一種細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品的製作方法
2023-06-07 02:20:16 1
專利名稱：一種細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫用材料領域，涉及一種細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品，特別是涉及一種細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品，具體地說是以氯化鈉晶體作為致孔劑得到一種細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料的方法及其製品。
背景技術：
組織工程是應用工程學和生命科學的原理與方法，將在體外培養、擴增的功能相關的活細胞種植於多孔支架，細胞在支架上增殖、分化，構建生物替代物，然後將之移植到組織病損部位，達到修復、維持或改善損傷組織功能的一門科學。其核心內容是構建一個由細胞和生物材料組成的一個三維複合體(組織或器官)。目前隨著組織工程的發展，作為組織工程三要素之一的生物支架材料越來越受到研究人員的重視，已經成為影響組織工程發展的最重要環節。組織工程支架材料為細胞、組織的重建提供了必要的三維空間和力學支持，起到模擬細胞外基質(Extra cellular matrix, ECM)的作用。具有良好的組織相容性；生物可降解性和適合的降解率；適合的孔徑和孔隙率，利於細胞的增殖和黏附，以及營養物質的滲入和細胞代謝產物的排出。組織工程支架材料的發展經歷了從微米級支架，微米級纖維支架到納米級纖維支架的過程。對於支架的構建應該在宏觀、微觀、納觀上同時進行。這是因為由膠原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、層連蛋白和彈性蛋白等組成的體內細胞外基質是三維納米結構(50 500nm)，ECM中存在納米尺度的孔、纖維和隆起。它不只具有連接、支持、保水、抗壓及保護等物理學作用，而且對細胞的基本生命活動發揮全方位的生物學作用。因此組織工程支架材料應該具有能夠模擬細胞外基質的三維納米結構。同時為了保證細胞的培養過程中能夠進入材料內部，組織工程支架材料還應具有適合細胞增殖和黏附的微米級大孔(50 250 μ m)。細菌纖維素(Bacterial Cellulose, BC)作為一種優良的生物材料，具有其獨特的物理、化學和機械性質BC的微纖絲束直徑為3 4nm，而由微纖維束連接成的纖維絲帶寬度為70 SOnm具有天然的三維納米網絡結構；高抗張強度和彈性模量；高親水性，良好的透氣、吸水、透水性能，非凡的持水性和高溼強度。大量研究表明細菌纖維素具有良好的體內、體外生物相容性和良好的生物可降解性，極好的形狀維持性能和形狀可調控性。這使得細菌纖維素本身已經可以作為組成工程材料使用，但由於天然的細菌纖維素沒有微米級大孔，細胞只能在表面黏附、增殖，不能進入材料內部。因此，製備出細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料對其在組織工程中的應用尤為重要。最近Backdahl分別使用澱粉、石蠟作為致孔劑在木醋桿菌在發酵時製備出具有一定孔徑的三維組織工程細菌纖維素血管支架材料，材料孔徑、厚度、連通性均可通過改變致孔劑的尺寸和發酵條件來控制，細菌纖維素良好的塑型性使得其作為組織工程支架時，可以更好的控制孔徑與孔隙率以滿足不同組織構建時的需要。但是存在的問題是，發酵時間較長，工藝較為複雜，並且難以完全去除支架材料中制孔劑。中國專利CN101288778A公布了一種採用冰晶作為致孔劑對發酵後的細菌纖維素進行處理製備出含有大孔的細菌纖維素組織工程支架材料的方法。但此方法在冷凍乾燥時由於冰晶升華產生的大孔容易形成塌陷，造成材料結構的破壞。氯化鈉晶體是一種安全、無毒的制孔劑材料，已廣泛用於製備多孔組織工程支架材料。段志軍等將氯化鈉晶體顆粒加入到溶解度較小的聚乙烯醇的二甲基亞碸/水溶液中，均勻攪拌後迅速冷凍，並利用蒸餾水置換出凝膠中的溶劑和氯化鈉顆粒，並得到具有三維多孔結構的聚乙烯醇支架材料。然而氯化鈉晶體顆粒通常是均勻分散在未成型的原料中後才能製備多孔支架材料，而對於細菌纖維素膜是一種成型產品，若將其溶解或打漿會造成細菌纖維素膜力學性能滿足不了支架材料的要求，氯化鈉晶體顆粒則不能通過在溶解或打漿的細菌纖維素原料均勻分散後來製備多孔支架材料，因此需要尋求一種利用氯化鈉晶體在已成型的細菌纖維素膜製備多孔支架材料的有效方法，並得到孔徑可控的細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料。
發明內容
本發明的目的是提供一種細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品，本發明的方法在不溶解、打漿分散細菌纖維素膜的基礎上，通過將氯化鈉晶體作為致孔劑在成型的細菌纖維素膜上形成多孔結構，其製備過程簡單易行、操作方便、無汙染、成本低；通過簡單控制氯化鈉水溶液的濃度、冷凍溫度、冷凍速率等條件可調控微米級大孔的孔徑和分布，得到一種能夠滿足組織工程應用的細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料。本發明的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，將細菌纖維素膜浸泡在20 100°C的氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌5 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，驟冷或逐步降溫至-20 -196°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 250 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；所述氯化鈉水溶液的質量百分比濃度為該溫度條件下飽和氯化鈉水溶液質量百分比濃度的30 100% ；由於氯化鈉在水中的溶解度與水溶液溫度有關，在某一溫度下可配製的最高濃度為這一溫度時氯化鈉在水中的飽和濃度。氯化鈉結晶時的晶體數量、晶粒粒徑大小與氯化鈉溶液的濃度、溫度有關，從而影響了支架材料中大孔的孔徑及分布，因此可以通過改變氯化鈉溶液的濃度、溫度控制細菌纖維素支架的結構。所述的驟冷是指在Imin內迅速將細菌纖維素膜降溫至_20 _196°C。驟冷時，晶核迅速形成，晶粒來不及長大，因此形成的孔徑較小。-196°C為液氮通常本身的溫度。作為優選的技術方案其中，如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的氯化鈉水溶液的溶劑為二次蒸餾水。如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的逐步降溫方法為梯度降溫法或勻速降溫法，降溫至-20 -196°C。
如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的梯度降溫法是指按均等遞降的溫度梯度等級逐步降溫的方法，逐步降溫時在每個降溫溫度下保持10-20min ；所述的按均等遞降的溫度梯度等級是從浸泡溫度20 100°C到冷卻溫度-20 -196°C之間選擇2-5個均等遞降的降溫溫度。如20°C到-20°C的4個均等遞降的降溫溫度為10°C、 0°C、-IO0C、-20°C。在每個降溫溫度下保存10-20min。如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的勻速降溫法是指按照一定的降溫速率勻速下降溫度的方法；所述的降溫速率為1 20°C /min。如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的冷凍乾燥時間為12 48h。如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的水洗為採用二次蒸餾水水洗，水洗溫度為20 100°C，水洗時間為10 120分鐘，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子。可利用氯離子與某些離子反應生成沉澱的特性檢測有無氯離子。如利用銀離子與氯離子反應生成氯化銀沉澱來判定。如上所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，所述的細菌纖維素膜是由木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產鹼菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種產出的，經過分離提純除去菌體蛋白和粘附在纖維素膜上的殘餘培養基。分離提純辦法如將細菌纖維素膜浸泡在質量百分含量為1 8%的NaOH水溶液中，在60 100°C的溫度下加熱3 6h，再用二次蒸餾水反覆衝洗至中性。本發明還提供了一種依據上述方法製得的細菌纖維素支架材料，細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 250 μ m大孔的細菌纖維素支架材料。其中，所述的細菌纖維素是由木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產鹼菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種產出的纖維素。有益效果與現有技術相比，本發明的優點是(1)不需要溶解、打漿分散細菌纖維素，就可將氯化鈉晶體均勻分散在成型細菌纖維素膜上，並形成多孔支架材料。(2)細菌纖維素支架材料的製備過程不使用任何有毒溶劑，不會帶來環境汙染以及生態危機等問題，符合生物醫學領域的使用要求。(3)以氯化鈉作為主要的致孔劑，避免了冷凍乾燥時由於冰晶升華產生的大孔塌陷現象，保證了支架材料在在宏觀、微觀、納觀上同時進行。(4)製備過程簡單易行、操作方便、無汙染、成本低；通過簡單控制氯化鈉水溶液的濃度、冷凍溫度、冷凍速率等條件調控微米級大孔的孔徑和分布，得到一種能夠滿足組織工程應用的細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例1將細菌纖維素膜浸泡在20°C的40%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，在Imin中內驟冷降溫至-20°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為20°C，水洗時間為30min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 70 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例2將細菌纖維素膜浸泡在50°C的60%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，在Imin中內驟冷降溫至-80°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為30°C，水洗時間為50min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 100 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例3將細菌纖維素膜浸泡在80°C的80%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，在Imin中內驟冷降溫至-120°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為60V，水洗時間為60min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 140 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例4將細菌纖維素膜浸泡在100°C的100%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，在Imin中內驟冷降溫至-196°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為 100°C，水洗時間為120min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 180 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例5將細菌纖維素膜浸泡在20°C的80%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，逐步降溫至_20°C，選擇2個降溫梯度溫度為0°C、-20°C， 在每個降溫溫度下保存lOmin，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為30°C，水洗時間為30min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 90 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例6將細菌纖維素膜浸泡在50°C的80%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，驟冷降溫至-40°C，選擇3個降溫梯度溫度為 20°C、-IO0C, -40°C，在每個降溫溫度下保存15min，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為50°C，水洗時間為50min， 直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著 50 120 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例7
將細菌纖維素膜浸泡在80°C的80%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，驟冷降溫至_80°C，選擇4個降溫梯度溫度為40°C、 0°C、-40°C、-8(rC，在每個降溫溫度下保存18min，待材料溫度平衡後移至下一溫度，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為70°C，水洗時間為80min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 180 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例8將細菌纖維素膜浸泡在100°C的100%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，驟冷降溫至-196°C，選擇5個降溫梯度溫度為 40 0C >-20 0C >-80 0C >-140 0C >-196 0C，在每個降溫溫度下保存20min，待材料溫度平衡後移至下一溫度，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為100°C，水洗時間為120min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子， 即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 220 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例9將細菌纖維素膜浸泡在20°C的40%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，勻速降溫速率為10°c /min，降至所需的冷卻溫度-20°c， 以待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為20°C，水洗時間為30min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 100 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例10將細菌纖維素膜浸泡在50°C的60%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌30min， 再將處理後的細菌纖維素膜取出，勻速降溫速率為10°c /min，降至所需的冷卻溫度-80°c， 待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉， 水洗溫度為50°C，水洗時間為50min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 150 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例11將細菌纖維素膜浸泡在80°C的80%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，勻速降溫速率為10°C /min，降至所需的冷卻溫度-140°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為80°C，水洗時間為90min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 200 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；實施例12將細菌纖維素膜浸泡在100°C的100%的飽和氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，勻速降溫速率為10°C /min，降至所需的冷卻溫度-196°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，隨後經水洗去除氯化鈉，水洗溫度為100°C，水洗時間為120min，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 250 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；
權利要求
1.一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵是將細菌纖維素膜浸泡在20 100°C的氯化鈉水溶液中，靜置或攪拌5 30min，再將處理後的細菌纖維素膜取出，驟冷或逐步降溫至-20 _196°C，待細菌纖維素膜冷凍成固態後冷凍乾燥；隨後經水洗去除氯化鈉，即得到細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 250 μ m大孔的細菌纖維素支架材料；所述氯化鈉水溶液的質量百分比濃度為該溫度條件下飽和氯化鈉水溶液質量百分比濃度的30 100% ；所述的驟冷是指在Imin內迅速將細菌纖維素膜降溫至-20 _196°C。
2.根據權利要求1所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的氯化鈉水溶液的溶劑為二次蒸餾水。
3.根據權利要求1所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的逐步降溫的方法為梯度降溫法或勻速降溫法。
4.根據權利要求3所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的梯度降溫法是指按均等遞降的溫度梯度等級逐步降溫的方法，逐步降溫時在每個降溫溫度下保持10-20min ；所述的按均等遞降的溫度梯度等級是從浸泡溫度20 100°C到冷卻溫度-20 -196°C之間選擇2-5個均等遞降的降溫溫度。
5.根據權利要求3所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的勻速降溫法是指按照一定的降溫速率勻速下降溫度的方法；所述的降溫速率為1 20°C / min0
6.根據權利要求1所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的冷凍乾燥時間為12 48h。
7.根據權利要求1所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的水洗為採用二次蒸餾水水洗，水洗溫度為20 100°C，水洗時間為10 120分鐘，直至水洗後的溶液中不再出現氯離子。
8.根據權利要求1所述的一種細菌纖維素支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的細菌纖維素膜是由木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產鹼菌屬、 氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種發酵產出的，並經過分離提純除去菌體蛋白和粘附在纖維素膜上的殘餘培養基。
9.根據權利要求1 8所述的製備方法所製得的一種細菌纖維素支架材料，其特徵是 細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50 250 μ m大孔的細菌纖維素支架材料。
10.根據權利要求9所述的一種細菌纖維素支架材料，其特徵在於，所述的細菌纖維素是由木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產鹼菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種產出的纖維素。
全文摘要
本發明屬於生物醫用材料領域，涉及一種細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品，特別是涉及一種細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著微米級大孔的細菌纖維素支架材料的製備方法及其製品，具體地說是以氯化鈉晶體作為致孔劑得到一種細菌纖維素納米三維網絡結構中均勻分布著50～250μm大孔的細菌纖維素支架材料的方法及其製品。本發明的方法在不溶解、打漿分散細菌纖維素膜的基礎上，通過將氯化鈉晶體作為致孔劑在成型的細菌纖維素膜上形成多孔結構來製備生物醫用支架材料，其製備過程簡單易行、操作方便、無汙染、成本低。
文檔編號A61L27/20GK102274549SQ20111019176
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月10日 優先權日2011年7月10日
發明者尹娜, 徐秋舒, 李喆, 楊敬軒, 歐陽煬, 洪楓, 王華平, 陳仕豔 申請人:東華大學