微生物發酵生產纖溶酶的方法

2023-06-04 17:58:31 1

專利名稱：微生物發酵生產纖溶酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種微生物發酵生產纖溶酶的方法。該發明生產的纖溶酶能直接降解纖維蛋白，主要用於醫療、保健、以及其他纖溶酶應用行業，可以開發為治療心腦血管相關疾病的功能性食品和新型藥物，提高心腦血管栓塞等疾病的治療進程、效果及安全性。·
背景技術：
纖溶酶(plasmin，EC 3. 4. 21. 7)是指能專一降解纖維蛋白凝膠的蛋白水解酶，是纖溶系統中的一個重要組份。纖溶酶主要通過降解纖維蛋白和纖維蛋白原，水解多種凝血因子(II. V. VII. VIII. X. XI)，使纖溶酶原轉變為纖溶酶，水解補體等途徑降解纖維蛋白(餘望生等，臨床內科雜誌，1994)。纖溶酶作為生物酶製劑已經廣泛應用於醫療和保健等行業中，但目前使用的纖溶酶主要是從動植物中分離提取，雖然國內外微生物發酵生產纖溶酶的研究很多，但是有關微生物發酵纖溶酶研究處於起步階段，主要是菌種選育、產酶條件優化、酶學性質以及相關基因的克隆與表達等基礎性工作(王敏等，藥學學報，1998 ;龔勇等，微生物學報，2001 ;劉晨光，青島海洋大學學報，2001 ;張少平等，華南理工大學學報，2010)。關於微生物發酵生產纖溶酶的產業化、規模化及應用還未見報導。微生物發酵生產纖溶酶與從動植物中分離提取相比有很大的優勢，從動植物中提取纖溶酶代價昂貴，需要進行嚴格脫毒，工藝複雜，原料來源有限，浪費大；而微生物發酵工藝簡單，可大規模生產，所需原料來源廣泛，在常溫常壓的發酵方式下，生產成本低，微生物代謝旺盛，可以提高原料利用率，獲得的酶穩定性好，產出率高，臨床風險小，在節能方面有相當大的優勢；這將有助於微生物纖溶酶的推廣和應用(章海鋒等，食品工程 技術，2008 ;孫月娥等，中國釀造，2010 ;璩竹玲等，中國海洋藥物雜誌，2003)。利用微生物發酵生產的纖溶酶可以開發功能性食品和新型藥物用於溶解動脈血栓、治療進展性腦梗死、不穩定型心絞痛、心腦血管血栓栓塞等疾病(王高學等，四川大學學報，2009 ;方璟等，長江大學學報，2010 ;趙連浩等，中國水電醫學，2010)，避免了傳統方法大劑量用藥引發血管出血、溶栓後血管再閉塞、藥物過敏等缺點，隨著現代生物工程技術的發展，臨床溶栓將越來越關注微生物發酵生產纖溶酶。因此，微生物發酵生產的纖溶酶的應用將對傳統的臨床溶栓領域產生深遠的影響，具有廣闊的開發潛力和應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產纖溶酶的方法，該發明主要是微生物經過產物定向馴化後，在24 30°C液體發酵生產纖溶酶的方法，這種生產方法獲得的微生物發酵纖溶酶活性可以達到150U/mL。如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制齊U。該方法生產的微生物發酵纖溶酶製劑成本低，專一性強，穩定性好，臨床風險小，可以從根本上避免了利用動植物提取的高成本、原料的限制、嚴格脫毒等缺點。本發明所述的一種微生物發酵生產纖溶酶的方法具體包括以下步驟
(I)將產生纖溶酶的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環境條件下生長良好；(2)按常規方法將產物定向馴化後的纖溶酶產生菌在24 30°C逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在24 30°C培養60 114h時，即微生物發酵生產纖溶酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，即為粗酶液；
(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。本發明中使用的菌種來源於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。纖溶酶產生菌株(例如，CGMCC編號1. 769或I. 892)，菌株先活化、定向馴化後，按本發明產酶條件發酵生產纖溶酶，定向馴化後的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油製成的菌懸液、在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基製備①菌種活化培養基葡萄糖10. 0g，纖維蛋白20. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值7. 0 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養基葡萄糖8. 0 12. Og,纖維蛋白15. 0 25. Og,酵母粉3. 0 6. 0g,NaCl 4. 0 6. Og,瓊脂粉20. Og,蒸懼水I. 0L,pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基葡萄糖5. 0 15. Og,大豆蛋白腖6. 0 12. 0g,K2HPO4 I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 5g, CaCl2 0. I 0. 5g, MgSO4 0. 2 0. 8g，pH 值自然，自來水 I. 0L,121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖15.0 25. 0g，豆漿0. 01 0.03L，酵母粉I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 0g, K2HPO4 I. 5 6. 5g, MgSO4 7H20 0. 2 0. 8g, CaCl2 0. 01 0. 05g, pH值自然，自來水I. 0L, 121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生纖溶酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環境條件下生長良好；(3)按常規方法將產物定向馴化後的纖溶酶產生菌在24 30°C逐級擴大培養36 60h而後按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)製備的二級種子按發酵液體積的3% 5%接種量接入IOL的發酵產酶培養基中，在24 26°C培養96 114h時，即微生物發酵生產纖溶酶結束；(5)將⑷的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，即為粗酶液；(6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
實施例二 (I)培養基製備①菌種活化培養基葡萄糖10. 0g，纖維蛋白20. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值7. 0 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養基葡萄糖8. 0 12. Og,纖維蛋白15. 0 25. Og,酵母粉3. 0 6. 0g,NaCl 4. 0 6. Og,瓊脂粉20. Og,蒸懼水I. 0L,pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基葡萄糖5. 0 15. Og,大豆蛋白腖6. 0 12. 0g,K2HPO4 I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 5g, CaCl2 0. I 0. 5g, MgSO4 0. 2 0. 8g，pH 值自然，自來水 I. 0L, 121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖15.0 25. 0g，豆漿0. 01 0.03L，酵母粉I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 0g, K2HPO4 I. 5 6. 5g, MgSO4 7H20 0. 2 0. 8g, CaCl2 0. 01 0. 05g, pH值自然，自來水I. 0L, 121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生纖溶酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環境條件下生長良好；(3)按常規方法將產物定向馴化後的纖溶酶產生菌在24 30°C逐級擴大培養36 60h而後按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)製備的二級種子按發酵液體積的5% 7%接種量接入50L的發酵產酶培養基中，在26 28°C培養78 96h時，即微生物發酵生產纖溶酶結束；(5)將(4)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，即為粗酶液；(6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。實施例三(I)培養基製備①菌種活化培養基葡萄糖10. 0g，纖維蛋白20. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值7. 0 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養基葡萄糖8. 0 12. Og,纖維蛋白15. 0 25. Og,酵母粉3. 0 6. 0g,NaCl 4. 0 6. Og,瓊脂粉20. Og,蒸懼水I. 0L,pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基葡萄糖5. 0 15. Og,大豆蛋白腖6. 0 12. 0g,K2HPO4 I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 5g, CaCl2 0. I 0. 5g, MgSO4 0. 2 0. 8g，pH 值自然，自來水 I. 0L,121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖15.0 25. 0g，豆漿0. 01 0.03L，酵母粉I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 0g, K2HPO4 I. 5 6. 5g, MgSO4 7H20 0. 2 0. 8g, CaCl2 0. 01 0. 05g, pH值自然，自來水I. 0L, 121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生纖溶酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環境條件下生長良好；
(3)按常規方法將產物定向馴化後的纖溶酶產生菌在24 30°C逐級擴大培養36 60h而後按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)製備的二級種子按發酵液體積的7% 9%接種量接入100L的發酵產酶培養基中，在28 30°C培養60 78h時，即微生物發酵生產纖溶酶結束；(5)將(4)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，即為粗酶液； (6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
權利要求
1.ー種微生物發酵生產纖溶酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產生纖溶酶的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環境條件下生長良好； (2)按常規方法將產物定向馴化後的纖溶酶產生菌在24 30°C逐級擴大培養，製備成液體一級種子和ニ級種子； (3)將液體一級種子或ニ級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在24 30°C培養60 114h時，即微生物發酵生產纖溶酶結束； (4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集到的液體，即為粗酶液。
(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(5)之後進ー步包括將步驟(5)得到的粗酶液進ー步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種定向馴化培養基、液體種子培養基、發酵產酶培養基分別為 (1)菌種定向馴化培養基葡萄糖8.0 12. Og,纖維蛋白15. 0 25. Og,酵母粉3. 0 .6.0g,NaCl 4. 0 6. Og,瓊脂粉20. Og,蒸懼水I. 0L,pH值自然,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(2)液體種子培養基葡萄糖5.0 15.0g，大豆蛋白腖6.0 12. 0g, K2HPO4 I. 0 .6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 5g, CaCl2 0. I 0. 5g, MgSO4 0. 2 0. 8g，pH 值自然，自來水 I. 0L,.121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基葡萄糖15.0 25. Og,豆漿0. 01 0. 03L,酵母粉I. 0 6. Og,KH2PO4 0. 5 2. 0g, K2HPO4 I. 5 6. 5g, MgSO4 7H20 0. 2 0. 8g, CaCl2 0. 01 0. 05g, pH值自然，自來水I. 0L, 121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產纖溶酶的方法是將產生纖溶酶的微生物進行6～10次活化，再經過產物定向馴化4～6次，使其在24～30℃環境條件下生長良好；按常規方法將產物定向馴化後的纖溶酶產生菌在24～30℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在24～30℃培養60～114h時，即微生物發酵生產纖溶酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
文檔編號C12N9/68GK102776167SQ20121010673
公開日2012年11月14日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者於爽, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 袁慎亮, 遲乃玉 申請人:大連大學