藥用植物多糖的純化方法
2023-06-06 22:06:21
專利名稱：藥用植物多糖的純化方法
藥用植物多糖的純化方法技術領域 本發明涉及一種多糖的純化方法，特別是藥用植物多糖 的純化方法。
背景技術：
多糖又稱多聚糖，是由單糖縮合成的多聚物，它是生物 體內除蛋白質和核酸以外的又一類重要的信息分子。研究表明多糖具有多 種生物功能，如增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等，因此 對多糖的研究愈來愈引起國內外生物學家、化學家和藥理學家的興趣，有 關專家預言"21世紀將是多糖的時代"。目前，多糖的研究範圍涉及提取、分離、純化、相對分子質量確定、 結構分析、構效關係等多個方面。多糖的純化是對多糖進行研究和分析的 基礎，文獻報導中多糖的純化大部分只涉及到脂類物質的脫除、蛋白的脫 除、色素的脫除以及其他一些小分子物質的分離，而對核酸的脫除並未涉及到。另外，文獻報導中的雜蛋白的脫除方法為Sevage法、三氟三氯乙垸 法或三氯醋酸法，以Sevage法最多。用以上方法脫除蛋白質往往存在著蛋 白質脫除不徹底的現象。本發明的藥用植物多糖的純化方法是在提取出粗 多糖的基礎上進行的，在以往的純化方法中添加了除核酸這一步驟，同時 改進了雜蛋白的脫除方法，採用冷酚抽提法，使得蛋白質的脫除率大大提 高，純化後的多糖純度進一步提高。
發明內容
本發明的目的是提供一種藥用植物多糖新的純化方法。 本發明的藥用植物多糖的純化方法包括提取粗多糖、去除核酸、去除 脂類、脫除蛋白和柱層析分離，具體方法包括以下步驟1、 提取粗多糖取藥用植物中多糖含量高的組織，如蘆薈葉、人參的塊莖、枸杞的果實……，粉碎後加5 20倍(重量)的水，常溫浸提不 少於72h; 5000rpm離心後取上清液濃縮1~5倍，添加乙醇使乙醇的終濃 度為55%~85%，然後8000rpm離心分離沉澱，烘乾後得粗多糖；2、 去除核酸取粗多糖，用蒸餾水溶解，使其濃度為l~10g/L;添 加CaCl2調整離子強度，使Ca"農度為0.1 2mol/L;然後用乙醇沉澱核酸，乙醇終濃度為10% 40% (v/v)， 4 9。C靜置時間不少於4h，然後以 5000 10000rpm的轉速離心脫除核酸沉澱，回收上清液；3、去除脂類向脫除核酸後的離心上清液中添加乙醇使乙醇的終濃 度為55% 85% (v/v)， 4 9。C靜置，時間不少於12h，以5000~10000rpm 的轉速離心，回收的沉澱為去核酸多糖；將去核酸的多糖分別用乙醇、丙 酮和乙醚洗滌2 3次，以洗掉脂質，並於室溫下揮發去掉乙醚，得脫脂粗 多糖；4、脫除蛋白採用冷酚抽提法脫除蛋白，將脫脂粗多糖用0.1 1 mol/L 的醋酸鈉溶液溶解，使脫脂粗多糖的濃度為5 10mg/L;然後添加2 3倍 (v/V)的冷酚溶液抽提蛋白，震蕩不少於30min;震蕩完畢後用 8000 12000rpm的轉速離心，回收上清液；最好將此回收的上清液按上述 方法連續抽提蛋白3次；然後移入透析袋中用雙蒸水透析不少於72h，透 析溫度為4~9°C;然後向透析液中添加乙醇沉澱多糖，使乙醇終濃度為 55% 85% (v/v)， 4 9。C靜置不少於12h;再以5000 10000rpm的轉速離 心分離多糖沉澱；將多糖沉澱分別用乙醇、丙酮和乙醚洗2 3次後，在室 溫下揮發掉乙醚，即得精多糖；5、柱層析分離採用柱層析梯度分離，收集精多糖的單峰洗脫液； 先用截留分子量為5KD 10KD的膜包濃縮10倍，然後再次醇沉，離心收 集多糖沉澱；多糖沉澱經真空冷凍乾燥即得純多糖；所採用的檢測器為紫 外檢測器；柱子裝料和檢測波長可根據植物多糖實際情況進行選擇。本發明所採用的試劑均為分析純。由於本發明在純化多糖的方法中增加了除核酸，並採用冷酚抽提法脫 除蛋白質，使得雜蛋白的脫除率達90%以上，製得的多糖純度高，為多糖 在相對分子質量確定、結構分析、構效關係等方面的研究奠定了基礎。
具體實施方式
為了充分公開本發明植物多糖的純化方法，以下結 合實施例加以說明，但本發明並不局限於此實施例。
實施例l:人參多糖的純化方法，包括以下步驟
1、取人參莖粉碎後加IO倍的水，常溫浸提72h。以5000rpm的轉速 離心去掉殘渣。取上清液濃縮2倍，添加無水乙醇使其終濃度為65%，然後以8000rpm的轉速離心分離沉澱，沉澱烘乾後得人參粗多糖；2、 取人參粗多糖10g用蒸餾水溶解，濃度為10g/L。添加CaCl2調整 離子強度，使C^+濃度為0.5mol/L。然後用無水乙醇沉澱核酸，乙醇終濃 度為30%， 4 9。C靜置4h，以10000rpm的轉速離心脫除核酸沉澱，回收 上清液；3、 向脫除核酸後的離心上清液中繼續添加無水乙醇使其終濃度為 65%， 4 9'C靜置12h。靜置完畢後以10000rpm的轉速離心分離多糖沉澱。 所得的脫除核酸的多糖用無水乙醇、無水丙酮和乙醚逐次洗3次，以洗掉 脂質，並於室溫下揮發掉乙醚，得脫脂粗多糖；4、 用0.2mol/L的醋酸鈉溶液溶解脫脂粗多糖，使其濃度為10mg/L。 接著添加3倍的冷酚溶液，震蕩30min以抽提蛋白。震蕩完畢後以8000rpm 的轉速離心，回收上清液。將此回收的上清液抽提蛋白2次，然後移入透 析袋中用雙蒸水透析72h，透析溫度為4 9。C。透析好的上清液用無水乙 醇沉澱，乙醇終濃度為65%， 4 9。C靜置12h，再以10000rpm的轉速離心 得多糖沉澱。此多糖沉澱用無水乙醇、無水丙酮和乙醚逐次洗3次，室溫 下揮發掉乙醚即得精多糖。如果透析上清液出現沉澱，則採用0.1mol/L 的NaCl溶液進行透析；5、 為進一步純化，採用DEAE-Toyoparl及ConA-Sepharose層析柱， 紫外檢測器，波長為385nm。回收精多糖主峰洗脫液，先用截留分子量為 8KD的膜包濃縮10倍，然後再次醇沉，終濃度為65%，離心收集沉澱， 經真空冷凍乾燥即得人參純多糖。實施例2:枸杞多糖的純化方法，包括以下步驟1、 取枸杞果實破碎後加6倍的水，常溫浸提72h，以5000rpm的轉 速離心去掉殘渣。取上清液濃縮2倍，添加無水乙醇使其終濃度為75%， 然後以8000rpm離心分離沉澱，沉澱烘乾後得枸杞粗多糖；2、 取枸杞粗多糖10g用蒸餾水溶解，濃度為5g/L。添加CaCb調整 離子強度，使(^2+濃度為lmol/L。用無水乙醇沉澱核酸，乙醇終濃度為 30%， 4 9。C靜置4h後以10000rpm的轉速離心脫除核酸沉澱，回收上清 液；3、向脫除核酸後的離心上清液中繼續添加無水乙醇使其終濃度為75%, 4 9。C靜置12h。靜置完畢以10000rpm的轉速離心多糖沉澱。所得 的脫除核酸的多糖用無水乙醇、無水丙酮和乙醚逐次洗3次，以洗掉脂質， 並於室溫下揮發掉乙醚，得脫脂粗多糖；4、用0.3 mol/L的醋酸鈉溶液溶解脫脂粗多糖，使其濃度為5mg/L。 接著添加3倍的冷酚溶液，震蕩30min以抽提蛋白。震蕩完畢後以8000rpm 的轉速離心，回收上清液。將此回收的上清液抽提蛋白3次，然後移入透 析袋中用雙蒸水透析72h，透析溫度為4 9'C。透析好的透析上清液用無 水乙醇沉澱，使乙醇終濃度為75%， 4 9。C靜置12h，以10000rpm的轉速 離心得多糖沉澱。此多糖沉澱用無水乙醇、無水丙酮和乙醚逐次洗3次， 於室溫下揮發掉乙醚即得精多糖。如果透析上清液出現沉澱，則採用 O.lmol/L的NaCl溶液進行透析；5、為進一步純化，採用sephadexG-200層析柱，紫外檢測器，波長 為360nm。回收精多糖主峰洗脫液，先用截留分子量為3KD的膜包濃縮 10倍，然後再次醇沉，終濃度為75%，收集沉澱，經真空冷凍乾燥即得 枸杞純多糖。實施例3:黃芪多糖的純化方法，包括以下步驟1、 取黃芪根粉碎後加IO倍的水，常溫浸提72h，以5000rpm離心後 去掉殘渣。取上清濃縮3倍，添加無水乙醇使其終濃度為80%，然後以 8000rpm離心分離沉澱，沉澱烘乾後得黃芪粗多糖；2、 取黃芪粗多糖10g用蒸餾水溶解，濃度為8g/L。添加CaCl2調整 離子強度，使Ca^濃度為1.5mol/L。用乙醇沉澱核酸，乙醇終濃度為35%， 4 9。C靜置4h後以10000rpm的轉速離心脫除核酸沉澱，回收上清液；3、 向脫除核酸後的離心上清液中繼續添加乙醇使其終濃度為80%, 4 9"靜置12h，以10000rpm的轉速離心分離多糖沉澱，所得的脫除核酸 的粗多糖用無水乙醇、無水丙酮和乙醚逐次洗3次，以洗掉脂質，並於室 溫下揮發掉乙醚，得脫脂粗多糖；4、用0.5mol/L的醋酸鈉溶液溶解脫脂粗多糖，使其濃度為8mg/L。 接著添加3倍的冷酚溶液，震蕩30min以抽提蛋白。震蕩完畢後以8000rpm的轉速離心，回收上清液。將此回收的上清液抽提蛋白3次，然後移入透析袋中用雙蒸水透析72h，透析溫度為4 9。C。將透析好的透析上清液用 無水乙醇沉澱，使乙醇終濃度為80%， 4 9。C靜置12h，以10000rpm的轉 速離心得多糖沉澱。此多糖沉澱用無水乙醇、無水丙酮和乙醚逐次洗3 次，於室溫下揮發掉乙醚即得精多糖。如果透析上清液出現沉澱，則採用 0.1mol/L的NaCl溶液進行透析；5、為進一步純化，採用Sepharose CL-4B層析柱，紫外檢測器，波 長為230nm。回收精多糖主峰洗脫液，先用截留分子量為8KD的膜包濃 縮10倍，然後再次醇沉，終濃度為80%，收集沉澱，經真空冷凍乾燥即 得黃芪純多糖。
權利要求
1、一種藥用植物多糖的純化方法，包括提取粗多糖、去除核酸、去除脂類、脫除蛋白和柱層析分離，其特徵在於(1)所述的去除核酸的方法，即取藥用植物的粗多糖，用蒸餾水溶解，使其濃度為1～10g/L；添加CaCl2調整離子強度，使Ca2+濃度為0.1～2mol/L；然後用乙醇沉澱核酸，乙醇終濃度為10％～40％，4～9℃靜置時間不少於4h，然後以5000～10000rpm的轉速離心脫除核酸沉澱，回收上清液；(2)所述的脫除蛋白的方法，即採用冷酚抽提法脫除蛋白，將脫脂粗多糖用0.1～1 mol/L的醋酸鈉溶液溶解，使脫脂粗多糖的濃度為5～10mg/L；然後添加2～3倍的冷酚溶液抽提蛋白，震蕩不少於30min；震蕩完畢後用8000～12000rpm的轉速離心，回收上清液；然後移入透析袋中用雙蒸水透析不少於72h，透析溫度為4～9℃；然後向透析液中添加乙醇沉澱多糖，使乙醇終濃度為55％～85％，4～9℃靜置不少於12h；再以5000～10000rpm的轉速離心分離多糖沉澱；將多糖沉澱分別用乙醇、丙酮和乙醚洗2～3次後，在室溫下揮發掉乙醚。
2、 根據權利要求1所述的一種藥用植物多糖的純化方法，其特徵在 於所述脫除蛋白的過程中，連續抽提蛋白2~5次，然後移入透析袋中透析。
3、 根據權利要求1或2的方法純化的藥用植物多糖。
全文摘要
一種藥用植物多糖的純化方法，包括提取粗多糖、去除核酸、去除脂類、脫除蛋白和柱層析分離。本發明在純化多糖的過程中增加了除核酸，並採用冷酚抽提法脫除蛋白質，使得雜蛋白的脫除率達90％以上，製得的多糖純度高，為多糖在相對分子質量確定、結構分析、構效關係等方面的研究奠定了基礎。
文檔編號C08B37/00GK101215336SQ200810070499
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月21日 優先權日2008年1月21日
發明者宋洪波, 王金亮 申請人:福建農林大學