一種與植物抗鹽性相關的基因及其在植物育種中的應用的製作方法
2023-06-04 00:57:01 2
專利名稱：一種與植物抗鹽性相關的基因及其在植物育種中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種脫氧核糖核酸及其在植物育種中的應用。
技術背景目前，世界上有100多個國家存在著不同類型的鹽鹼地10億公頃，約佔全球可耕地面積 10%。我國就有216乂107公頃，其中耕地約61X1S公頃，主要分布在新疆、甘肅等西北幹 旱半乾旱地區。隨著工業汙染加劇、灌溉農業的發展和化肥使用不當等原因，次生鹽鹼化土 壤面積有不斷加劇的趨勢，給農業生產造成重大損失。因此綜合治理鹽漬土、提高植物的耐 鹽性、開發利用鹽水資源已成為未來農業發展及環境治理所亟待解決的重要課題。近百年來，人們從基因工程角度對植物抗鹽性進行了大量研究，取得了很大的進展。1987 年Hickock發現蕨類植物Cerat叩teris的配子體中的與抗鹽性有關的兩種單基因核突變stl,和 stl2，這兩個基因位於配子體1023品系的核基因組中，該品系自交產生的同源孢子體也具有 明顯的抗鹽性，在孢子體第一葉期遺傳分析表明，所有突變體結和型相都抗能60mmol/L NaCl，而野生型不能，其中十/stl!和stl,/stl2兩種基因型的植株能在含有10Ommol/L NaCl的 培養基上生長，但對其它逆境的抗性卻不如野生型(郭善利、王秀芝(1998)。"植物抗鹽性 及其遺傳工程"聊城師院學報自然科學版11(002): 53-58。)。熱激蛋白是一種分子陪伴(moleculerchaperon)，可以使因溫度升高而構型發生改變的蛋白 質恢復並維持原有的三維構象，不致喪失功能而使機體得以存活。已有研究表明，除在熱脅 迫表達提高外，熱激蛋白基因還在其它許多逆境如冷、乾旱、重金屬、病原菌等脅迫下高表 達，是植物對逆境脅迫的一種防禦機制，它可作為調控基因表達的轉錄因子，從而調控基因 的表達，提高植物對逆境的耐受能力，如寒冷、乾旱、鹽漬等。唐國強等人發現用水楊酸處 理香蕉幼苗的抗寒性明顯提高，並用mRNA差異顯示法分離出其中兩個差異片段G和A，其 中G片段的序列與大豆的兩個與冷脅迫相關的高表達基因片段的部分序列有92%同源性，A 片段未發現其同源性基因片段(康國章，朱國輝，等。(2004)。"用mRNA差異顯示法分 離冷脅迫香蕉幼苗葉片內水楊酸誘導表達的基因。"植物生理與分子生物學學報30(002): 225-228。)，表明這兩個基因片段可能屬於新的基因，但該文對這兩個基因片段所在的基因 全序列以及功能均未提及。 發明內容本發明的目的在於提供一種與植物抗鹽性相關的基因。 本發明的另一目的在於提供該基因在植物育種中的應用。本發明實現上述目的的技術方案是—種與植物抗鹽性相關的Fl基因，其特徵在於該基因的編碼區序列為SEQ NO. 1。 本發明基因是從經過0.5mmol/L水楊酸和7。C冷脅迫處理的香蕉幼苗葉片中分離出來的， 命名為F1，編碼區序列長1251bp，編碼由416個胺基酸組成的蛋白，該蛋白的胺基酸序列為 SEQ NO. 2。通過在genbank中的比對結果發現，本發明Fl基因與所編碼的胺基酸序列與玉 米的熱激蛋白AAC08009有88%的同源性，與水稻的熱激蛋白AAX95135也有88%的同源性， 與其他基因的同源性都較低，因此可以推斷本發明Fl基因所編碼的蛋白質可能屬於熱激蛋 白。本發明人發現，將本發明F1基因轉入普通植株後，植株的抗鹽性明顯提高，這可能與該 基因的表達產物能調節植物體內活性氧代謝系統的平衡有關。在鹽脅迫下，植物體內活性氧 代謝系統的平衡受到影響，活性氧的含量大大增加，抗氧化系統的活性大大降低。本發明F1 基因在植物中表達後，其表達產物可能是作為調控基因表達的轉錄因子，調控活性氧代謝系 統相關基因的表達，提高細胞的抗氧化系統的活性，從而增強了植物對鹽的耐受性。另一方 面，已有實驗證明鈣離子對鹽脅迫信號調節也起著非常重要的作用，而F1基因的表達可能也 有助於維持細胞體內鈣離子的內穩態。本發明F1基因可用於抗鹽脅迫轉基因植物的育種，具體方法可以是採用基因直接導入法 將F1基因重組整合到植物基因組中，也可以通過構建F1基因的植物表達載體並轉染到植物細 胞中。所述的採用基因直接導入法將所述Fl基因重組整合到植物基因組中的方法由以下步驟 組成(1) 用引物SEQ NO. 21和SEQ NO. 22擴增所述Fl基因獲得序列為SEQ NO. 1的DNA片段；(2) 將序列為SEQNO. 1的DNA片段正向插入到表達載體中構建出含有序列為SEQNO. l的DNA片段的重組載體；(3) 將序列為SEQNO. 1的DNA片段的重組載體轉化到農桿菌中，然後按照農桿菌介 導轉基因法將含有序列為SEQ NO. 1的DNA片段的重組載體以重組的方式整合到植物的基 因組DNA中；(4) 通過所用表達載體攜帶的標記篩選出成功轉入序列為SEQNO. l的DNA片段的重組 載體的植株，然後將所得植株正常培養，最後收穫種子，即可。其中步驟(3)中所述的農桿菌介導轉基因法(floral dip)的具體操作步驟參見《A shnpUfied method for /4gro6a"en'wm-mediated transformation of i4f"6iWo; s!'s ^i"/!.a"a》(Clough SJand Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for爿gro6a"en'ww-mediated transformation ofJraZ>i<3fc /w/"/w//a"a戶/a"/J16: 735-743)
圖1是在3，-RACE中，通過5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3'和3' RACE Outer Primer引物對香蕉cDNA擴增的PCR產物電泳圖，得到一條llOObp的條帶。其中1為 DNA Marker DL2，000， 2為Outer PCR產物。圖2是在3 ，-RACE中，通過5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3'禾n 3' RACE Inner Primer引物，以Outer PCR產物為模板擴增的PCR產物，其中1為DNA Marker DL2,000， 2為用Inner primer和Outer PCR產物作模板擴增的條帶。圖3是通過5， -RACE得到的片段的電泳圖，其中，M: DNA Marker DL2, 000; 1: PCR 產物(57。C退火)；2:陰性對照(57。C退火)；3 : PCR產物(55。C退火)；4:陰性對照(55 'C退火)。圖4是用引物FIFl和FlRl擴增Fl基因獲得的編碼區片段的電泳圖。其中，2為Takara 的2000bp的Marker, 1為目的基因F1 PCR擴增產物。圖5是轉F1基因擬南芥植株的PCR鑑定。其中，1:質粒pMD/Fl對照，2:野生型擬 南芥植株對照，3 9: 7株轉基因擬南芥的PCR結果，M: Takara的2000bp的Marker。圖6是野生型和轉Fl基因擬南芥幼苗含有NaCl和不含NaCl的1/2 MS固體培養基上生 長情況。其中，6-A為在不含NaCl的1/2 MS固體培養基中的生長情況圖，黑線左邊的是轉 Fl基因擬南芥幼苗，黑線右邊的是野生型擬南芥幼苗；6-B為在含有lOOmM NaCl的1/2 MS 固體培養基中的生長情況圖，黑線左邊的是轉F1基因擬南芥幼苗，黑線右邊的是野生型擬南 芥幼苗；6-C為在含有150mM NaCl的1/2 MS固體培養基中的生長情況圖，黑線左邊的是轉 Fl基因擬南芥幼苗，黑線右邊的是野生型擬南芥幼苗。圖7是野生型和轉Fl基因擬南芥幼苗含有NaCl和不含NaCl的1/2 MS固體培養基上生 長情況的柱型比較圖，其中翻表示野生型的根長度，圜表示轉F1基因型的根長度。
具體實施方式
例l本發明Fl基因的分離1、 水楊酸誘導冷脅迫香蕉幼苗差異基因的表達用0.5mmol/L水楊酸(salicylic acid, SA)在常溫下以噴灑和灌根的方式對香蕉(威廉姆 斯8188M^a"c"w/"a)幼苗進行處理，常溫放置1天後，而後對香蕉幼苗進行7'C低溫脅迫 處理3天。2、 RNA的提取以7'C低溫脅迫3天後SA處理的香蕉幼苗最上部剛全展葉片，和不施用SA(施用蒸餾水) 的低溫脅迫香蕉幼苗最上部剛全展開葉片為材料，提取總RNA (核糖核酸)，再進一步分離 mRNA (信使核糖核酸)，RNA分離方法見上海生工生物工程技術服務有限公司UNIQ—10柱 式mRNA抽提純化試劑盒使用說明。3、 cDNA的合成通過反轉錄將上述mRNA轉錄為cDNA (互補脫氧核糖核苷酸)，具體方法見上海生工 生物工程技術服務有限公司MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒使用說明。4、 對上述SA處理和對照的cDNA進行差異顯示分析 用兩對錨定引物SEQN0.3: 5,-AAgCTuA-3， SEQ NO .4: 5 ， - A AgCT)C-3 ，和8對隨機引物SEQN0.5: 5'-AAgCTTgATTgCC扁3， SEQN0.6: 5'-AAgCTTcgACTgT-3， SEQN0.7: 5'-AAgCTTTggTCAg-3' SEGN0.8: 5，-AAgCTTCTCAACg-3， SEQNO.9: 5，-AAgCTTAgTAggc-3， SEQNO.10: 5,-AAgCTTgCACCAT-3' SEQNO.ll: 5'-AAgCTTAAcgAgg-3， SEQN0.12: 5'-AAgCTTTTACCgc-3'共做了 16個引物組合的擴增，以上述SA處理和對照的cDNA為模板進行PCR擴增。 擴增程序為94" 5分鐘；30個循環的94'C 15秒，65°C 30秒，72°C 2分鐘；最後在 72'C延伸10分鐘。擴增產物經PAGE電泳後，再進行銀染顯色。每個組合的銀染圖譜上大約 有15-50條帶，共顯示出的帶有500多條，其中有100多條差異帶。對SA誘導的高水平表 達的或誘導新出現的條帶進行了回收，共回收了18條差異帶。對差異片段進行反向Northern雜交，以鑑定這些差異片段的真假，發現其中7個點的雜 交亮度存在著明顯差異，其中一個片段在水楊酸處理的葉片中髙表達，而在對照葉片中表達 量非常低，差異非常顯著。擴增這個片段所用的引物組合為5，-AAgCTTAAcgAgg-3， ( SEQ NO.U )和 5'-AAgCT"C-3， (SEQN0.4)。把此片段回收後，克隆進pEGMeasyT載體中，然後再轉入大腸桿菌中，通過藍白斑篩選，挑選白色單菌落斑，經菌落PCR擴增驗證後，對能擴增出目的條帶的白色菌落進行搖菌， 取部分菌液進行測序(大連寶生物公司用ABI377測序儀測序)，測序結果表明此片段的鹼基 序列為SEQ N0.13,長度為254bp。 5、基因全長的獲得(1) 3'-RACE:試劑TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒(Code No. D314)，購自TaKaRa。 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)購自TaKaRa。特異性引物SEQ NO. 14: 5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG3' SEQNO.15: 5' TGTCGTTGTGGTAACCTTGTGGCT 3'。 方法.-使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0，以香蕉總RNA為模板合成cDNA;以cDNA 為模板，5' CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3'和3' RACE Outer Primer—對引物進 行Outer PCR擴增。取5 pil進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示；以Outer PCR產物為 模板，5' TGTCGTTGTGGTAACCTTGTGGCT 3'和3' RACE Inner Primer兩條引物，進行Inner PCR擴增。取5 ^進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示；使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A )切膠回收目的片段，並將此片段克隆到 pMD18-T上，經藍白斑篩選，挑選陽性菌落，進行搖菌，測序，得到基因的3'端序列SEQ N0.16。(2) 5，-RACE: 試劑First Choice RLM-RACE試劑盒，購自AmbionTaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)購自TaKaRa 7b/:ai a丄J 7^ ,購自ro^a及aTaKaRa DNA Ligation Kit<Mighty Mix〉(Code No.D6023)，購自Kr/:a及" pMD 18-T simple Vector (Code No. D104),購自r"/:ai c(。 特異性引物SEQNO.17: 5' ATTAGGGTTCGGTCGGCAAGATGT 3' SEQNO.18: 5' AGCCACAAGGTTACCACAACGACA 3'。方法-使用First Choice RLM-RACE試劑盒對香蕉Total RNA進行去磷，去帽並與5' RACE Adaptor連接後反轉錄成cDNA。然後使用ra《ai a " 7^ ，以5' RACE Outer Primer和5'ATTAGGGTTCGGTCGGCAAGATGT-3' —對引物進行Outer PCR擴增，再以Outer PCR產物為模板，5' RACE Inner Primer和5' -AGCCACAAGGTTACCACAACGACA-3'為引物進行Inner PCR擴增。取5pl進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)切膠回收上述片段。使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的連接酶，將上述PCR產物(CTA856-1)與 pMD18-T simple Vector (Code No. D104)連接後，熱轉化至大腸桿菌(CodeNo.D9052)中， 塗布平板，37'C過夜培養，挑選陽性菌落搖菌，提取質粒後，將質粒DNA進行測序，得基 因的5'端序列SEQN0.19。把此序列與上述通過差異顯示得到的片段序列進行同源性比較分析，發現存在著許多相 同的序列，表明得到了完整的5'端序列。(3)全長的獲得把通過差異顯示得到的基因片段、3'-RACE和5'-RACE得到的序 列進行拼接，從而得到了此基因的全長序列SEQ NO.20,全長1783bp，包括221bp的5'-非編碼區、299bp的3'-非編碼區、1251bp的編碼區、終止子和12bp的多聚腺苷酸尾，其編 碼區位於基因全長的第222bp-1472bp之間。6、基因全長的同源性比較本發明基因的CDS為SEQNO.l, 1251bp，編碼了417個胺基酸，其中富含親水性氨基 酸，在GenBank中進行對其編碼域(CDS)序列進行同源性比較，結果顯示，未發現同源性 高的的基因，證明本發明基因為新的香蕉基因。本發明基因所編碼的胺基酸與玉米的熱激蛋 白AAC08009有88%的同源性，與水稻的熱激蛋白AAX95135也有88%的同源性，表明所獲 得的全長基因可能是一種熱激蛋白基因。本發明F1基因編碼的胺基酸與玉米AAC0800熱激蛋白的比較結果如下所示 Identities = 372/419 (88%), Positives = 397/419 (94%), Gaps = 3/419 (0%)F1 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKNASQEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPK+ASQ+DLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV AAG0800 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKSASQDDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60-NPFDIFESFFGGNPFGGGGSSRGRRQRRGED 119LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGG H +PFDIF SFFG + GGGGSSRGRRQRRGEDAAC0800 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGSHVDPFDIFSSFFGPSFGGGGGSSRGRRQRRGED 120F1 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICQKCKGKGSKSGASMKCSGCQGSGMKVTIRQLG 179V+HPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVIC KCKGKGSKSGASM+C GGQGSGMKVTIRQLGAAC0800 WHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICSKGKGKGSKSGASMRCPGCQGSGMKVTIRQLG 180F1 PGM IQQMQHPCNECKGTGETINDKDRCPQCKGEKWPEKKVLEVIVEKGMQNGQKITFPG 239P MIQQMQ PCNEGKGTGE+IN+KDRCP CKGEKV+ EKKVLEV VEKGMQ+ QKITFPG AAC0800 PSMIQQMQQPCNEGKGTGESINEKDRCPGCKGEKVIQEKKVLEVHVEKGMQHNQKITFPG 240F1 EADEAPETVTGDIVFVLQQKDHPKFKRKGDDLFYEHALSLTEALCGFRFVLTHLDNRQLL 299EADEAP+TVTGDIVFVLQQKDH KFKRKG+DLFYEH LSLTEALCGF+FVLTHLDNRQLLAAC0800 EADEAPDTVTGDIVFVLQQKDHSKFKRKGEDLFYEHTLSLTEALCGFQFVLTHLDNRQLL 300F1 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPDSMTPEQCKALEAVLPP 359IKS+PGEWKPDQFKAINDEGMP+YQRPFM+GKLYIHFTV+FPDS+ PEQCKALE VLPPAAC0800I KSDPGE雨PDQFKA INDEGMPIYQRPFMKGKLYIHFTVEFPDSLAPEQCKALETVLPP 360F1 KPASQMTDMELDEGEETTLHDV-NIEEEMRRKQAQ-AQEAYEEDDDMHGGAQRVQCAQQ 416+P+S++TDME+DEGEETT+HDV NIEEEMRRKQA AQEAYEEDD+M GGAQRVQCAQQAAC0800 RPSSKLTDMEIDECEETTMHDVNNIEEEMRRKQAHAAQEAYEEDDEMPGGAQRVQCAQQ 419 本發明所述的Fl基因編碼的胺基酸與水稻AAX95135熱激蛋白的比較結果如下所示:Identities = 371/418 (88%), Positives = 391/418 (93%), Gaps = 4/418 (0%)F1 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKNASQEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPK ASQ+DLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEVMX95135 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKTASQDDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60F1 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGGH-NPFDIFESFFGGNPFGGGGSSRGRRQRRGED 119LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGG H +PFDIF S P GGGSSRGRRQRRGED AAX95135 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGSHVDPFDIFSS--FFGPSFGGGSSRGRRQRRGED 1189F1 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICQKCKGKGSKSGASMKGSGGQGSGMKVTIRQLG 179VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNV+G KGKGKGSKSGASM+G GCQGSGMK+TIRQLG AAX95135 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVLCAKCKGKGSKSGASMRCPGCQGSGMKITIRQLG 178F1 PGM IQQMQHPCNEGKGTGETINDKDRGPQGKGEKVVPEKKVLEVIVEKGMQNGQKITFPG 239P M睡Q PCNECKGTGE+麵DRCP CKGEKV+ EKKVLEV VEKGMQ+ QKITFPG AAX95135 PSMIQQMQQPCNECKGTGESINEKDRCPGCKGEKVIQEKKVLEVHVEKGMQHNQKITFPG 238F1 EADEAPETVTGDIVFVLQQKDHPKFKRKGDDLFYEHALSLTEALCGFRFVLTHLDNRQLL 299EADEAP+TVTGDIVFVLQQKDH KFKRKGDDLFYEH LSLTEALGGF+FVLTHLDNRQLL AAX95135 EADEAPDTVTGDIVFVLQQKDHSKFKRKGDDLFYEHTLSLTEALCGFQFVLTHLDNRQLL 298F1 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPDSMTPEQGKALEAVLPP 359IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFM+GKLYIHFTV+FPDS+ PEQCKALEAVLPP AAX95135 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMKGKLYIHFTVEFPDSLAPEQCKALEAVLPP 358F1 KPASQMTDMELDEGEETTLHDV-NIEEEMRRKQAQAQEAYEEDDDMHGGAQRVQCAQQ 416KPASQ+T+ME+DEGEETT+HDV NIEEEMRRKAQEAY+EDD+M GGAQRVQCAQQ AAX95135 KPASQLTEMEIDECEETTMHDVNNIEEEMRRKAQAAQEAYDEDDEMPGGAQRVQCAQQ 416例2轉Fl基因擬南芥的製備 1、實驗材料擬南芥(Arabidopsis thaliana)， Columbia生態型(Col-O)，在溫室中(22 ± 2°C，長 日照16 h光照，8h黑暗)種植取擬南芥種子滅菌後，均勻地平鋪1/2 MS+kan抗生素固 體培養基(1.0 %的瓊脂)上，在超淨臺上將平板吹乾。4'C冰箱放置春化培養3天後，22°C 光照培養箱中培養7天或8天，挑選生長到一定程度且長出綠色葉片的幼苗轉種到營養土中， 供給適宜水分，在溫室中培養。pMD載體，由Scofield, S. R.教授惠贈，該載體相關的文章發表在《Molecular basis of gene-forgene specificity in bacterial speck disease of tomato》(Scofield， S.R.， Tobias, C.M.， Rathjen，丄P., Chang,丄H.， Lavelle, D.T., Michelmore, R.W. and Staskawicz, B.丄(1996) Molecular basis of gene-forgene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science274:2063-2065.)，在各國菌種保藏中心或生物公司均可購得。LB培養基配方:10g Trypton, 5g Yeast extract, 5g NaCl， 1.5g瓊脂，pH 7.3-7.4。質粒提取試劑盒(UNI&—10柱式質粒小量抽提試劑盒)，DNA回收試劑盒(UNIQ—IO柱 式DNA膠回收試劑盒)以及PCR相關試劑均購於上海生物工程有限公司。未說明的試劑，如配製MS培養基的藥品、瓊脂糖、酚、氯仿、異戊醇、甲醇、乙醇、甲 酸等，均為國產分析純以上等級試劑。引物由上海生物工程有限公司合成。2、轉F1基因擬南芥的製備 (1)目的基因的處理將實施例1所得F1基因用以下引物進行PCR擴增F1F1 (SEQN0.21): 5' CGGGATCCATTAGGGTTCGGTCG 3'，F1R1 (SEQNO. 22): 5' CGGGATCCTCACTGCTGAGCACATTG 3';反應體系為5 nl 3 pl 1 pl 3 |dl 3 pl 1 pl 1 |il 33 ^d;10x Buffer MgC12 d,F1F1 (SEQ NO. 20) F1R1 (SEQ NO. 21) Temple Taq ddH20反應程序為 94 'C變性3 min; 94 。C變性60sec 55 。C復性80sec卜30個循環； 72 。C延伸60sec 一 72 。C延伸10 min。 PCR擴增結果如圖4所示。 (2) pMD載體的處理a.用質粒提取試劑盒並按說明書中的方法從含有pMD質粒的大腸桿菌中提取出pMD質粒;b. 用BamHI酶切所得pMD質粒，使其線性化，方法是取pMD質粒150(al、 10x Bam Buffer 20nl和BamHI 3^1，混合，用無菌水補充到20(^1， 37。C反應過夜。c. 用鹼性磷酸酶處理己線性化的pMD質粒，使其去磷酸化，方法是取已線性化的載體 500 ng、 10X Buffer 3^1和鹼性磷酸酶(CIAP， 2 U/nl)lpl，混合，用無菌水補充到30pl， 點動離心，然後37'C條件下溫育30 min;再加入lpl CIAP， 37"C條件下溫育30 min;最後 加入O. 1M EDTA(pH 8.0)，使其終濃度為5mM， 65。C條件下處理1 h，終止反應。(3) Fl/pMD重組質粒的構建將步驟(1)所得的擴增產物和步驟(2)所得產物用T4 DNA連接酶混合，於16'C反應 過夜。(4) 轉F1基因擬南芥的製備① 將Fl/pMD重組質粒轉化DH5a，提取Fl基因正向插入的Fl/pMD重組質粒。a. 感受態細胞的製備將-2CTC或-8(TC貯存的DH5a原始菌液於LB平板上37。C培養16 h 活化後，從該平板上挑取一個單菌落分別在LB、 LB/Amp和LB/kan三種平板上劃線，37。C培 養16h，後二者用於檢査保存的菌種是否被汙染，如果後二者都沒有DH5(x生長，表明菌種沒 有沒汙染。挑取單菌落接種於IO ml LB液體培養基中，37°C， 250r/min培養過夜；取l ml 菌液轉接到50ml 2xLB液體培養基(30。C預熱)中，37°C、 250r/min培養大約3h到OD達到 0.45左右；冰上放置2h; 4°C， 3000r/min離心5min;棄上清，將沉澱重懸於25 ml預冷的 100mMCaCl2中，冰上放置30-60min; 4°C， 3000 r/min離心5min;棄上清，沉澱重懸於5 ml 冰上預冷的lOOmM CaCl2中；加入1. 6 ml 80%的甘油至終濃度為20%;液氮中速凍，置於-80 'C保存備用。b. 轉化方法將步驟a製備的感受態細胞置於冰上，待其融化後，加入Fl/pMD重組質粒， 輕敲壁以混勻；置於混合物冰上30min;於42'C水浴中熱激45s，迅速置於冰中靜置2min， 然後加入800ul LB液，37'C 100r/min培養lh;塗布於LB/Kan抗生素固體培養基上，吹乾，37 。C培養16h。c. 挑取LB/Kan抗生素固體培養基上的單菌落，用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，然後用 引物35S (SEQN0.23)和F1R1 (SEQN0.22)進行PCR擴增，能被擴增的質粒則為Fl基因正 向插入的Fl/pMD重組質粒。② 轉化農桿菌。a.感受態農桿菌製備將農桿菌GV3101劃線在LB (Gen 25pg/ml)固體培養基，28。C培 養48 h;挑取單菌落接種到50ml LB (Gen 25嗎/ml)液體培養基中，250 rpm懸浮培養約24 h; 4°C， 8000 rpm，離心8 min;棄上清，用4。C預冷的100mM CaCl2重懸農桿菌；4°C， 8000卬m，離心8min;棄上清，加入原始菌液1/50體積的100mM CaCl2重懸菌體，置液氮中10秒 鍾，放入一8(TC冰箱中保存備用；b.轉化將感受態農桿菌置於冰上，加入Fl基因正向插入的Fl/pMD重組質粒，充分混 勻，置冰上30 min;置液氮中l分鐘，迅速轉入37t:水浴中，待其融化；加入lml LB液體 培養基，28°C， 250 rpm培養2 4 h; 6000 rpm離心2 min，將上清吸去500^1，振蕩重懸 菌體，並塗布到LB (Gen25ng/ml， Kan50ng/ml)固體培養基上，吹乾；28°C，培養48 h; 挑取單菌落接種到LB (Gen25ng/ml, Kan 50 pg/ml)液體培養基中，28°C， 250rpm培養48h。③ 將轉化後的農桿菌於22'C、 5500rpm離心20min，去上清，用轉化介質重懸；採用的 擬南芥轉化方法是floral dip方法(Clough SJ and Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for々TO6wfe,/ww-mediated transformation of XraZ^o/w^ // "/z'a肌/V朋f J16: 735-743); 取出轉化過的擬南芥植株，避光保溼過夜。④ 第二天將擬南芥放置在光下，正常培養，待其所有的角果完全枯黃、開裂時，即可收 種子。⑤ 取所收種子，重懸於10倍體積含0. 01% Triton X-100的5XNaC10溶液中，放置5min， 期間童懸數次；除去NaC10溶液，用0. 1%的瓊脂重懸種子，移至含50(ag/ml Kan的1/2 MS 固體培養基上，均勻地平鋪，吹乾；4t:冰箱放置2d，移至溫室中，保證有充足的光照；約7 d左右即可分辨出已轉入Fl/pMD重組質粒的擬南芥幼苗和野生型擬南芥幼苗已轉入Fl/pMD 重組質粒的植株具有Kan抗性，所以子葉為綠色，下胚軸較長，並具有較長的主根；而野生 型沒有Kan抗性，所以子葉為黃色，根較短；將綠色的擬南芥幼苗移至己用營養液澆透的營 養土中，用薄膜保溼過夜。第二天移至光下，同野生型一樣正常生長。(5)轉基因擬南芥的鑑定 ①提取轉基因植株T1代葉片的DNA，用引物F1F1 (SEQ N0. 21)和F1R1 (SEQ NO. 22) 進行PCR擴增，PCR反應體系為DNA模板 10-100 ng10XPCR Buffer 2. 0 P 12 mM dNTP 2. 0 wl25 mM MgCl2 1.5" 10 raM F1F1 0. 2u 110 mM F1R1 0.2ul Taq Polymerase (5脅l) 0. 2|4 ddH20 補充到20 W。PCR擴增程序為-94。C 3 min; 94。C 1 min，55。C 1 min，卜35 cycles; 72°C 1 min， > 72。C 10 min; 4。C foreverc②取擴增產物5 iU在1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測，檢測結果如圖5所示。3、鹽脅迫條件對野生型和轉Fl基因擬南芥幼苗的影響(1) 實驗方法① 各取野生型和突變體種子50粒左右，裝入1.5 ml離心管中。② 經過表面滅菌後，通過0.1%的瓊脂將種子分散地鋪在1/2 MS固體培養基上，吹乾。③ 4'C放置2天後移入溫室，豎直生長4天。④ 再將根長有1 1. 5 cm的野生型和突變體幼苗移至含有NaCl的1/2 MS固體培養基上。 (D倒置豎直生長5天，觀察表型。(2) 實驗結果如圖6-A、 6-B、 6-C和圖7所示，轉Fl基因擬南芥在不含NaCl的1/2 MS 固體培養基中正常生長、和野生型沒有明顯差異；但在含100mM和150mM NaCl的1/2 MS固 體培養基中，野生型擬南芥的幼苗的根較短，植株瘦小，明顯發育不良，而本發明轉F1基因 擬南芥含lOOmM NaCl的1/2 MS固體培養基中仍能正常生長，生長情況和在不含NaCl的1/2 MS固體培養基中差異不大，在150mM NaCl的1/2 MS固體培養基中生長受到較明顯抑制，但 總體生長情況也野生型的植株好。可見，本發明Fl基因轉入植物體內後能在鹽脅迫環境下表 達，並幫助植物提高對鹽脅迫環境的抵抗能力。序列表廣州大學 —種與植物抗鹽性相關的基因及其在植物育種中的應用<130〉康國章，朱國輝，等。(2004)。 〃用mRNA差異顯示法分離冷脅迫香蕉幼苗葉片內水 楊酸誘導表達的基因。 〃植物生理與分子生物學學報30(002): 225-228。〈160〉 23<170〉 Patentln version 3.3 Musa acumina〈220〉 CDS〈222> (1)..(1251) 1atg ttc ggg agg gcg ccg aag aag agc gac aac acc aag tac tac gag 48 Met Phe Gly Arg Ala Pro Lys Lys Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Tyr Glu 15 10 15ate etc ggg gta ccg aag aac gcg teg cag gag gac etc aag aag gec 96 lie Leu Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Gin Glu Asp Leu Lys Lys Ala 20 25 30tac cgt Tyr Arg鄉 Lys 35gcc Alagcc Alaate lieaag LysAsn 40C3CHisccc Progat Asp犯g Lysggt Gly 45ggc Glygeit Aspcca Pro144gag aag Glu Lys 50ttc Phe鄉 Lysgag Gluttg Leugcc Ala 55Ginget Alatat Tyrgag Glugtt Val 60ctg Leuage Sergat Aspcct Pro192g3g aaa Glu Lys 65cgtGluatt lietat Tyr 70gat Aspcag Gintat Tyrggt GlyGlu 75gat Aspgcc Alaetc Leu卿 Lysg3gGlu 80240gg￡i atg Gly Metggt Glyggt GlyGly 85ggt Glyggc GlyC3CHisaac Asncca Pro 90ttc Phegat Aspate liettc Pheg3gGlu 95teg Ser288ttc ttc Phe Pheggt Glygga Gly 10033t Asnccc Prottc Phegga Glygga Gly 105ggc Glygga Glyage Ser3gtSercgc 110gga GlyCg3Arg336agg cag Arg Ginagg Arg 115agg Arggga Glygag Glugat Aspgtg Val 120ate liecat Hiscct Proctg Leu幼g lys 125gtg Valtct Serttg Leu384gag gac Glu Asp 130etc Leutac TyrAsnggg Gly3CCThr 135teg Ser鄉 LysLyseta Leutec Ser 140ctt Leuteg Seregg Argaat Asn432gtc ate Val lie 145tgc CysC33Gin卿Lystgc Cys 150aag Lysggg Gly卿 Lysggt Glyteg Ser 155肪g Lystct Serggt Glyget Alatea Ser 160480formula see original document page 17gtg ttg acc cat ttg gat aac aga cag eta ctg att aag tec aac ccc 912 Val Leu Thr His Leu Asp Asn Arg Gin Leu Leu lie Lys Ser Asn Pro 290 295 300ggt gaa gtt gtg aag ccc gat caa ttc aag gca ate aat gac gag ggc 960 Gly Glu Val Val Lys Pro Asp Gin P'he Lys Ala lie Asn Asp Glu Gly 305 310 315 320atg ccg atg tac cag agg ccc ttc atg agg ggg aag etc tac ate cac 1008 Met Pro Met Tyr Gin Arg Pro Phe Met Arg Gly Lys Leu Tyr lie His 325 330 335ttc acc gtg gac ttc cca gat tea atg aca cca gaa cag tgc aaa gcg 1056 Phe Thr Val Asp Phe Pro Asp Ser Met Thr Pro Glu Gin Cys Lys Ala 340 345 350etc gag get gtt ctt ccc cca aag cct gca teg cag atg acc gac atg 1104 Leu Glu Ala Val Leu Pro Pro Lys Pro Ala Ser Gin Met Thr Asp Met 355 360 365gag ctg gat gag tgc gag gag acg aca ttg cat gat gtt aac ate gag 1152 Glu Uu Asp Glu Cys Glu Glu Thr Thr Uu His Asp Val Asn lie Glu 370 375 380gaa gag atg cgc agg aag cag get cag gca cag gag get tac gag gag 1200 Glu Glu Met Arg Arg Lys Gin Ala Gin Ala Gin Glu Ala Tyr Glu Glu 385 390 395 400gat gac gat atg cat ggt ggt gcc cag aga gtg caa tgt get cag cag 1248 Asp Asp Asp Met His Gly Gly Ala Gin Arg Val Gin Cys Ala Gin Gin 405 410 415tga 1251〈210〉 2 416〈212> PRT 2Met Phe Gly Arg Ala Pro Lys Lys Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Tyr Glu 15 10 15lie Leu Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Gin Glu Asp Leu Lys Lys Ala 20 25 30Tyr Arg Lys Ala Ala lie Lys Asn His Pro Asp l>ys Gly Gly Asp Pro 35 40 45Glu Lys Phe Lys Glu Uu Ala Gin Ala Tyr Glu Val Uu Ser Asp Pro 50 55 60Glu Lys Arg Glu lie Tyr Asp Gin Tyr Gly Glu Asp Ala Leu Lys Glu 65 70 75 80Gly Met Gly Gly Gly Gly Gly His Asn Pro Phe Asp lie Phe Glu Ser 85 90 95Phe Phe Gly Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Gly Arg 100 105 11019Arg Gin Arg Arg Gly Glu Asp Val 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Lys Leu Tyr lie His 325 330 335Phe Thr Val Asp Phe Pro Asp Ser Met Thr Pro Glu Gin Cys Lys Ala 340 345 350Leu Glu Ala Val Leu Pro Pro Lys Pro Ala Ser Gin Met Thr Asp Met 355 360 365Glu Leu Asp Glu Cys Glu Glu Thr Thr Leu His Asp Val Asn lie Glu 370 375 380Glu Glu Met Arg Arg Lys Gin Ala Gin Ala Gin Glu Ala Tyr Glu Glu 385 390 395 400Asp Asp Asp Met His Gly Gly Ala Gin Arg Val Gin Cys Ala Gin Gin 405 410 415〈210〉 3 〈211> 16 DNA 人工序列〈400〉 3aagctttttt ttttta 16 4〈211〉 16 DNA <213〉人工序列〈400〉 4aagctttttt tttttc 16 5 DNA 人工序列〈400〉 5aagcttgatt gcc 13〈210〉 6 13〈212> DNA 6aagcttcgac tgt 13〈210〉 7 13 DNA 〈213〉人工序列 7aagctttggt cag 13〈210> 8<211〉 13 腿 人工序列 8aagcttctca acg 13<210〉 9〈211〉 13 腿 〈213〉人工序列〈 9aagcttagta ggc 13 10〈211〉 13〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈400> 10aagcttgcac cat 13〈210〉 11〈211〉 13〈212> 腿 〈213〉人工序列〈400〉 11aagcttaacg 3gg 13〈210〉 12 13〈212> DNA 〈213〉人工序列<400〉 12aagcttttac cgc 13〈210〉 13〈211〉 254 腿 Musa acumina 13aagcttaacg aggaggatga cgatatgcat ggtggtgccc agagagtgca atgtgctcag 60 cagtgagcaa aaatcttttt ggaatcagct gagttcgtga tgagctccgt actctttcag 120ttgtctgcgt actgattact gtgtcgatca ttgtcgttgt ggtaaccttg tggccgaaca 180 ctatacctag ttcatgttgt cttgttcacg tttaaaccga tctcctcgat cttttctgga 2403333333333 gCtt〈210〉 14 24〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈400〉 14cgaggaggat gacgatatgc atgg〈210〉 15〈211〉 24<212〉 DNA 人工序列〈400> 15tgtcgttgtg gtaaccttgt ggct〈210> 16 370〈212> 騰 Musaacumina 16254242425cgaggaggat gacgatatgc atggtggtgc ccagagagtg caatgtgctc agcagtgaac GOaaaaatcttt ttggaatcag ctgagttcgt gatgagctcc gtactctttc agttgtxtgc 120gtactgatta ctgtgtcgat cattgtcgtt gtggtaacct tgtggctgaa cactat&cct 180agttcatgtt gtcttgttca cgtttaaacc gatctcctcg atcttttctg gaaacattct 240cttattccat gagcatatgt gaggtgcaat cgaggcagaa gaacattact accatcgtta 300tttgtttgac tgatatttta gaatttaaat ggacaagtta tgtgatgcct gtttgagcaa 360370〈210〉 17 〈211〉 24〈212> 廳 〈213〉人工序列 17attagggttc ggtcggcaag atgt 24〈210> 18 24 艦 〈213〉人工序列 18agccscaagg ttaccacaacg3C324<210〉 19〈211〉 1493 DNA< 213 〉 Musa acumina〈400〉 19atccatcgac aagggttctc ggagtcgagg 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tagggttcgg tcg 23 26〈212> DNA 〈213>人工序列〈400> 22cgggatcctc actgctgagc acattg 26 23<211〉 20〈212〉 DNA <213〉人工序列〈400〉 23gaaacctcct cggattccat 20
權利要求
1、一種與植物抗鹽性相關的F1基因，該基因的編碼區序列為SEQ NO.1。
2、 權利要求1所述Fl基因在抗鹽脅迫轉基因植物育種中的應用。
3、 一種抗鹽脅迫轉基因植物育種的方法，該方法由以下步驟組成(1) 用引物SEQ NO. 21和SEQ NO. 22擴增權利要求1所述Fl基因獲得序列為SEQ NO. 1 的DNA片段；(2) 將序列為SEQNO. 1的DNA片段正向插入到表達載體中構建出含有序列為SEQNO. 1的DNA片段的重組載體；(3) 將序列為SEQNO. 1的DNA片段的重組載體轉化到農桿菌中，然後按照農桿菌介 導轉基因法將含有序列為SEQ NO. 1的DNA片段的重組載體以重組的方式整合到植物的基 因組DNA中;(4) 通過所用表達載體攜帶的標記篩選出成功轉入序列為SEQ NO. 1的DNA片段的重 組載體的植株，然後將所得植株正常培養，最後收穫種子，即可。
全文摘要
本發明提供了一種與植物抗鹽性相關的F1基因，該基因是從經過0.5mmol/L水楊酸和7℃冷脅迫處理的香蕉幼苗葉片中分離出來的，編碼區序列為SEQ NO.1，編碼由416個胺基酸組成的蛋白。本發明還提供了一種利用本發明F1基因培育抗鹽轉基因植物的方法，該方法是通過農桿菌介導將本發明F1基因以重組的方式整合到植物基因組DNA中。
文檔編號C12N15/82GK101255428SQ20081002560
公開日2008年9月3日 申請日期2008年1月3日 優先權日2008年1月3日
發明者康國章, 楊禮香, 王正詢 申請人:廣州大學