一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法

2023-06-06 22:28:01

專利名稱：一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法
技術領域：
本發明涉及一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。
背景技術：
禽類免疫球蛋白IgY具有生物學活性，用途廣泛，可用於血清學免疫診斷(夾心法 ELISA檢測、免疫擴散、免疫吸附和補體結合等)和免疫治療(雞鴨的病毒性疾病、嬰兒和 幼畜的輪狀病毒感染等)。通常IgY是從禽類蛋中獲得，主要是產蛋母雞用特定抗原免疫 後，約7 10天後抗體從血液轉移至卵黃，再從卵黃中分離到IgY，相關此研究的報導較多， 例如專利CN1752105、CN1935841和CN101125886。但是，卵黃中脂肪含量很高(約30% )， 從卵黃中提取IgY需要去除大量的脂類物質，規模化分離較為困難，因此直接從血液中分 離IgY將更為有利。另一方面，我國是禽類(特別是雞)養殖大國，禽類血液除了少部分食 用外，一般作為廢棄物排放，既浪費了寶貴的天然蛋白質資源，又造成了一定的環境汙染問 題。因此，綜合利用禽類血液，特別是提取高附加值的活性蛋白，具有重要的經濟價值和社 會效益。混合模式層析是近年發展起來的新型生物分離技術，其功能配基同時兼有兩種 或兩種以上的功能基團，可以與目標蛋白產生多種相互作用模式，主要是疏水和靜電相互 作用。混合模式吸附劑的配基密度通常比較高，吸附容量大，可以通過靜電相吸來強化吸 附或靜電排斥來協助解吸，特別適合於大規模的分離純化，已經在免疫球蛋白的分離純化 中得到應用，是Protein A親和層析的潛在替代方法。商業化的混合模式吸附劑有MEP HyperCel，由Pall公司生產。一些新型的混合模式吸附劑也有報導，如以巰基甲基咪唑 或巰基苯並咪唑為配基的介質，製備方法見專利CN101279244、CN101279243和文獻(Ind. Eng. Chem. Res47(23) :9566_9572，2008)。本發明有效地結合了辛酸沉澱與混合模式層析兩種分離方法，採用辛酸沉澱去除 部分雜蛋白，用混合模式吸附劑直接處理辛酸沉澱的上清液，充分利用混合模式吸附的高 吸附容量、高抗體選擇性的特性，開發一種從雞血中分離IgY免疫球蛋的經濟高效方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法包括如下步驟1)配製0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將雞血與抗凝劑按照體積比為9 1的 比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉速離心10 20分鐘，得到血漿；2)將血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2 5. 0)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 60μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置1 4小時，用離心機以8000 IOOOOrpm轉速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫 球蛋白IgY粗品溶液；3)調節免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7. 0 8. 5，用0. 45 μ m濾膜過濾後，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩衝液衝洗，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰對 應的洗脫緩衝液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)將免疫球蛋白IgY溶液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度大於90%的免疫球蛋白IgY產品。所述的混合模式吸附劑為以巰基甲基咪唑為配基的層析介質，或者以巰基苯並咪 唑為配基的層析介質，或者商業化介質MEP HyperCel ；平衡緩衝液為Tris-HCl緩衝液，pH 值為7. 0 8. 5 ；洗脫緩衝液為乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH值為3. 6 4. 2。本發明針對雞血資源的綜合開發，通過辛酸沉澱與混合模式層析的有機結合，能 很好地從雞血中分離純化高純度的免疫球蛋白IgY。採用辛酸沉澱去除部分雜蛋白，混合模 式吸附劑直接處理辛酸沉澱後的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗體選 擇性，提高分離效率，簡化分離步驟，得到一個經濟高效的提取免疫球蛋白IgY的方法。本 發明的優點在於1)快速、成本低廉；2)分離步驟少、工藝簡單、易於放大；3)過程處理量 大、分離效率高；4)免疫球蛋白IgY的純度高。


附圖是本發明混合模式層析分離雞血免疫球蛋白IgY的電泳譜圖。
具體實施例方式本發明提供一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。將新鮮抗凝血液離心去 除紅細胞，得到血漿；用辛酸法沉澱去除部分雜蛋白，得到上清液；將上清液通過混合模式 層析柱進行分離，得到免疫球蛋白IgY。本發明方法分離得到的免疫球蛋白IgY純度大於 90%。從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法包括如下步驟1)配製0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將雞血與抗凝劑按照體積比為9 1的 比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉速離心10 20分鐘，得到血漿；2)將血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2 5. 0)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 60μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置1 4小時，用離心機以8000 IOOOOrpm轉速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫 球蛋白IgY粗品溶液；3)調節免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7. 0 8. 5，用0. 45 μ m濾膜過濾後，上 樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩衝液衝洗，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰對 應的洗脫緩衝液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)將免疫球蛋白IgY溶液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度大於90%的免疫球蛋白IgY產品。所述的混合模式吸附劑為以巰基甲基咪唑為配基的層析介質，或者以巰基苯並咪 唑為配基的層析介質，或者商業化介質MEP HyperCel ；平衡緩衝液為Tris-HCl緩衝液，pH 值為7. 0 8. 5 ；洗脫緩衝液為乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH值為3. 6 4. 2。以下通過實施例對本發明作進一步的描述實施例1
取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離 心機以2500rpm轉速離心20分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入5ml 60mM的 乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約10ml，加入600 μ 1辛酸，攪拌均 勻，4°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液9. 6ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為7.0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的層析介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩衝液 (pH7. 0)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH3. 6)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得 到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為95. 2%。實施例2取新鮮雞血，按照9 1 (體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入IOml 60mM的乙 酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約15ml，加入450 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置1小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液14. 2ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為7. 5，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩 衝液(pH7. 5)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH3. 8)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍幹 燥，得到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為96. 2%。實施例3取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2700rpm轉速離心15分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入15ml 6OmM的 乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 8)混合均勻，得到稀釋血漿約20ml，加入800 μ 1辛酸，攪拌均 勻，4°C靜置1小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液19. 4ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為8.0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的層析介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩衝液 (pH8. 0)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得 到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為97. 6%。實施例4取新鮮雞血，按照9 1 (體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩衝液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿約25ml，加入800 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液24. 3ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為8. 5，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩 衝液(pH8. 5)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍幹 燥，得到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為98. 5%。實施例5取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2500rpm轉速離心20分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入5ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約10ml，加入600 μ 1辛酸，攪拌均勻，4°C靜置1小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液9. 2ml。上清液用 0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為7.0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填充5ml 以2-巰基苯並咪唑為配基的層析介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩衝液(pH7. 0)，洗 脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋 白IgY，電泳分析純度為96. 0%。實施例6取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩衝液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿約25ml，加入750 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液24. 2ml。上清液用 0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為8. 5，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填充5ml 以2-巰基苯並咪唑為配基的層析介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩衝液(pH8. 5)，洗 脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH3. 6)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋 白IgY，電泳分析純度為95. 4%。實施例7取新鮮雞血，按照9 1 (體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2500rpm轉速離心20分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入5ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約10ml，加入600 μ 1辛酸，攪拌均勻， 4°C靜置1小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液9. 2ml。上清液 用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為7.0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填充 5ml MEP HyperCel混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩衝液(pH7. 0)，洗脫液 為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 2)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白 IgY，電泳分析純度為93.7%。實施例8取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取5ml血漿，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩衝液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿約25ml，加入750 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液24. Iml0上清液 用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為8. 5，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑Icm)中填充 5ml MEP HyperCel混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的Tris-HCl緩衝液(pH8. 5)，洗脫液 為20mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH3. 6)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白 IgY，電泳分析純度為91.2%。
權利要求
一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特徵在於包括如下步驟1)配製0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將雞血與抗凝劑按照體積比為9∶1的比例混合均勻，用離心機以2500～3000rpm轉速離心10～20分鐘，得到血漿；2)將血漿與pH為4.5～5.0，濃度為60mM的乙酸 乙酸鈉緩衝液按照體積比為1～4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30～60μl/ml稀釋血漿，4～8℃靜置1～4小時，用離心機以8000～10000rpm轉速離心20～30分鐘，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；3)調節免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm濾膜過濾後，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩衝液衝洗，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰對應的洗脫緩衝液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)將免疫球蛋白IgY溶液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度大於90％的免疫球蛋白IgY產品。
2.根據權利要求1所述的一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特徵在於所述 的混合模式吸附劑為以巰基甲基咪唑為配基的層析介質、以巰基苯並咪唑為配基的層析介 質或者商業化介質MEP HyperCel0
3.根據權利要求1所述的一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特徵在於所述 的平衡緩衝液為Tris-HCl緩衝液，pH值為7. 0 8. 5。
4.根據權利要求1所述的一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特徵在於所述 的洗脫緩衝液為乙酸_乙酸鈉緩衝液，pH值為3. 6 4. 2。
全文摘要
本發明公開了一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。具體步驟如下1)血漿預處理，取新鮮雞血，離心，除去紅細胞，得到血漿。2)辛酸沉澱，向血漿中加入辛酸達到一定濃度，沉澱去除雜蛋白，離心分離，取上清液。3)柱層析，用填充有混合模式吸附劑的層析柱分離上清液，收集洗脫峰。4)脫鹽和乾燥，將收集液脫鹽，冷凍乾燥，得到高純度的免疫球蛋白IgY。本發明的特色在於開發了一條新的分離工藝，可以從雞血中分離得到高純度的免疫球蛋白IgY。方法的關鍵在於從辛酸沉澱的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY，具有操作步驟簡單、分離效率高、成本低廉的特點。
文檔編號C07K1/36GK101948535SQ20101029542
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月27日 優先權日2010年9月27日
發明者姚善涇, 林東強, 童紅飛 申請人:浙江大學