透明質酸凝膠組合物、其製造方法及含該組合物的醫用材料的製作方法

2023-06-04 17:11:36

專利名稱：透明質酸凝膠組合物、其製造方法及含該組合物的醫用材料的製作方法
技術領域：
本發明涉及由透明質酸和高分子化合物組成的基本上不用化學交聯劑或化學修飾劑改性的新型難溶於水的透明質酸凝膠組合物、及其製造方法，還特別涉及利用該組合物的機體相容性良好的醫用材料。
背景技術：
已知透明質酸是β-D-N-乙醯葡糖胺和β-D-葡糖醛酸相交替結合而形成的直鏈高分子多糖，不具有種屬及臟器特異性，移植或注入機體內都顯示良好的機體相容性。
將該透明質酸作為醫用材料用於機體的場合，因易溶於水而在體內滯留時間較短，為改進此缺點，提出了多種透明質酸的化學修飾物。還為了增強其作為醫用材料的強度、組織粘合性等多種物理性質，加入高分子物質改性，對許多透明質酸組合物進行了探討。
例如，透明質酸組合物用作骨修復材料時，與用於關節用人工軟骨的場合比較，要求有更大的強度，而透明質酸組合物用作防粘連材料時，與用作栓塞形成劑的場合比較，要求有更高的組織粘合性。
以前作為醫用材料有用的透明質酸組合物，可以列舉例如特表平5-508161號、特表平6-508169號的透明質酸鈉和羧甲基纖維素以碳化二亞胺類EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽]修飾的透明質酸組合物的報導。還可列舉WO86/00912的合羧基的多糖(透明質酸鈉、羧甲基葡聚糖、羧甲基澱粉、羧甲基纖維素等)以雙及多官能環氧化物BDDE(1，4-丁二醇縮水甘油醚)等交聯得到的透明質酸組合物的報導。還可列舉特開昭61-164558號的透明質酸鈉、硫酸軟骨素、肝素等以多官能環氧化物和溴化氰、環氧氯丙烷等交聯得到的透明質酸組合物的報導。還可列舉特開昭61-138601號的透明質酸鈉和各種高分子化合物以二乙烯基碸交聯的透明質酸組合物的報導。還可列舉特開平6-73102號、特開平8-301903號的透明質酸鈉和各種高分子化合物以肉桂酸交聯得到的透明質酸組合物的報導。
然而，它們不僅很難完全除去製造時使用的交聯劑等進行精製，而且在透明質酸和高分子化合物的分子中包含了交聯劑，其生理作用和機體相容性、安全性，在本質上很難說與透明質酸和高分子化合物等同。
還沒有開發出最大限度地利用透明質酸和高分子物質本身原來具有的優良的機體相容性特徵、不使用任何化學交聯劑和化學修飾劑、可能用作具機體相容性的醫用材料的、在機體內滯留時間長的透明質酸組合物。
本發明者為達到上述目的，深入探討了只含透明質酸的、機體相容性和成型性優良的、具有體內分解性的、不使用化學交聯劑和化學修飾劑的透明質酸凝膠(PCT/JP98/03536)本身的物理化學性質。
此外，發現由透明質酸和高分子化合物組成、實際上不用化學交聯劑或化學修飾劑改性的透明質酸凝膠組合物，能增強透明質酸凝膠原有的強度、粘合性、粘度、彈性等性質，適合於單用透明質酸凝膠難以滿足的對醫用材料的物性要求，且製備簡便，作為醫用材料具有理想的機體相容性和滯留性，從而完成了本發明。
尤其作為高分子化合物採用羧甲基纖維素的場合，該透明質酸凝膠組合物特別適於作為防止粘連的材料和復蓋創口的材料。
發明的揭示即本發明是(1)特徵為由透明質酸和高分子化合物組成、實際上不用化學交聯劑或化學修飾劑改性、在中性的37℃水溶液中12小時內的透明質酸溶出率在50％以下的透明質酸凝膠組合物；(2)特徵是高分子化合物為羧甲基纖維素的(1)所記載的透明質酸凝膠組合物；(3)特徵是將含有透明質酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液凍結，然後解凍而形成透明質酸凝膠組合物的透明質酸凝膠組合物的製造方法；(4)特徵是將含有透明質酸的pH3.5以下的水溶液凍結、然後解凍而形成的透明質酸凝膠與高分子化合物或高分子化合物凝膠混合而形成透明質酸凝膠組合物的透明質酸凝膠組合物的製造方法；(5)特徵是高分子化合物為選自多糖類、蛋白質、核酸類以及合成高分子化合物中的一種以上的(3)或(4)記載的透明質酸凝膠組合物的製造方法；(6)特徵是高分子化合物為羧甲基纖維素的(3)或(4)記載的透明質酸凝膠組合物的製造方法；(7)特徵是含有(1)或(2)記載的透明質酸凝膠組合物的醫用材料；(8)特徵是含有透明質酸凝膠組合物以選自γ射線、電子射線、等離子體或EOG中的一種照射或注入而得到的透明質酸凝膠組合物的醫用材料；(9)特徵是醫用材料為防粘連材料的(7)所記載的醫用材料；(10)特徵是醫用材料為創口復蓋材料的(7)所記載的醫用材料。
實施本發明的最佳形態以下對本發明詳細進行說明。
本發明所述改性，是指為使原來具水溶性的透明質酸或高分子化合物難溶化而進行的交聯或化學修飾。
本發明的透明質酸凝膠組合物，是將含透明質酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液凍結，然後解凍、中和、洗滌、乾燥而得到。
或者本發明的透明質酸凝膠組合物，是將含透明質酸的pH3.5以下的水溶液凍結然後解凍得到的透明質酸凝膠破碎，與高分子化合物凝膠一起投入水等水溶液中，經破碎、分散、乾燥而得。
這些透明質酸凝膠組合物，與單用透明質酸凝膠的場合比較，能簡單地提高機械強度和組織粘合性。
調整透明質酸和高分子化合物的水溶液的pH所使用的酸，只要是能調整pH至3.5以下的酸，都可以使用。為減少酸的使用量，最好使用強酸，例如鹽酸，硝酸，硫酸等。
凍結和解凍，是將已調整至酸性的透明質酸和高分子化合物水溶液置於任何容器中，然後凍結至設定溫度，在凍結結束後，至少進行一次使其於所規定的溫度解凍的操作。凍結和解凍的溫度和時間可根據容器的大小、水溶液的量在透明質酸酸性水溶液凍結、解凍的溫度和時間範圍內適當決定，但通常凍結溫度在冰點以下、解凍溫度為冰點以上較好。
由於凍結、解凍時間可以縮短，最好選用-5℃以下作凍結溫度，選5℃以上作解凍溫度。而時間只要是在該溫度凍結、解凍結束的時間以上，沒有特別限制。
將調整到酸性的透明質酸及高分子化合物的水溶液凍結然後解凍的操作的重複次數，根據所使用的透明質酸的分子量、水溶液濃度、水溶液的pH、凍結以及解凍的溫度和時間，以及生成的透明質酸凝膠組合物的強度等各種特性適當決定。通常最好重複一次以上。
而重複凍結、解凍操作中，也可以改變其凍結、解凍的溫度和時間。
透明質酸凝膠組合物的成型加工等的處理，可於製造時選擇透明質酸已調至酸性的溶液凍結時的容器和操作，製成所希望的片狀、膜狀、破碎狀、海綿狀、塊狀、纖維狀、流動狀和管狀的形式的透明質酸凝膠組合物。
例如將透明質酸組合物及其分散液置於平底容器中冷凍乾燥，就可得到片狀的透明質酸凝膠組合物。
而例如將透明質酸組合物及其分散液置於平底容器中晾乾，就可得到膜狀的透明質酸凝膠組合物。
本發明所用的透明質酸，不管其來源，由動物組織提取或用發酵法製造的，都可以使用。
本發明所用的透明質酸的分子量最好在約1×105～1×107道爾頓的範圍內。而且只要是分子量在上述範圍內的，即使是從較高分子量的透明質酸經水解處理等得到的，也同樣可以使用。
而本發明的透明質酸可使用其鹼金屬鹽，包括例如鈉、鉀、鋰鹽。
本發明所用的高分子化合物，不管是天然高分子化合物、合成高分子化合物，只要是可生成本發明的透明質酸凝膠組合物，且對於單用透明質酸凝膠難以滿足的醫用材料所要求的物理性質而言，能增強其透明質酸凝膠原有的性質的，不管什麼高分子化合物都可使用。
因此，不管高分子化合物相互之間，或高分子化合物和透明質酸凝膠之間是否形成交聯，加入透明質酸凝膠中可生成本發明的透明質酸凝膠組合物的所有高分子化合物都可用於本發明。
可用於本發明的高分子化合物的代表例，可從多糖類、蛋白質、核酸類以及合成高分子化合物中選擇，總之沒有什麼限制。
作為多糖類的例子，可列舉葡糖胺基葡聚糖類(肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸皮膚素等)、硫酸軟骨素(硫酸軟骨素-6-硫酸等)、硫酸角蛋白、肝素、硫酸乙醯肝素、藻酸及其生物學上允許的鹽、纖維素、殼多糖、殼聚糖、葡聚糖、澱粉、直鏈澱粉、聚乳酸、角叉菜膠等。
而作為多糖類的合成衍生物，可列舉例如羧甲基纖維素、羧甲基直鏈澱粉、各種烷基纖維素、羥乙基纖維素、羧基纖維素及氧化澱粉氧化再生纖維素等。
而作為蛋白質的實例，可列舉膠原、明膠、清蛋白、彈性蛋白、各種球蛋白、酪蛋白、谷蛋白等，以及它們的生物學允許的合成衍生物等。
而作為合成高分子化合物的例子，可列舉聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、它們的共聚物、以及聚丙烯酸/甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯醯胺等、聚乙烯醇、馬來酸及富馬酸的共聚物等這類衍生物等。
而本發明對這些高分子化合物不加任何限制。
本發明所用的含透明質酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液，系將透明質酸和高分子化合物與水混合、攪拌而得。其透明質酸與高分子化合物的濃度分別在5.0質量％以下，對水溶液或分散液的處理都很方便。
特別是使用分子量為2×106道爾頓以上的透明質酸的場合，透明質酸的濃度以2.5質量％以下為佳。
而含透明質酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液的配比，只要通過該液的凍結、解凍能得到透明質酸凝膠組合物即可，並無特別限制。例如，作為防粘連材料的配比，以50∶1～1∶20為佳。
或者在本發明中先分別製備透明質酸凝膠和高分子化合物凝膠，將其破碎得到透明質酸凝膠破碎物和高分子化合物凝膠破碎物，再混合，也可用作透明質酸凝膠組合物。
用於本發明的透明質酸凝膠和高分子化合物凝膠的混合比例，只要是投入水等水溶液中，可破碎、分散即可，沒有特別限制。
本發明所得透明質酸凝膠組合物，只要是通常的機體分解性醫用材料和透明質酸和使用領域內的，都可使用，沒有特別限制。例如可列舉其使用於防粘連材料、關節用人工軟骨、藥理活性化合物的載體、創口復蓋材料、人工皮膚、組織轉換型機體組織修復材料、關節注入劑、外科手術用縫合線、止血劑、人工臟器、人工細胞外基質或人工基底膜、用於診斷、治療的醫療器具、醫療用具等生物醫學製品或醫藥組合物。
而在透明質酸凝膠和高分子化合物凝膠混合時，通過混入生理活性物質，也可得到包含生理活性物質的透明質酸凝膠組合物。
下面，對本發明的透明質酸凝膠組合物經照射處理的醫用材料作一說明。照射透明質酸凝膠組合物的γ射線，以鈷60或銫137作放射源較好。理想的是用30kGy以下的吸收劑量的γ射線照射透明質酸凝膠組合物幹品，得到作防粘連材料、創口治療材料有效的透明質酸凝膠組合物。而通過改變照射量、照射時間，控制透明質酸凝膠組合物的溶解度，可控制其用作體內材料時適當的體內滯留性。透明質酸凝膠組合物通過γ射線照射，預期也具有滅菌效果。
照射透明質酸凝膠組合物的電子射線由電子加速器發生。理想的是用30kGy以下的吸收劑量的電子射線照射透明質酸凝膠組合物的幹品，得到作為防粘連材料、創口復蓋材料有效的透明質酸凝膠組合物。
等離子體可與固體、液體和氣體相區別，可認為是物質的第四態，它是通過極高的溫度或者強大的電場或磁場的作用而形成的，通常由離子、電子和中性核素組成。讓電作用於氣流形成的離子化氣體，已知有輝光放電。
照射透明質酸凝膠組合物的等離子體可採用氫、氧、惰性載氣的混合物暴露於電磁場形成的低溫氣體等離子體等。
將透明質酸凝膠組合物幹品置於等離子體發生器室內，注入氬、氧、氫等組成的等離子體發生氣，並使之擴散，在等離子體氛圍氣下照射10分鐘以上，便能得到作為防粘連材料、創口復蓋材料有效的透明質酸凝膠組合物。
EOG是對通常不可能幹燥滅菌、蒸氣滅菌的物質進行的採用環氧乙烷氣體的滅菌法。將透明質酸凝膠組合物幹品置於EOG滅菌室內，注入EOG，溫度條件最好在50℃以下進行滅菌，對防粘連材料、創口復蓋材料是有效的。
通過改變注入EOG的溫度、時間，控制透明質酸凝膠組合物的溶解度，可能控制用於體內材料的適當的體內滯留性。
下面說明本發明的醫用材料中的防粘連材料。
本發明所得的透明質酸凝膠組成物防粘連材料，可以片狀、膜狀、破碎狀、海綿狀、塊狀、纖維狀、流動狀或管狀等形態用於外科手術。所用的形態，以膜狀或片狀直接貼附於外科手術部位為佳。而微細破碎狀、流動狀以注射器塗布於外科手術部位為佳。而腹腔鏡手術中也可使用。
此外，在調至酸性的透明質酸凝膠組合物溶液中混入生理活性化合物後進行凍結、解凍，可能得到作為防粘連材料的含有生理活性化合物的透明質酸凝膠組合物。
本發明所得的透明質酸凝膠組合物防粘連材料的投與時間，在可防止術後粘連的任何時間都可以。可在手術中或手術結束時給予，特別在手術即將結束前給予為佳。
實施例以下用實施例對本發明作更詳細的說明，但本發明並不受其限制。
實施例1分子量為2×106道爾頓的透明質酸鈉與羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)溶於蒸餾水，至濃度各為0.5質量％。用1mol/L鹽酸使水溶液的pH調整為pH1.5。將酸性水溶液15ml置30ml的玻璃瓶中，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫。放置5日後，於25℃解凍。結果得到海綿狀的透明質酸凝膠組合物。
實施例2分子量為2×106道爾頓的透明質酸鈉與聚乙烯醇(聚合度1500，和光純藥制)溶於蒸餾水，使濃度分別為0.5質量％、10質量％。用1mol/L鹽酸調整pH，使調整後的水溶液pH為1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，置設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日後，於25℃解凍。結果得到塊狀的透明質酸凝膠組合物。
實施例3分子量為2×106道爾頓的透明質酸鈉與藻酸鈉(フナコシ公司制)溶於蒸餾水，使濃度均為0.5質量％。用1mol/L鹽酸調整pH，使調整後的水溶液的pH為1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫內。放置5日後，於25℃解凍。結果得到海綿狀的透明質酸凝膠組合物。
比較例1實施例1中不調整混合水溶液的pH，將中性溶液凍結、解凍、重複8次。結果，透明質酸水溶液不發生變化。即，不發生膠凝。第9次凍結後，進行冷凍乾燥，得到海綿狀的透明質酸組合物。
比較例2實施例2中不調整混合水溶液的pH，將中性溶液凍結、解凍，重複8次。結果，透明質酸水溶液不發生變化。即，不發生膠凝。第9次凍結後，進行冷凍乾燥，得到海綿狀的透明質酸組合物。
比較例3實施例3中不調整混合水溶液的pH，而將中性溶液凍結、解凍、重複8次。結果，透明質酸水溶液不發生變化。即，不發生膠凝。第9次凍結後，進行冷凍乾燥，得到海綿狀的透明質酸組合物。
參考例1將分子量2×106道爾頓的透明質酸鈉溶於蒸餾水，至濃度為1.0質量％。用1mol/L鹽酸調整pH，使調整後的水溶液的pH為1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日後，於25℃解凍。結果得到海綿狀的透明質酸凝膠。
實施例4透明質酸凝膠組合物的溶解性試驗在生理鹽水中加磷酸緩衝成分，濃度為50mmol/L，調整磷酸緩衝的生理鹽水至pH7。將上述實施例1～3所得的海綿狀透明質酸凝膠組合物及參考例1所得的透明質酸凝膠用蒸餾水洗滌，在濾紙上脫水。以相對所得的含透明質酸乾重150mg的透明質酸凝膠組合物磷酸緩衝生理鹽水為50ml的比例，將透明質酸凝膠組合物浸漬於磷酸緩衝的生理鹽水中。而對上述比較例1～3中所得的含透明質酸乾重150mg的冷凍乾燥的海綿狀透明質酸組合物，按磷酸緩衝生理鹽水50ml的比例，將透明質酸組合物浸漬於磷酸緩衝的生理鹽水中。
然後目視得出透明質酸凝膠組合物及透明質酸組合物的溶解性。並從磷酸緩衝的生理鹽水中透明質酸的濃度，求出25℃時透明質酸在磷酸緩衝的生理鹽水中溶出的比例。
從而可從上述試驗確定在25℃中性水溶液中透明質酸凝膠組合物的溶解性。
透明質酸濃度的測定磷酸緩衝的生理鹽水中的透明質酸可使用GPC進行測定。透明質酸具高分子量，因此首先洗脫，然後低分子的羧甲基纖維素、聚乙烯醇被洗脫。透明質酸的濃度，可用示差折光檢測器從透明質酸洗脫峰的面積求出。
按照上述，具體進行了實施例1～3的透明質酸凝膠組合物、參考例1的透明質酸凝膠、以及比較例1～3的透明質酸組合物的溶解性試驗。其結果如表1所示。
表1

由表1可見，例如，考察實驗No.1的實施例1所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質酸經過1日後溶解百分率為2％，4日後為4％，而10日後為6％。即經過10日，透明質酸凝膠中有94％透明質酸殘存。形態也保持海綿狀。
考察實驗No.7的參考例1所得的透明質酸凝膠的溶解百分率，經過1日後溶解百分率為3％，4日後為5％，而10日後為10％。即發現實施例1～3所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率與參考例1所得的透明質酸凝膠的溶解百分率相同。
與此相同，考察實驗No.4～6的比較例1～3所得的透明質酸組合物的溶解百分率，經過1日後，溶解百分率為100％，即已完全溶解。
實施例5透明質酸凝膠組合物的溶解性試驗在生理鹽水中加磷酸緩衝成分，濃度為50mmol/L，調整磷酸緩衝的生理鹽水至pH7。將上述實施例1～3所得的海綿狀透明質酸凝膠組合物及參考例1所得的透明質酸凝膠用蒸餾水洗滌，在濾紙上脫水。對所得的含透明質酸乾重20mg的透明質酸凝膠組合物，按磷酸緩衝生理鹽水50ml的比例，將透明質酸凝膠組合物浸漬於磷酸緩衝的生理鹽水中。並對上述比較例1～3所得的含透明質酸乾重20mg的冷凍乾燥的海綿狀透明質酸組合物，按磷酸緩衝生理鹽水50ml的比例，將透明質酸組合物浸漬於磷酸緩衝的生理鹽水中。
然後從磷酸緩衝生理鹽水中透明質酸的濃度求得37℃透明質酸在攪拌下的磷酸緩衝的生理鹽水中溶出的比例。
從而可從上述試驗確定在37℃中性水溶液中透明質酸凝膠組合物的溶解性。
根據上述，具體進行了實施例1～3的透明質酸凝膠組合物、參考例1的透明質酸凝膠及比較例1～3的透明質酸組合物的溶解性試驗。其結果如表2所示。
表2

根據表2，考察例如實驗No.8的實施例1所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質酸經6小時後溶解百分率為12％，12小時後為14％，而24小時後為18％。即經過24小時後透明質酸凝膠中透明質酸仍殘存82％。
考察實驗No.14的參考例1所得的透明質酸凝膠的溶解百分率，經過6小時後溶解百分率為12％，12小時後為15％，而24小時後為20％。即發現實施例1～3所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率與參考例1所得透明質酸凝膠的溶解百分率相同。
與此相比，考察實驗No.10～12的比較例1～3所得的透明質酸組合物的溶解百分率，6小時後溶解百分率為100％，已完全溶解。
實施例6分子量2×106道爾頓的透明質酸鈉與殼聚糖(和光純藥制)在蒸餾水中混和，其濃度分別為1.0質量％、0.1質量％，用1mol/L鹽酸調整pH至pH1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，放入設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日後，於25℃解凍。結果得到海綿狀的透明質酸凝膠組合物。
實施例7透明質酸凝膠組合物的溶解性試驗在生理鹽水中加入磷酸緩衝成分至濃度為100mmol/L，調整磷酸緩衝的生理鹽水至pH7。將上述實施例1、2及6所得的海綿狀透明質酸凝膠組合物用蒸餾水洗滌，在濾紙上脫水。對所得的含透明質酸乾重20mg的透明質酸凝膠組合物，按100ml磷酸緩衝的生理鹽水的比例，在磷酸緩衝的生理鹽水中浸漬透明質酸凝膠組合物。
從磷酸緩衝的生理鹽水中各成分的濃度，求出在25℃的磷酸緩衝的生理鹽水中溶出的透明質酸、羧甲基纖維素、聚乙烯醇和殼聚糖的比例。
透明質酸、羧甲基纖維素、聚乙烯醇以及殼聚糖濃度的測定使用GPC測定磷酸緩衝的生理鹽水中透明質酸、羧甲基纖維素、聚乙烯醇及殼聚糖。由於透明質酸具高分子量，首先從GPC洗脫，其後低分子的羧甲基纖維素、聚乙烯醇和殼聚糖被洗脫。用示差折光檢測器從峰面積求出該洗脫的透明質酸峰。
根據上述，具體對實施例1、2及6的透明質酸凝膠組合物進行了溶解性試驗。其結果如表3所示。
表3

根據表3，例如考察實驗No.15的實施例1所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率，可見透明質酸經過1日後溶解百分率為2％，4日後為4％，而10日後為6％。而羧甲基纖維素1日後為10％，4日後為30％，而10日後為51％。
考察實驗No.16的實施例2所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質酸經1日後溶解百分率為0％，4日後為1％，而10日後為3％。而聚乙烯醇1日後溶解百分率為0％，4日後為1％，而10日後為1％。
考察實驗No.17的實施例6所得的透明質酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質酸經1日後溶解百分率為1％，4日後為4％，而10日後為5％。而殼聚糖1日後溶解百分率為4％，4日後為5％，而10日後為6％。
實施例8透明質酸凝膠組合物的細胞毒性試驗將來自正常人皮膚的成纖維細胞培養物與本發明所得的透明質酸凝膠組合物在非接觸狀態下共存，觀察細胞增殖情況，評價其細胞毒性。用實施例1的方法製作的海綿狀透明質酸凝膠組合物以磷酸緩衝的生理鹽水浸漬後，製成冷凍乾燥物。將該冷凍乾燥物機械粉碎，取20mg置於ファルコン公司制的細胞培養墊(cell culture insert，孔徑3μm)中，浸入接種有細胞的培養基中。將透明質酸凝膠組合物非共存時的培養物，作為對照組。
培養條件平板細胞培養用12孔平板培養基DMEM培養基+10％胎牛血清，2ml/孔溫度37℃(5％CO2下)接種細胞數1×104個/孔培養開始後2日、5日、8日後，用倒置顯微鏡觀察細胞密度，即使透明質酸凝膠組合物共存時也顯示與對照組同樣良好的增殖，證明本發明得到的透明質酸凝膠組合物沒有細胞毒性作用。
實施例9將分子量2×106道爾頓的透明質酸鈉和羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)溶於蒸餾水，使其濃度均為0.5質量％。用1mol/L鹽酸調整該水溶液的pH至pH1.5，得透明質酸酸性水溶液。將此透明質酸酸性水溶液25ml置於塑料制的培養皿中，放入設定溫度為-20℃的冷凍庫。凍結5日，得海綿狀的透明質酸凝膠組合物。然後將其浸漬於在生理鹽水中加磷酸緩衝成分至50mM濃度、並調整pH至7的磷酸緩衝的生理鹽水100ml中，於5℃經24小時浸漬中和後，用蒸餾水充分洗滌。然後將其冷凍乾燥。結果得片狀的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料。
實施例10將分子量為2×106道爾頓的透明質酸鈉溶解至濃度為0.5質量％。用1mol/L鹽酸調整pH至調整後的水溶液的pH為1.5。取酸性水溶液15ml置30ml的玻璃瓶中，放入設定溫度為-20℃的冷凍庫。放置5日後，於25℃解凍，將所得的海綿狀透明質酸凝膠用微量勻漿器(Polytoron，Kinematica AG制)粉碎，得破碎的透明質酸凝膠。
將25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為0.5～1質量％。用1mol/L硝酸將這樣配製的水溶液的pH調整至1.0，取酸性水溶液15ml置30ml的容器內，放入設定溫度為-20℃的冷凍庫。放置3日後，於25℃解凍，將所得的海綿狀羧甲基纖維素凝膠用微量勻漿器(Polytoron，Kinematica AG制)粉碎，得破碎的羧甲基纖維素凝膠。
將所得的破碎的透明質酸凝膠與羧甲基纖維素鈉凝膠投入蒸餾水，使其濃度均為10.0質量％，並攪拌，得到漿狀液。將此漿狀液取25ml放入帶9cm角的塑料制培養皿中自然乾燥。結果得到薄膜狀的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料。
比較例4實施例9中混合水溶液的pH不加調整，將中性溶液凍結、解凍、重複8次。結果，透明質酸水溶液不起變化。即不發生膠凝。將此溶液放入塑料制的培養皿中，進行第9次凍結，冷凍乾燥，得到片狀透明質酸組合物的防粘連材料。
比較例5將在Na2HPO4·12H2O 1.1g溶於30g水、並用2％NaOH調整pH為10的溶液中平均分子量60萬的透明質酸鈉0.3g與羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)各0.3g溶於蒸餾水。將氰尿醯氯0.05g溶於1.5ml二噁烷，加至上述透明質酸溶液中，室溫反應3小時。此後，置透析膜中，對水透析1日，將此溶液15ml放入塑料制培養皿中，冷凍乾燥，得片狀的氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物的防粘連材料。
實施例11透明質酸凝膠組合物的防粘連材料用小鼠子宮模型進行的防粘效果試驗將實施例9與10所得片狀和膜狀的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料剪成1cm×2cm的長方形；對照組為比較例4所得的片狀透明質酸組合物剪成的1cm×2cm長方形；並把比較例5所得的氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物剪成1cm×2cm的長方形，供以下試驗。
取7周齡的ICR小鼠(體重25～30g)腹腔內注射戊巴比妥麻醉後經正中切開腹腔，將子宮角約10mm的長度以碘酊擦塗造成損傷。每組10隻小鼠，對照組不加處理，其他各組損傷部位分別用上述實施例9和10的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料、比較例4的透明質酸組合物的防粘連材料、比較例5的以氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物的防粘連材料的1cm×2cm的長方形片纏繞。然後每種情況都用5-0デキソン閉腹。
術後第10日，將無處理、給予透明質酸凝膠組合物及透明質酸組合物、氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物的小鼠各10隻、經頸椎脫臼致死後，腹部再開腹，判定有無粘連形成。粘連形成的判定，系將膜狀的極輕度的粘連不判定為粘連，而將發生纖維狀增厚的、用小鑷子拉也不易剝離的強烈粘連的情況判定為粘連。其結果如表4所示。
表4

由表4可見，無處理組粘連形成的比例為10隻中有9隻，而單用透明質酸混合液於中性時凍結得到的透明質酸組合物10隻中有5隻，以氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物10隻中有3隻，與之相比，用實施例9及10的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料10隻中形成粘連的為0隻，揭示它具有優良的防粘連作用。
雖然所有小鼠都能正常生育，但組織狀態以實施例9與10的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料以及以比較例4的透明質酸組合物的防粘連材料埋入的小鼠局部組織狀態未見異常，而以比較例5所得氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物埋入，發現組織有輕微炎症。
實施例12將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水，濃度為1質量％，用1mol/L硝酸調節水溶液的pH至1.5。另外，將25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，濃度為1質量％，用1mol/L硝酸調整如此配製的水溶液的pH為1.5。將兩種酸性水溶液混合，體積比為50∶1，將混合液100ml置容器(面積16cm×16cm)中，放入設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再將所得凝膠組合物用雙蒸餾水置換過剩的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝的生理鹽水洗滌3次，使其完全中和。中和後，將凝膠在室溫晾乾，得HA/CMA凝膠膜。
實施例13將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1N硝酸調整水溶液的pH至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68、換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓、第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH以1mol/L硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以2∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，凝膠於室溫晾乾，得HA/CMC凝膠膜。
實施例14將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調整至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH用1mol/L硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，凝膠於室溫晾乾，得HA/CMC凝膠膜。
實施例15將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調整至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH用1mol/L硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶2的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，凝膠於室溫晾乾，得HA/CMC凝膠膜。
實施例16將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調整至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH用1mol/L硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以50∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，將凝膠凍結，得HA/CMC凝膠片。
實施例17將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調整至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH用1mol/L硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以2∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，將凝膠凍結，得HA/CMC凝膠片。
實施例18將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調整至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH用1mol/L硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，將凝膠凍結，得HA/CMC凝膠片。
實施例19將透明質酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶於蒸餾水使濃度為1質量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調整至1.5。另外，取25℃時1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業製藥制)溶於蒸餾水，使濃度為1質量％，這樣配製的水溶液的pH用1N硝酸調整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶2的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日後，於25℃解凍，得海綿狀的透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液後，用100mmol/L的磷酸緩衝生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和後，將凝膠凍結，得HA/CMC凝膠片。
實施例20透明質酸/羧甲基纖維素凝膠組合物的溶解性試驗在生理鹽水中加磷酸緩衝成分，濃度為50mmol/L，調整磷酸緩衝的生理鹽水至pH7.4。相對上述實施例11～18所得所得的乾重為50mg的凝膠組合物，按磷酸緩衝的生理鹽水為50ml的比例，用磷酸緩衝的生理鹽水浸漬。
從磷酸緩衝的生理鹽水中的透明質酸濃度求得37℃時在磷酸緩衝的生理鹽水中溶出的透明質酸與羧甲基纖維素的比例。
由此可從上述試驗確定在37℃中性水溶液中透明質酸凝膠組合物的溶解性。
透明質酸與羧甲基纖維素濃度的測定磷酸緩衝的生理鹽水中的透明質酸，通過添加NaOH溶液使凝膠完全分解後用透明質酸酶進行處理。然後，分析樣品經0.45μm的濾器過濾後用GPC測定。根據示差折光檢測器算出的透明質酸洗脫峰的峰面積，求出透明質酸和羧甲基纖維素的濃度。透明質酸因酶分解而分子量降低，故其峰可能與高分子量的羧甲基纖維素相分離。
按上面所述，具體對實施例12～19的透明質酸凝膠組合物進行了溶解性試驗。其結果如表5、6所示。
表5透明質酸凝膠的溶解性(pH7)

表6透明質酸凝膠的溶解性(pH8)

由表5、6可見，凝膠組合物不管組成比如何，通過凝膠化可使透明質酸、羧甲基纖維素兩者均難以溶出。
實施例21透明質酸凝膠組合物的細胞毒性試驗來自正常人皮膚的成纖維細胞培養物與本發明所得的透明質酸凝膠組合物在非接觸狀態下共存，觀察細胞增殖情況，評價其細胞毒性。將以實施例12～19的方法製作的凝膠組合物用機械粉碎，取20mg置於ファルコン公司制的細胞培養墊(孔徑3μm)中，浸入接種有細胞的培養基。將在透明質酸凝膠組合物非共存時的培養物作為對照組。
培養條件平板細胞培養用12孔平板培養基DMEM培養基+10％胎牛血清，2ml/孔溫度37℃(5％CO2下)接種細胞數1×104個/孔培養開始2日、5日和8日後，用倒置顯微鏡觀察細胞密度，即使凝膠組合物共存也與對照組同樣良好地增殖，確認本發明所得凝膠組合物沒有細胞毒性作用。
實施例22大鼠盲腸擦傷模型的防粘連試驗大鼠(SD，Messer，9周齡以上)下肢肌注麻醉劑麻醉後，仰臥位固定以聚乙烯吡咯酮碘消毒腹部皮膚後剪毛。沿大鼠腹肌正中線開腹，用包有紗布的攪棒接觸盲腸部分擦過。在擦過部分放上以透明質酸組合物作原料製成的膜狀防粘連材料，將盲腸放回原來部位縫合。另外，不用防粘連材料處置，而把盲腸放回的大鼠作為對照組。這樣處置，包括對照組的各實驗組每組用10隻大鼠。術後一周解剖，判定有無粘連形成。粘連形成的判定，系將膜狀的極輕度的粘連不判定為粘連，而將發生纖維狀、厚的用小鑷子拉也不易剝離的強烈粘連的情況判定為粘連。其結果如表7所示。
仍將比較例4、5及實施例14～16製造的組合物200mg/g1cm2作為試驗片，用上述方法評價了作為防粘連材料的效果。
表7透明質酸凝膠防粘連試驗

根據表7，無處理組粘連形成的比例為10隻中有9隻，僅將透明質酸混合液於中性凍結而得到的透明質酸組合物10隻中有7隻，以氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物10隻中有4隻，與此比較，用實施例8的透明質酸凝膠組合物的防粘連材料10隻中為3隻以下，提示有優良的防粘連作用。
至於組織的狀態，在埋入實施例14～16的透明質酸凝膠組合物防粘連材料和比較例4的透明質酸組合物防粘連材料的局部組織其狀態未見異常，而比較例5所得的氰尿醯氯交聯的透明質酸組合物，其組織見輕度炎症。
實施例23凝膠創口復蓋材料在大鼠皮膚缺損模型中的創傷治療效果試驗取7周齡(約200g)的Wistar系雌性大鼠，背部剃毛，於乙醚麻醉下用眼科剪於背部皮膚除去直徑2cm的圓片，製作皮膚完全缺損的創口。設置無處理組，僅用醫用無紡布(40×40mm2塊重疊)包裹，而處理組，則用比較例4、5及實施例14製成的組合物(30×30mm)復蓋創面後，用醫用無紡布(40×40mm，2塊重疊)包裹。每組用6隻大鼠。醫用無紡紗布用粘合繃帶設定，再用膠帶固定。
通過測定創口面積隨時間的變化而進行治療效果的比較。即用下式求出與最初創口面積的面積比，檢測其隨時間的變化。
結果如表8所示。

表8透明質酸凝膠的創口癒合效果試驗

由表8可知，難溶於水的透明質酸凝膠片能增強創口治療效果。
實施例24將分子量2×106道爾頓的透明質酸鈉溶於水，濃度為0.5質量％。用1mol/L鹽酸調整pH至調整後的水溶液pH為1.5，將酸性水溶液15ml倒入30nl玻璃瓶中，置於設定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日後，於25℃解凍，將所得的海綿狀透明質酸凝膠用微量勻漿器(Polytoron，Kinematica AG制)粉碎，得破碎的透明質酸凝膠。在羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)溶於蒸餾水形成的1.0質量％的溶液中，使破碎的透明質酸凝膠擴散，形成2.0質量％的濃度，取此溶液25ml置於帶9cm角的塑料制培養皿中自然乾燥。結果得到膜狀的透明質酸凝膠組合物。
實施例25與實施例1同樣得到破碎的透明質酸凝膠。然後在聚乙烯醇(聚合度1500、和光純藥制)溶於蒸餾水的1.0質量％的溶液中，使破碎的透明質酸凝膠擴散，形成2.0質量％的濃度，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養皿中自然乾燥。結果得到膜狀的透明質酸凝膠組合物。
實施例26與實施例1同樣製得破碎的透明質酸凝膠。然後在明膠(フナコシ公司制)溶於蒸餾水成1.0質量％濃度的溶液中，使破碎的透明質酸凝膠擴散，形成2.0質量％的濃度，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養皿中自然乾燥。結果得膜狀的透明質酸凝膠組合物。
實施例27與實施例1同樣製得破碎的透明質酸凝膠。然後在硫酸軟骨素(和光純藥劑)溶於蒸餾水形成的1.0質量％濃度的溶液中，使破碎的透明質酸凝膠擴散，形成2.0質量％的濃度，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養皿中自然乾燥。結果得膜狀的透明質酸凝膠組合物。
比較例6與實施例1同樣製得破碎的透明質酸凝膠。然後將所得的破碎的透明質酸凝膠在蒸餾水中擴散，形成3.0質量％，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養皿中自然乾燥。結果得膜狀的透明質酸凝膠。
實施例28透明質酸凝膠組合物的乾燥強度試驗用島圖製作所制的EZ-TEST測定上述實施例24～27、比較例6的膜狀透明質酸凝膠組合物及透明質酸凝膠的乾燥拉伸強度。各樣品剪成1cm×5cm的長方形，滑塊間距30mm，以10mm/分的速度拉伸，測定破裂時的最大應力。
結果如表9所示。可見實施例24～27的透明質酸凝膠組合物的膜破裂時所加重量比比較例6的僅含透明質酸凝膠的膜的乾燥強度大大提高。
表9透明質酸凝膠組合物的乾燥強度

實施例29透明質酸凝膠組合物的組織粘合性試驗用島圖製作所制的EZ-TEST測定上述實施例24～27、比較例6的膜狀透明質凝膠組合物及透明質酸凝膠的組織粘合性。
各樣品剪成1cm×1cm的正方形，裝在滑塊上，測定與作為組織的無皮雞肉剝離時的應力。各樣品與組織以0.01kg/cm2的壓力接觸30秒後，測定滑塊以1mm/分速度拉伸剝離時的最大應力。
其結果如表10。
表10透明質酸凝膠組合物的組織粘合性

由表10可見，實施例24～27的透明質酸凝膠組合物的膜斷裂時的加重與比較例6的透明質酸凝膠膜的數值比較，明顯較好。
產業上利用的可能性根據上述的本發明，不使用任何化學交聯劑和化學修飾劑，能從透明質酸和高分子化合物簡單地配製透明質酸凝膠組合物。而且這種透明質酸凝膠組合物能增強單用透明質酸所形成的凝膠的各種物性，提供機體相容性更好的可用於醫療領域的醫用材料。
權利要求
1.一種透明質酸凝膠組合物，其特徵為包含透明質酸和高分子化合物，基本上未經化學交聯劑或化學修飾劑修飾，且浸入37℃中性水溶液中12小時透明質酸的溶出率在50％以下。
2.如權利要求1所述的透明質酸凝膠組合物，其中高分子化合物為羧甲基纖維素。
3.透明質酸凝膠組合物的製造方法，其特徵為將含有透明質酸及高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液凍結、然後解凍而形成透明質酸凝膠組合物。
4.透明質酸凝膠組合物的製造方法，其特徵為將含有透明質酸的pH3.5以下的水溶液凍結、然後解凍而形成的透明質酸凝膠與高分子化合物或高分子化合物凝膠混合，而形成透明質酸凝膠組合物。
5.如權利要求3或4所述的透明質酸凝膠組合物的製造方法，其中高分子化合物是選自多糖類、蛋白質、核酸類及合成高分子化合物的一種以上化合物。
6.如權利要求3或4所述的透明質酸凝膠組合物的製造方法，其中高分子化合物為羧甲基纖維素。
7.醫用材料，其特徵為含有權利要求1或2所述的透明質酸凝膠組合物。
8.醫用材料，其特徵為含有以選自γ射線、電子射線、等離子體或EOG中的一種對透明質酸凝膠組合物照射或注入而得到的透明質酸凝膠組合物。
9.如權利要求7所述的醫用材料，其中醫用材料為防止粘連的材料。
10.如權利要求7所述的醫用材料，其中醫用材料為復蓋創口的材料。
全文摘要
一種透明質酸凝膠組合物,其特徵為包含透明質酸和高分子化合物,基本上未經化學交聯劑或化學修飾劑修飾,且浸入37℃中性水溶液中12小時透明質酸的溶出百分率為50%或更低。
文檔編號A61L27/52GK1340080SQ00803894
公開日2002年3月13日 申請日期2000年2月18日 優先權日1999年2月19日
發明者橋本正道, 梅田俊彥, 宮田喜明, 山本修, 姬田康一, 新井一彥 申請人:電氣化學工業株式會社