圍之 外，而且任何其中兩個限值之一、兩個限值都不包括或兩個限值都包含的 範圍也包含在本發明的範圍之內。當所討論的值具有內在的限度時，例如 當組分以0-100%的濃度存在時，或當水溶液的pH範圍為1至14時，這些 內在的限度被具體公開。當明確描述一個值時，應理解與所述值大約相同 的量以及基於其的範圍也在本發明的範圍內。當公開一個組合時，該組合 的元素的每個亞組合也被具體地公開且在本發明的範圍內。相反，當公開 不同元素或多組元素時，它們的組合也被公開。當公開一個發明的任何元 素具有多種選擇時，則其中各自的選擇被單獨排除或與其它選擇的任意組 合被排除的該發明的實例也在本文公開； 一個發明中一種以上的元素可以 具有這種排除，具有這種排除的元素的所有組合也在本文公開。
若非另外定義或上下文另外明確指出，本文使用的所有科技術語都具 有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含意。雖然與本文所述相似或等價的方法和材料也可以用於本發明的實踐或測試中，但現在描述的方 法和材料是優選的。
本文使用的術語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"、"核酸分 子"可互換地使用，都指任何長度的多聚形式的核苷酸，而且可以包括核 糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、它們的類似物或它們的混合物。這些術語僅 僅指該分子的一級結構。因此，該術語包括三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核
酸("DNA")以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核酸("RNA")。它還包括例如通 過烷基化和/或通過加帽的修飾和非修飾的多核苷酸形式。
本領域技術人員能夠確定對於給定測定形式的合適雜交條件；可調節 的非限制性參數包括測定成分的濃度、pH、使用的鹽及它們的濃度、離子 強度、溫度等。
更具體地，術語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"、"核酸分 子"包括多脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、包括剪接或未剪接的tRNA、 rRNA、 hRNA和mRNA在內的多核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它類型的 為嘌吟鹼基或嘧啶鹼基的N-或C-糖苷的多核苷酸和包括肽核酸(PNA)在內 的含有其它骨架的其它聚合物以及其它合成的序列特異性核酸聚合物，條 件是該聚合物含有使得如DNA和RNA中存在的那樣的鹼基配對和鹼基堆 積的構象的核鹼基。術語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核 酸分子"之間不存在有意的長度區別，這些術語在本文中可以互換使用。 這些術語僅僅指該分子的一級結構。因此，這些術語包括例如3'-脫氧 -2',5'-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3'P5'磷醯胺、2'-0-烷基-取代RNA、雙鏈 和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA和它們的雜交體包括例如DNA和/或 RNA和/或PNA和/或其它形式之間的雜交體，也包括多核苷酸或寡核苷酸 的已知類型的修飾形式例如標記，烷基化，"帽"，用類似物取代一個或 多個核苷酸，核苷酸間修飾例如具有負電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代 磷酸酯等)的那些、含有側基(pendantmoiety)如蛋白質(包括酶(例如核酸酶)、
毒素、抗體、信號肽、聚左旋賴氨酸等)的那些、含有嵌入劑(如吖啶、補骨 酯素等)的那些、含有螯合物(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等的螯 合物)的那些、含有垸化劑的那些、具有修飾連接(如a異頭核酸等)的那些， 以及非修飾形式。應理解，如本文所用，術語"核苷"和"核苷酸"包括那些不僅含有 已知嘌呤和嘧啶鹼基還含有其它已修飾的雜環鹼基的基團。這些修飾包括 甲基化的嘌呤或嘧啶、醯化的嘌呤或嘧啶或其它雜環。修飾的核苷或核苷 酸還可以包括糖基上的修飾，例如其中一個或多個羥基被滷素、脂族基替 代或官能化為醚、胺等。術語"核苷酸單元"意於包括核酸和核苷酸。
此外，對核苷酸單元的修飾包括重排、添加(appending)、取代或改變 嘌呤或嘧啶鹼基上的與各自互補的嘧啶或嘌呤形成氫鍵的官能基。所得的 修飾核苷酸單元任選可以與其它這樣修飾的核苷酸單元形成鹼基對，但是 不與A、 T、 C、 G或U形成鹼基對。可以引入不妨礙多核苷酸功能的無鹼 基位點；優選多核苷酸不含無鹼基位點。多核苷酸中的一部分殘基或全部 殘基可以以一種或多種方式任選被修飾。
修飾核苷酸單元的實例包括吖丙啶基胞嘧啶、4-乙醯胞嘧啶、5-氟尿嘧 啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、肌 苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧 啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、 5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、(3-D-甘露糖基Q核苷((3-D-mannosylqueosine)、 5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假 尿嘧啶、Q核苷(queosine)、 2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、 4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2，6-二氨基嘌呤和"鎖定" 核酸單元(LNA)及其類似物。Koshkin等，Tetrahedron Letters 1998 39: 4381-4384; PCT Publ. No. W099/14226。
在使得胸苷的N3-H和C4-氧基分別與腺苷的Nl和C6-NH2之間以及 胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2分別與鳥苷的C2-NH2、 N'-H和C6-氧基 之間形成氫鍵的條件下形成標準A-T和G-C鹼基對。因此，例如鳥苷(2-氨基-6-氧基-9-J3-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以修飾成為異鳥苷(2-氧基-6-氨基 -9-l3-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這種修飾導致將不再有效地與胞嘧啶形成標準鹼 基對的核酸鹼基。但是，將胞嘧啶(l-p-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶) 修飾成'為異胞嘧啶(l-p-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶)導致將不能有效 地與鳥苷形成鹼基對但將與異鳥苷形成鹼基對的修飾核苷酸。異胞嘧啶可以從Sigma Chemical Co. (St Louis, MO)獲得；異胞苷可以通過Switzer等， (1993) Biochemistry 32: 10489-10496及其中引用的參考文獻中描述的方法 製備；2'-脫氧-5-甲基-異胞苷可以通過Tor等，(1993)J. Am. Chem. Soc. 115: 4461-4467及其中引用的參考文獻中描述的方法製備；以及異鳥嘌呤核苷酸 可以通過Switzer等，(1993)同上和Mantsch等，(1993) Biochem. 14: 5593-5601中描述的方法或通過Collins等的美國專利5,780,610中描述的方 法來製備。其它非天然鹼基對可以通過Picdrilli等，(1990) Nature 343: 33-37 中描述的關於合成2,6-二氨基嘧啶及其互補體(1-甲基吡唑並-[4,3]嘧啶 -5,7-(4H,6H)-二酮)的方法來合成。其它這樣形成獨特鹼基對的修飾核苷酸 單元是己知的，如Leach等，(1992) J, Am. Chem. Soc. 114: 3675-3683和 Switzer等，同上中所描述的那些。
"互補的"或"基本互補的"是指核苷酸或核酸之間例如傳感器肽核 酸與目標多核苷酸之間雜交或形成鹼基對的能力。互補核苷酸通常是A與 T(或A與U)或C與G。對於兩條單鏈多核苷酸或PNA的鹼基，當以最佳
方式排列和比較而且具有適當的插入或缺失時， 一條鏈的鹼基與另一條鏈 的鹼基至少約80%，通常至少約90%-95%，更優選約98%-100%配對時，
則說這兩條鏈是基本互補的。
或者，當多核苷酸或PNA在選擇性雜交條件下與其互補體雜交時，則 基本互補性存在。通常在至少14-25個鹼基的長度內至少具有約65%、優 選至少約75%、更優選至少約90%的互補時，會發生選擇性雜交。參見 M. Kanehisa Nucleic Acids Res. 12: 203 (1984)。
"優先結合"或"優先雜交"是指與樣品中非互補的聚合物相比一個 多核苷酸或PNA與樣品中它的互補體增加的結合傾向性。
雜交條件通常包括鹽濃度小於約1 M，更通常小於約500mM，優選小 於約200mM。在肽核酸或其它類似核酸與多核苷酸之間雜交的情況下，雜 交可在幾乎不含或不含鹽的溶液中進行。雜交溫度可以低至5t:，但通常高 於22'C，更通常高於約3(TC，優選高於約37'C。較長的片段對於特異性雜 交可能需要較高的雜交溫度。其它因素可能影響雜交的嚴謹性，其包括鹼 基組成和互補鏈的長度、有機溶劑的存在和鹼基錯配的程度，而所用的參 數的組合比任一單獨的參數的絕對值都重要。其它可以控制的雜交條件包括緩衝劑類型和濃度、溶液pH、降低背景結合的封閉試劑如重複序列或封 閉蛋白溶液的存在和濃度、洗滌劑類型和濃度、增加多核苷酸相對濃度的 分子如聚合物、金屬離子及它們的濃度、螯合劑及它們的濃度以及本領域 已知的其它條件。本文使用的術語"適體"(或"核酸抗體")是指通過其形狀識別期望的 目標分子並與之結合的單鏈或雙鏈多核苷酸。參見例如PCT公開WO 92/14843、 WO 91/19813和WO 92/05285。"多肽"和"蛋白質"在本文中可以互換使用，包括通過肽鍵連接的 胺基酸分子鏈。該術語不指產物的具體長度。因此，"肽"、"寡肽"和 "蛋白質"均包括在多肽的定義之內。該術語包括多肽的含有翻譯後修飾 例如糖基化、乙醯化、磷酸化和硫酸化的多肽。此外，蛋白質片段、類似 物(包括非遺傳密碼編碼的胺基酸如高半胱氨酸、鳥氨酸、D-胺基酸和肌酸)、 天然或人工突變體或變異體或它們的組合，融合蛋白、衍生殘基(氨基烷基 化、羧基乙醯化或酯化)等都包括在多肽的含意之內。如本文所用，術語"結合對"是指以高於與樣品中其它成分的親和力 彼此特異性結合的第一個和第二個分子。在結合對成員之間的結合通常是 非共價結合。結合對的實例包括免疫學結合對(如任何半抗原或抗原複合物 與相應的抗體或其結合部分或片段的組合，例如地高辛配基與抗地高辛配 基、螢光素與抗螢光素、二硝基苯酚與抗二硝基苯酚、溴脫氧尿苷與抗溴 脫氧尿苷、小鼠免疫球蛋白與羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫學結合對(如生 物素-抗生物素蛋白、生物素-鏈黴抗生物素、激素(如甲狀腺素和可的松)-激素結合蛋白、受體-受體激動劑或拮抗劑(如乙醯膽鹼受體-乙醯膽鹼或其 類似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-輔酶、酶-酶抑制劑和能夠 形成核酸二倍體的互補多核苷酸對)等。結合對兩成員之一可以或兩者都可 以與其它分子綴合。如本文所用，術語"抗體"包括從多克隆和單克隆製備物獲得的抗體 以及雜交(嵌合)抗體分子(參見例如Winter等，(1991) Nature 349: 293-299 和美國專利4,816,567); F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共價異二聚體，參 見例如Inbar等，(1972) Proc Natl Acad Sci USA 69: 2659-2662和Ehrlich等， (1980) Biochem 19: 4091-4096);單鏈Fv分子(sFv)(參見例如Huston等，(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883); 二聚和三聚抗體片段構建 體；微型抗體(minibody)(參見例如Pack等，(1992) Biochem 31: 1579-1584、 Cumber等、(1992) J Immunology 149B: 120-126);人源化抗體分子(參見例 如Riechmann等，(1988) Nature 332: 323-327、 Verhoeyan等，(1988) Science 239: 1534-1536和1994年9月21日公開的英國專利GB 2,276,169);以及 從這些分子中獲得的任何功能性片段，其中這種片段保留了母抗體分子的 特異性結合性質。
如本文所用，術語"單克隆抗體"是指具有同種抗體群體的抗體組合 物。該術語不限制抗體的種類或來源，也無意被其製備方式所限制。因此， 該術語包括從鼠雜交瘤獲得的抗體以及用人雜交瘤獲得的或從小鼠表達的 人免疫球蛋白鏈基因或其部分製備的鼠雜交瘤獲得的人單克隆抗體。參見 例如Cote等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985， p. 77。
本文的"多重的"是指其中多種分析物可同時被測定的測定法或其它 分析方法。
"任選的"或"任選地"是指其後描述的事件或情況可以發生或不發 生，而且該描述包括該事件或情況發生的情況和該事件或情況不發生的情 況。
樣品
要分析的樣品部分可以是可直接或間接從活生物體獲得的任何來源的 生物材料，包括細胞、組織或液體。樣品的非限制性實例包括血液、尿、 精液、乳汁、痰、粘液、胸腔液(plueral fluid)、盆腔液、滑膜液(sinovial fluid)、 腹水、體腔灌洗液、眼刷物(eye brushing)、皮膚刮下物(skin scmping)、 口 腔拭物、陰道拭物、巴氏塗片物(papsmear)、直腸拭物、吸出物、穿刺活組 織檢查物(needle biospy)、例如通過手術或屍檢獲得的組織切片、血漿、血 清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、淚 液、唾液、腫瘤、器官、微生物培養物、病毒和體外細胞培養物成分的樣品o
樣品可以是已知含有目標的對照樣品。也可以使用陰性對照樣品以用於確定是否一套給定的條件產生假陽性。樣品可以在如下所述的溶液中或基材上提供。可以在樣品與傳感器分 子在保存溶液中接觸之前或之後將樣品轉移至基材上。基材基材可以包含廣範的材料，生物材料、非生物材料、有機材料、無機材料或這些材料的任意組合。例如基材可以是聚合的L-B膜、功能性玻璃、 Si、 Ge、 GaAs、 GaP、 Si02、 SiN4、改性矽或多種凝膠或聚合物如(聚)四氟 乙烯、(聚)亞乙烯基二氟、聚苯乙烯、交聯聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚(丙交酯共乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯共乙 酸乙烯酯)、聚矽氧烷、聚二氧化矽、膠乳、葡聚糖聚合物、環氧樹脂、聚 碳酸酯中的任一種或它們的組合。基材可以是平面結晶基材如二氧化矽基基材(如玻璃、石英等)或例如半 導體和微處理器工業中使用的結晶基材如矽、砷化鎵等。矽補強劑也可以用作基材，它可以通過本領域己知的方法製備。氣凝 膠基材可以用作獨立的基材或作為另一種基材的表面塗層。基材可以是任何形狀，通常是板、載玻片、蓋玻片、珠、小丸、圓盤、 粒子、鏈、沉澱物、薄片、任選多孔的凝膠、大片、管、球、容器、毛細 管、墊、片、膜、晶片、多孔板或盤、光纖等。雖然基材一般是無活性的 (inanimate)形式，但是對於一些應用基材可以是硬質或半硬質的任何形式。基材表面可以由與基材相同的材料組成或者可以由不同材料製成，可 以通過化學或物理手段與基材偶聯。這種偶聯的表面可以由多種材料例如 聚合物、塑料、樹脂、多糖、二氧化矽或二氧化矽基材料、碳、金屬、無 機玻璃、膜或上面列出的基材中的任一種組成。在一種實施方案中，表面 是光學透明的而且具有表面Si-OH官能團，如在二氧化矽表面上存在的那 些。目標目標可以是期望視覺可見的樣品中的任何成分。目標的非限制性實例 包括可以針對其獲得傳感器的多核苷酸、蛋白質、多糖、粘多糖、蛋白聚糖、脂質、細胞、細胞類型(cdl type)、生物體、病毒、結構或分子。該目 標可以是亞細胞結構例如中心體或中心體成分或者是細胞外產物或成分。當目標是細胞或細胞成分或產物時，該細胞可以是任何來源的，包括 原核細胞、真核細胞或古細胞(archea)。該細胞可以是活的或死的。若來自 於多細胞生物體，則該細胞可以是任何細胞類型。該細胞可以是培養的細 胞系或原分離物，該細胞可以是哺乳動物細胞、兩棲動物細胞、爬行動物 細胞、植物細胞、酵母細胞、鄰菌細胞、螺旋體細胞或原生動物細胞。該 細胞可以是人細胞、鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞、雞細胞、鵓細胞或狗 細胞。該細胞可以是正常細胞、突變細胞、遺傳操作細胞、腫瘤細胞等。來自多細胞生物體的細胞類型的實例包括嗜酸細胞、腺泡細胞、松果 體細胞、脂肪細胞、成釉細胞、星形膠質細胞、基(幹)細胞、嗜鹼細胞、肝 細胞、神經元、表面凸出細胞(bulging surface cdl)、 C細胞、心肌細胞、泡 心細胞、主細胞、軟骨細胞、克拉拉細胞、柱狀上皮細胞、黃體細胞、蛻 膜細胞、樹突、內分泌細胞、內皮細胞、腸內分泌細胞、嗜酸細胞、紅細 胞、球外繫膜細胞、胎兒成纖維細胞、胎兒紅細胞、成纖維細胞、卵泡細 胞、神經節細胞、巨大貝茲細胞、杯狀細胞、毛細胞、內毛細胞、I型毛細 胞、肝細胞、內皮細胞、萊迪希氏細胞、脂肪細胞、肝實質細胞、淋巴細 胞、溶菌酶分泌細胞、巨嗜細胞、肥大細胞、巨核細胞、黑色素細胞、系 膜細胞、單核細胞、肌上皮細胞、肌樣細胞、頸粘液細胞、神經細胞、中 性粒細胞、少突膠質細胞、卵母細胞、成骨細胞、破軟骨細胞、破骨細胞、 骨細胞、柱細胞、sulcal細胞、甲狀旁腺細胞、壁細胞、胃蛋白酶分泌細胞、 周細胞、松果體細胞、垂體細胞、漿細胞、血小板、足細胞、精母細胞、 浦肯野細胞、錐體細胞、紅細胞、網織紅細胞、施萬細胞、支持細胞、柱 狀細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、促生長素抑制素細胞、腸內分泌細胞、 精子細胞、精原細胞、精子、星形細胞、支持戴特斯細胞、支持漢森細胞、 表面細胞、表面上皮細胞、表面粘液細胞、汗腺細胞、T淋巴細胞、膜黃 體細胞、胸腺細胞、胸腺上皮細胞、甲狀腺細胞、過渡上皮細胞、I型肺泡 細胞和II型肺泡細胞。腫瘤細胞的實例包括腺瘤、癌、腺癌、纖維腺瘤、成釉細胞瘤、星形 細胞瘤、間皮瘤、膽管細胞癌、膽管纖維瘤、膽管瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、絨毛膜癌、顱咽管瘤、囊腺癌、囊腺瘤、無性細胞瘤、室管膜瘤、 上皮瘤、紅細胞性白血病、纖維腺瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、神經節神經膠 質瘤、神經節瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、粒細胞性白血病、血管 瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、冬眠瘤、組織細胞瘤、角化棘皮瘤、平 滑肌瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、黃體瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、 淋巴瘤、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、骨髓脂肪瘤、腎 母細胞瘤、神經母細胞瘤、肌神經母細胞瘤、牙瘤、少突神經膠質瘤、骨 軟骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳頭狀瘤、副神經節瘤、嗜鉻細胞瘤、松果體瘤、 垂體細胞瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、神經鞘瘤、精原細胞 瘤、畸胎瘤、泡膜細胞瘤和胸腺瘤。細菌的實例包括金黃色葡萄球菌、嗜肺菌團菌(i^gz'o e/to _p"e，o/ Ma)、大腸桿菌(Esc/zm'c/n'a co/z')、結核分枝桿菌(M ft/6em//0^)、 鼠傷寒沙門氏菌(51. 2^/n'mwn'i/m)、霍亂弧菌(KA/7'o c/w/era)、產氣莢膜梭菌 (C7osmWw附/7e吵tozge"力、破傷風梭菌(C7as/r/^w附feto"/)、 肉毒梭菌 (C7fw/rifi /w;w Z)oftz/iwM附)、巴氏梭菌(C7cwfnWMm 6araW) 、 X艮3隹梭菌 (C/os^rWwm力;^d/e)、麻風分枝桿菌(M /e; rae)、幽門螺旋桿菌(/^/z'co6a"" /5[y/on')、 B型流感嗜血桿菌(i/e附o/ /w7ws ^/ e 6)、 白喉桿菌(Co，e6ot"e"'Mrw 卻/z/Zzm,ae)、 微小棒狀桿菌(Co，e6a"m'歸 w/"w^sj/附mw)、百曰咳桿菌(醜0^^&//0 / er^sw's)、月市炎鏈球菌(5^e/ fococc附 /wewmom'ae)、淋病奈瑟氏球菌(iVe&seWa go"on^oeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌 (A^/wen'a wem'wgz'ricfes)、痢疾致賀氏菌(S/n'ge〃a辦sewfen'ae)、銅綠假單胞菌 CP"wfito附o"as aerwg/wora)、脆弱擬桿菌(5flcfera/^fes々"g/fe)、產黑素普雷沃 氏菌CPrevofe/Aa附e/""/"oge"/c")、梭桿菌屬(FwsoZ acfer/w傷)、豬紅珍王丹毒絲 菌C&7w)3e/0^7Wx Wzww'o; af/n'ae)、 單核細胞增生禾!j斯特氏菌(丄/Wer/a wo"oc聲oge"as)、 炭疽芽孢桿菌(5a。7/ws of"Aracz's)、 杜氏嗜血桿菌 (^"emop&'/ws dwcr^y0、 土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra"c&e〃a m/a廠era&)、鼠疫耶 爾森氏菌(7"eM/m'a 、漢氏巴爾通氏體(5"^0恥//" /^rae/"e)、克雷伯氏菌屬(《/&> &//00、腸桿菌屬C&7fera6a"w)、沙雷氏菌屬CS^raria)、變形菌屬 (iVofew)和致賀氏菌屬0S7n'ge//(3)。螺旋體的實例包括蒼白密螺旋體(7V印onewa Pfl///^m)、極細密螺旋體(r 、斑點病密螺旋體(r caratewm)、回歸熱疏螺旋體CBo^re/Zarece"他)、奮森氏疏螺旋體(及v/"ce"riz')、布氏疏螺旋體(及6wrgafo;^r/) 禾口出血黃疸鉤端蟲累方定體(丄e/ tos/ /ra /cfera/zaewon-/7<ag/ae)0真菌的實例包括牛型放線菌(A^"om少ces k W力、煙麴黴(^ / wg/〃us /w附/ga^s)、皮炎芽生菌CB/osto附少cas cfermflririd^)、 白色念珠菌、粗球孢子 菌(CoccWoW&s /附附她)、新型隱球菌(Oy/7tococcMS e"。y^膨"力、莢膜組織 胞眾菌(/^sto/ /os附a ca;ww/afM附)、申克氏抱子絲菌0S/ oro^7'c/zw附sc/ze"cA:zY)、 衣氏放線菌(力cfz'"om;;c" &rae/z7)、牛型放線菌、煙麴黴、皮炎芽生菌、白 色念珠菌、粗球孢子菌、新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌、星狀諾卡氏菌 (A^c"nZ/" as/ero/^fes)、卡氏月市囊蟲(戶"ewwoc"//5 car/w//)、申克氏孢子絲菌 (S/ ora^n'x sc/ e"cA:z7;)、巴斯德畢赤氏酵母(屍/c/n'a ; astor/s)、酉良酒酵母 (<Sacc/zflram_yces cerev&z'ae)禾口粟酒裂殖酵母(5b/z/zosacc/zarowyc&s ; ow6e)。可以編碼的原生動物和寄生蟲的實例包括惡性瘧原蟲(/V^moA"w yb/czJ9orwm)、痢疾內阿米巴(五wto/woeZ a /z/Mo/;^/ca)、錐蟲(^ypa womas)、禾!j 什曼原蟲(丄e^/2wa"/a)、剛地弓形蟲(7bx/ o/asma go"必')、賈第鞭毛蟲 (G7ani/a/a /a附W/a)禾口沙目艮衣原體(CWam:v^^3 frac/zo附o^s)。當目標是多核苷酸時，該目標多核苷酸可以是單鏈、雙鏈或更高級的， 並可以是任何拓撲結構例如線性、環狀、分支。單鏈目標多核苷酸的實例 包括mRNA、 DNA、 tRNA、 hnRNA、 ssRNA或ssDNA病毒基因組，不過這些多核苷酸可以含有內部互補序列和顯著的二級結構。雙鏈目標多核苷 酸的實例包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、 dsRNA或dsDNA病毒基因組、質粒、噬菌體和類病毒。 傳感器傳感器可以是穩定、可溶且能在含醇保存溶液中與它的目標特異性結 合的任何物質。傳感器的非限制性實例包括小的有機化學物質、無機分子、 上述的多核苷酸包括肽核酸和適體。也可以使用不同傳感器的組合，其允 許對樣品中的多種目標進行檢測和分析。傳感器可以是一種被選擇的與細 胞成分如中心體或其子成分特異性結合的傳感器。可以測試多種候選傳感 器分子例如化學物質庫與期望的目標的結合，該測試可以在醇保存溶液中完成。傳感器必須是可以檢測的，可以是自然可檢測的或者可以是通過與標 記偶聯而使之成為可檢測的。可以使用任何有效的檢測方法，包括光學法、 分光鏡法、電法、壓電法、磁法、拉曼散射法、表面等離子體共振法、放 射顯影法、比色法、量熱法等。優選傳感器對人和/或檢測裝置是光學可檢 測的或者可以使其變為光學可檢測的。在一個實施方案中，通過使用發光二極體(LED)進行檢測。在一個實施方案中，傳感器可以是與懷疑存在於樣品中的目標多核苷 酸特異性結合的PNA。 PNA是一種合成核酸類似物，具有肽衍生結構。它 具有由重複N-2-氨乙基甘氨酸單元組成的骨架，這些單元通過醯胺鍵而不 是DNA中存在的糖-磷酸基連接(l)。 PNA通常被稱為"擬DNA" (DNA mimk)，因為它與互補的核酸目標雜交遵守沃森-克裡克鹼基配對法則(2)。 但是由於它們具有肽骨架，PNA帶中性電荷而且具有優於DNA的獨特性 質，包括熱穩定性增加、雜交動力學速率快(為DNA : DNA雜交速率的 50000倍)(3)和對蛋白酶和核酸酶的降解作用具有耐受性。另夕卜，由於其疏 水性(4)PNA可以容易地穿過生物體的細胞壁並找到它的核酸目標。這些特 徵使得PNA成為體外診斷特別是原位雜交的優異工具。在另一個實施方案中，傳感器可以是一種適體。與期望的目標結合的 寡核苷酸的製備在Blackwell, T. K.等，Science (1990) 250: 1104-1110; Blackwell， T. K.等，Science (1990) 250: 1149-1152; Tuerk， C.和Gold, L.， Science (1990) 249: 505-510; Joyce, G. F.， Gene (1989) 82: 83-87; 1993年12 月14日授予Gold等的美國專利5,270,163中描述。這種寡核苷酸被稱為"適 體"。Tuerk禾口 Gold描述了名為"systematic evolution ofligands by exponential enrichment"的方法的應用。在該方法中，通過固定於硝酸纖維素濾膜上的 期望的核酸結合蛋白來對特定部位上完全隨機的一組RNA進行結合選擇。 然後回收結合的RNA並擴增為能進行後續體外轉錄的雙鏈DNA。然後將 新轉錄的RNA通過這一方法循環以富集具有共有序列的寡核苷酸以與關 連蛋白結合。然後可以對這樣獲得的寡核苷酸進行測序以用於進一步研究。 Tuerk和Gold將該方法用於識別通過T4 DNA聚合酶的RNA結合域結合 的RNA寡核苷酸。可以在醇保存溶液如PreservCyt中測試含有適體的傳感器的結合，或 者可以通過使用這種溶液的測定法進行。傳感器適體可以通過已知的任何 方法包括合成、重組和純化方法製備，且可以單獨使用或與其它對同一目 標特異的適體組合使用。適體可以標記到和/或綴合於其它物質上。術語"適 體"特別包括含有衍生自將兩種或多種己知適體與給定目標相比較的共有 序列的"二級適體"。適體的製備在1996年12月10日授予Toole等的美 國專利5，582，981中有廣泛的討論。用作確定適體傳感器的特異性結合序列 的原料的寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。原料寡核苷酸將含有 隨機序列部分，通常包括約10-400個核苷酸，更優選20-100個核苷酸。隨 機序列被引物序列側翼，這允許將聚合酶鏈反應應用到從複合物中獲得的 寡核苷酸。可以將發現與目標結合的適體分離、測序然後再合成為常規 DNA或RNA部分，或者可能是上述的"修飾的"多核苷酸。例如，通常 存在的任一羥基可以被磷酸酯基、磷酸基替代、被標準保護基保護或被活 化以準備與另外核苷酸的另外連接，或者可以與固體載體綴合。通常5'末 端的OH是游離的但可以被磷酸化，3'末端的OH取代基也可以被磷酸化。 羥基還可以衍生為標準保護基。 一個或多個磷酸二酯鍵可以被另外的連接 基替代。這些另外的連接基包括但不限於下述實施方案其中P(O)O被 P(O)S、 P(0)NR2、 P(O)R、 P(O)OR'、 CO或CNR2替代，其中R是H或垸 基(1-20C)，而R'是烷基(1-20C);此外，該基團可以通過O或S與相鄰的核 苷酸相連。連接並不需要都相同。可以確定對於任何期望目標例如中心體 成分的適體。小分子如2002年4月9日授予Kong的美國專利6,368,818 中描述結晶劑也可以用於與細胞器包括中心體、微管和/或細胞骨架結合。細胞分裂過程涉及一系列受控、互相依賴的生化反應，首先產生染色 體拷貝，之後是細胞分裂。稱為有絲分裂的該過程開始時包括亞細胞器的 形成，亞細胞器提供了細胞分裂所必需的結構骨架。 一個重要的細胞器是 中心體，其與相關成分一起起定位點的作用，微管蛋白網絡可以從這個定 位點將母細胞DNA與子細胞的分開。正常的靜止細胞通常具有一個中心 體，但在細胞分裂之前有中心體複製，因此形成兩個定位點。癌細胞或導 致癌症的前體細胞可能具有異常的中心體數目。因此中心體計數可以用來 識別異常細胞。在一種實施方案中，提供通過使樣品與引入醇保存溶液中的中心體特 異的傳感器接觸，之後將從該混合物中取出的樣品進行定量成像而進行中 心體計數的方法。因此，可以使用優先與中心體或中心體外周物質結合的 傳感器以允許通過視覺檢査或通過計算機成像來進行中心體計數。中心體目標分子的實例包括劍蛋白、劍蛋白亞基(參見2002年8月6日授予Vale 等的美國專利6,429,304)、 eg5 (參見2002年10月29日授予Uhlmann等的 美國專利6,472,521)、 Nlkl(參見美國專利6,476,193)、 HSP90 (參見2002年 1月1日授予Gonzalez等的美國專利6,335,157)、 trinectin、中心粒周蛋白 (pericentrin)、 cpl40、中心體蛋白、i微管蛋白、a-微管蛋白、P-微管蛋白(參 見1999年10月26日授予Doxsey的美國專利5,972,626)、 CENP畫F (參見 1997年2月4日授予Yen等的美國專利5,599,919)、 aurora蛋白(參見美國 專利6,207,401 、5,972,676和5，962,312)和BTAK(參見美國專利6,352,858)。 本文使用的術語"中心體"和"中心體的"等是指中心體外周區域以及中 心體區域，因此例如術語"中心體目標"包括中心體外周目標以及中心體 目標。傳感器還可以包括可檢測的中心體酶的底物，該底物在結合時可以 是可檢測的和/或在被中心體酶作用時可以產生可檢測的反應產物。標記本文描述的用於本發明的標記包括與樣品中存在的目標締合的當傳感 器與目標結合時可以直接或間接被檢測的任何物質。標記的實例包括發色 團、發光團、螢光團、色原體、半抗原、抗原、放射性同位素、磁性顆粒、 金屬納米顆粒如金或銀納米顆粒、酶、抗體或其結合部分或同等物、適體 和結合對中的一員。螢光團可以是吸收一種波長的光而發射另一種波長的光的任何物質。 典型的螢光團包括螢光染料、半導體納米晶體、鑭系元素螯合物和綠色熒 光蛋白。螢光染料的實例包括螢光素6-FAM、羅丹明、徳克薩斯紅、四甲基羅 丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、 arboxyrhodol、羧基羅丹明110、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、香豆素、Cy2 、 Cy3 、 Cy3.5 、 Cy5 、 Cy5.5 、 Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP (多甲藻黃素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE (6-羧基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基螢光素)、NED、 ROX (5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、螢光黃、Marina Blue、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor 430、 AlexaFluor 488、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 568、 AlexaFluor 594、 Alexa Fluor 633、 Alexa Fluor 647、 Alexa Fluor 660、 Alexa Fluor 680、 7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY FL、 BODIPY FL-Br2、 BODIPY 530/550、 BODIPY 558/568、 BODIPY 564/570、 BODIPY 576/589、 BODIPY 581/591、 BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665、 BODIPY R6G、 BODIPY TMR、 BODIPY TR、它們的綴合物和組合。鑭系元素 螯合物的實例有銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。本領域己知多種螢光半導體納米晶體(SCNC)，半導體納米晶體的製備 和使用方法在1999年5月27日公開的發明人為Bawendi等的PCT公開 WO 99/26299、 1999年11月23日授予Weiss等的美國專利5,990,479和 Bruchez等，Science 281: 2013， 1998中有描述。可以獲得具有峰發射波長明 確的(well-defmed)極窄發射帶的半導體納米晶體，這允許許多不同的SCNC 在同一測定中作為信號發色團，任選與其它非SCNC型信號發色團組合使 用。術語"綠色螢光蛋白"既指天然水母綠色螢光蛋白也指已經確定的表 現改變的螢光特徵的突變型，改變的螢光特徵包括改變的激發和發射最大 波長以及不同的激發和發射光譜形狀(Delagrave, S.等，(1995) Bio/Technology 13: 151-154; Heim， R.等，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504; Heim,R.等，(1995) Nature 373: 663-664)。 Delgrave等分 離了克隆Aequorea victoria GFP的激發光譜發生紅移的突變型 (Bio/Teclinology 13: 151-154(1995)。 Heim， R.等報導了具有藍色螢光的突變 型(Tyr66至His) (Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) USA 91: 12501-12504)。酶的實例包括在含醇保存溶液中穩定的酶。在這些條件下可以測試它 們穩定性的酶包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖 氧化酶、細菌螢光素酶、昆蟲螢光素酶和海腎(sea pansy)螢光素酶(Renilla koellikeri)，它們在本領域己知的合適的底物的存在下和測定條件下可以產 生可檢測的信號。半抗原和/或結合對成員的實例包括抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素、地 高辛配基、生物素以及上述的那些。保存溶液保存溶液適用於在室溫下保存細胞和組織。該溶液含有醇且優選含有 緩衝劑，並可以用於生物活組織檢査之後和染色或其它分析形式之前在室溫下體外保存哺乳動物細胞。該溶液可以是如1993年10月26日授予Huriey 等的美國專利5,256,571中描述的溶液。在一個實施方案中，該保存溶液提 供用於相對長期的室溫保存的介質。在另一個實施方案中，該保存溶液提 供用於轉運和除去樣品溶液中不期望的成分例如蛋白質的介質。更特別地，該保存溶液含有可與水混溶的醇且優選含有抗聚集劑和緩 衝劑。醇組分以足以固定樣品細胞或組織同時仍使得傳感器與它的目標有可接受的結合的量存在。醇通常是低級烷基(Cw6)醇，可以是Q4醇，可以選自甲醇、乙醇和異丙醇。在優選實施方案中，該醇是甲醇。在本發明的一個實施方案中，醇以足以固定和保存感興趣的樣品成分 的水平存在，可以以高於約40%且低於約60%的量存在，可以為約45%或 以上，可以為約55%或以下。含約60%或以上醇的溶液傾向於表現聚集或 凝結，這幹擾了後續的將樣品細胞有效染色的能力。相反，如果在該實施 方案中醇濃度為40%或以下，那麼細胞就不能充分固定以進行相對長期的 保存，而是隨時間引起細胞降解。在該實施方案中，該溶液含有佔溶液的 約50。/6的甲醇。在本發明的另一個實施方案中，醇以佔溶液的至少20%的量存在。盡 管如上所述，這一濃度的醇不能夠實現長期保存(即多於兩日)，但它在該時 間內充分地固定細胞以進行後續分析。或者，可以將細胞從該20%的實施 方案溶液轉移至較高濃度例如50%的醇溶液中以進行後續的於分析之前的 長期保存。抗聚集劑可以以足以防止細胞在溶液中聚集的量存在。可以使用在醇 保存溶液中有效的任何合適的抗聚集劑，可以是例如螯合劑，該螯合劑選 自例如乙二胺四乙酸(EDTA)及其鹽如二鈉鹽、三鉀鹽和四鈉鹽。認為可用 作抗聚集劑的其它活性劑包括cuminin、肝素、鏈激酶以及存在於溶解或抗凝劑組合物中的活性劑。可以使用能在使用期間將保存溶液維持在所期望的pH的任何緩衝劑。 緩衝劑的實例包括PBS、 Tris、乙酸鈉和枸櫞酸。EDTA及其鹽也可以用作 緩衝劑。優選在保存期間將溶液pH維持在約4至約7之間的緩衝劑。因此， 優選的緩衝劑是乙酸鹽緩衝劑如乙酸鈉、乙酸鎂、乙酸鈣和它們的組合。 雖然在本發明的溶液中也可以使用其它緩衝劑如磷酸鹽或Tris緩衝劑，但 是認為這些緩衝劑對在期望的pH處的有效緩衝範圍不如乙酸鹽廣泛。所使用的緩衝劑特別是長期儲存所使用的緩衝劑優選具有大的緩衝範 圍以調節因懸浮於溶液中的樣品細胞的自溶副產物所導致的任何pH變化。 例如，頸細胞老化時它們釋放改變懸浮溶液的pH平衡的自溶副產物。此外， 保存不同的細胞類型可能需要不同酸度和不同pH範圍的溶液。因此，具有寬的緩衝範圍的溶液可以用於多種細胞類型。在一個實施方案中，該保存溶液含有甲醇、作為酸的EDTA和乙酸鈉。 在該實施方案中，該溶液含有佔約45-55%的甲醇、佔約2-4X的EDTA和 佔約6-8%的乙酸鈉緩沖劑。在另一個實施方案中，該保存溶液含有甲醇、EDTA鈉鹽和鉀鹽的組 合和乙酸鹽緩衝劑。在另一個實施方案中，該溶液含有甲醇、乙酸鎂、乙 酸鈣、氯化鉀和氯化鈉，其中醇佔溶液的約20%，氯化鈉佔約0.1%，氯化 鉀為10mM，乙酸鈣為2mM且乙酸鎂為lmM。該保存溶液適用於在約4X:至約8'C的環境溫度下保存懸浮的細胞至少 約三周。在這期間，細胞保留足以染色的結構而沒有完整性的顯著丟失。 該溶液可以增強細胞的核結構的維持，因為它能維持細胞膜使之足以進行 後續的細胞學染色。該溶液還可以破壞樣品中的微生物病原體和抑制逆轉 錄病毒的活性。該溶液可以除去樣品中不期望的成分如蛋白質。該持續期間可以被該溶液在環境細胞懸浮之前的儲存時間、細胞取樣 與細胞懸浮之間的時間和含醇量所改變。例如，如果該溶液已儲存了相當 長的一段時間，無論是冷藏狀態還是室溫狀態，那麼該溶液剩下的保存細 胞生存力都可能是有限的。除了保存細胞之外，該溶液還可以殺死選擇的病原體。例如，該溶液 有效地殺死測試樣品中的下列微生物白色念珠菌、黑麴黴0^p^g說^w/ger)、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。在溶液中可以使用洗滌劑。該洗滌劑可以是非離子的、陽離子的、陰 離子的或兩性離子的。也可以使用洗滌劑的混合物。洗滌劑種類的實例包 括醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、垸醇醯胺、垸基磺酸鹽、胺氧化物、兩性洗滌 劑、陰離子洗滌劑、甜菜鹼衍生物、陽離子洗滌劑、二磺酸鹽、十二烷基 苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水 溶物、月桂基硫酸鹽、單酸甘油酯和甘油二酯、非離子洗滌劑、磷酸酯、 季銨鹽洗漆劑和脫水山梨糖醇衍生物。試劑盒本發明還提供可含有用於實施本發明方法的試劑的試劑盒。在一個實 施方案中，試劑盒含有醇保存溶液和存在於溶液中時適於與樣品中的中心 體目標結合的可檢測的傳感器。該傳感器可以與標記綴合，標記可以是包 括螢光團在內的發色團。試劑盒的組分可通過包裝物(housing)來保存。使用試劑盒實施本發明 方法的說明書也可以與試劑盒一同提供，它可以以任何固定媒介形式提供。 該說明書可以在包裝物之內或之外，可以印刷於使該說明書清楚易讀的形 成該包裝物的任一表面的內面或外面上。該試劑盒可以是多重的形式，含 有多種可以與樣品中的相應的不同目標結合的一種或多種不同傳感器。實施例闡述以下的實施例是為了向本領域普通技術人員提供如何製備和使用 本發明的完整實施方式，而無意限制本發明的範圍。雖然努力確保所使用 數字的準確性(例如量、溫度等)，但是應考慮存在一些實驗誤差和偏差。若 非另外說明，部分是以重量計部分，溫度是攝氏度，壓力是或者接近於大 氣壓，所有的材料均可商購獲得。實施例1將50 pi體積的PNA混合入含有一定體積的細胞PreservCyt (Cytyc Corp.)的ThinPrep小瓶(Cytyc Corp.)或微離心管中，雜交事件在溶液中使用55'C的水浴進行。或者，雜交事件在室溫下進行過夜。雜交後，將標本以 12000rpm離心5分鐘，使細胞沉澱然後重懸於一定體積的洗滌緩衝液中。 通過將樣品置於55"C水浴中30分鐘來洗滌細胞。洗滌後，將樣品再次以如 上所述的方法離心，再次重懸於一定體積的新洗滌緩衝液中，然後轉移至 載玻片上。將載玻片風乾，蓋上蓋玻片並觀察是否陽性(多個視野中存在一 簇一簇的綠色螢光生物體)。或者，也可以通過在T2處理器上處理標本來 洗滌標本，製備載玻片(T2操作的細胞收集處理期間除去未結合的探針)。 這裡製備的載玻片被T2處理器釋放至含有lx洗滌緩衝液(AdvanDx)的收集 小瓶中，然後在55t的緩衝液中溫育30分鐘。實施例2建立了通過FISH (螢光原位雜交)使用PNA技術檢測PreservCyt溶液 中的微生物的方法。這些研究中使用的PNA探針來自於AdvanDx， Inc。 AdvanDx, Inc.經 Boston Probes, Inc.許可生產檢測金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的PNA試劑 盒。期望用途是檢測從血液培養物製備的塗片中的白色念珠菌和黃色葡萄 球菌(僅供研究使用)。在PreservCyt中的溶液內雜交步驟1. 將50 pi PNA探針加入500 |il PreservCyt標本*中，渦旋混合。置於 55'C水浴中(90 min或過夜)雜交。2. 在T2處理器上處理標本以將細胞轉移至ThinPrep載玻片上。製備 好細胞點後，儀器會把載玻片釋放入含有lx洗滌緩衝液(AdvanDx)的收集 小瓶中。3. 將載玻片(浸沒在lx洗滌緩衝液中)在55'C水浴中溫育30分鐘。4. 取出載玻片，風乾。固定，蓋上蓋玻片，在螢光顯微鏡下觀察。通 過多個視野中存在一簇一簇的綠色螢光生物體來確定陽性。*該方法主要是使用加入了白色念珠菌或金黃色葡萄球菌的細胞 PreservCyt來實施。但是，使用長達四年的白色念珠菌陽性ThinPrep標本(載 玻片基)也已經證實了該測定法的性能。常規方法(AdvanDx試劑盒插入頁中所描述)1. 將一滴固定溶液(AdvanDx)置於顯微鏡載玻片(AdvanDx)上，然後加 一滴血液培養物標本並混合。2. 通過將塗片在55-80"C下加熱20分鐘以固定。3. 將載玻片浸入80%或96%乙醇中5-10分鐘，風乾。4. 將一滴PNA探針加至固定的塗片上，蓋上蓋玻片，在55。C下溫育 卯分鐘雜交。5. 將載玻片置於55'C下預熱的lx洗滌溶液中，移去蓋玻片。在55'C 的洗滌溶液中溫育30分鐘。取出載玻片，風乾。固定，蓋上蓋玻片，在螢光顯微鏡下觀察。通過 多個視野中存在一簇一簇的綠色螢光生物體來確定陽性。結論在PreservCyt中進行溶液內雜交證實了用ThinPrep⑧小瓶進行輔助分 子測試的技術。這表明含有PNA探針的ThinPrep標本可以在FISH後在 ThinPrep 2000處理器上進行處理，而不損害目標進行PNA雜交事件。細胞 和目標生物體都被轉移至載玻片上，形成比常規塗片法更容易解析的單層 細胞。另外，ThinPrep處理器使從樣品中除去未結合的PNA容易，使得制 備的載玻片具有較低的背景噪音。在ThinPrep小瓶中進行雜交和在 ThinPrep處理器上製備載玻片在使輔助分子測試的過程流線化的同時通過 減少步驟而使FISH方法簡化。
權利要求
1.測定方法，其包括提供懷疑含有目標的樣品；提供能夠在不含甲醯胺的醇保存溶液中與所述目標結合的傳感器，所述傳感器與發色團綴合；在如果所述目標存在的話所述傳感器能夠與所述目標結合的條件下，使所述樣品在所述不含甲醯胺的醇保存溶液中與所述傳感器接觸；向所述溶液施加能夠激發所述發色團的光源；和檢測光是否從所述目標發射出。
2. 權利要求l的方法，其中所述樣品選自血液；尿；精液；乳汁；痰； 粘液；胸腔液；盆腔液；滑膜液；腹水；體腔灌洗液；眼刷物；皮膚刮下 物；口腔拭物；陰道拭物；巴氏塗片物；直腸拭物；吸出物；穿刺活組織 檢查物；組織切片；血漿；血清；脊髓液；淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道 或泌尿生殖道的外分泌物；淚液；唾液；腫瘤；器官；微生物培養物；和 體外細胞培養物成分。
3. 權利要求l的方法，其中所述傳感器包括適體。
4. 權利要求1的方法，其中所述傳感器包括多核苷酸。
5. 權利要求l的方法，其中所述傳感器包括肽核酸。
6. 權利要求1的方法，其中所述傳感器包括鎖定核酸。
7. 權利要求1的方法，其中使所述樣品與多個不同的傳感器接觸，所 述多個中每一個均包括相應的不同可檢測標記，其中所述多個中每一個均 能夠選擇性地與相應的不同目標結合。
8. 權利要求1的方法，其中所述發色團是螢光團。
9. 權利要求8的方法，其中所述螢光團選自半導體納米晶體、螢光染 料和鑭系元素螯合物。
10. 權利要求9的方法，其中所述螢光團是半導體納米晶體。
11. 權利要求9的方法，其中所述螢光團是螢光染料。
12. 權利要求ll的方法，其中所述螢光染料是螢光素。
13. 權利要求9的方法，其中所述螢光團是鑭系元素螯合物。
14. 權利要求l的方法，其中所述目標是DNA。
15. 權利要求l的方法，其中所述目標是RNA。
16. 權利要求1的方法，其中所述樣品是細胞部分。
17. 權利要求l的方法，其中所述目標是中心體。
18. 權利要求l的方法，其中所述目標是病理生物體。
19. 權利要求l的方法，其中所述目標是病毒。
20. 權利要求1的方法，其進一步包括將從所述檢測得到的結果與從 對照樣品得到的結果相比較。
21. 權利要求20的方法，其中所述對照樣品是陽性對照。
22. 權利要求20的方法，其中所述對照樣品是陰性對照。
23. 權利要求l的方法，其進一步包括在所述檢測之前洗滌所述樣品。
24. 權利要求l的方法，其中所述方法為自動化的。
25. 權利要求1的方法，其中所述方法手動完成。
26. 權利要求l的方法，其中所述目標是細菌或其成分或產物。
27. 權利要求l的方法，其中所述目標是酵母或其成分或產物。
28. 識別與期望的目標特異性結合的傳感器的方法，其包括使懷疑 含有感興趣目標的樣品與可檢測的傳感器接觸，其中所述接觸在保存溶液 中進行，所述保存溶液含有一定量的一種或多種有效地防止這種溶液被至 少一種汙染物汙染的水溶性醇且不含甲醯胺；和檢測所述傳感器是否已經 與所述目標結合。
29. 權利要求28的方法，其中所述方法對多種候選傳感器進行。
全文摘要
本發明涉及測定方法，其包括提供懷疑含有目標的樣品；提供能夠在不含甲醯胺的醇保存溶液中與所述目標結合的傳感器，所述傳感器與發色團綴合；在如果所述目標存在的話所述傳感器能夠與所述目標結合的條件下，使所述樣品在所述不含甲醯胺的醇保存溶液中與所述傳感器接觸；向所述溶液施加能夠激發所述發色團的光源；和檢測光是否從所述目標發射出。本發明還涉及識別與期望的目標特異性結合的傳感器的方法，其包括使懷疑含有感興趣目標的樣品與可檢測的傳感器接觸，其中所述接觸在保存溶液中進行，所述保存溶液含有一定量的一種或多種有效地防止這種溶液被至少一種汙染物汙染的水溶性醇且不含甲醯胺；和檢測所述傳感器是否已經與所述目標結合。
文檔編號C12Q1/70GK101329275SQ20081013150
公開日2008年12月24日 申請日期2004年7月9日 優先權日2003年7月11日
發明者埃林·科夫曼, 布萊恩·B·蘭特裡奇亞, 詹姆斯·林德, 麥可·科恩福特 申請人:Cytyc公司