米櫧組織培養的快速繁殖方法與流程

2023-06-04 09:34:31

本發明屬於植物繁殖技術領域，涉及一種米櫧組織培養的快速繁殖方法。

背景技術：

米櫧（Castanopsis carlesii （Hemsl.）Hay.），殼鬥科錐屬，喬木，高可達20米，芽小，葉披針形，葉全緣，或兼有少數淺裂齒，嫩葉葉背有紅褐色或棕黃色稍緊貼的細片狀蠟鱗層，成長葉呈銀灰色或多少帶灰白色；雄圓錐花序近頂生，花序軸無毛或近無毛，果序無毛，殼鬥近圓球形或闊卵形，堅果近圓球形或闊圓錐形，熟透時無毛，果臍位于堅果底部。3-6月開花，次年9-11月結果成熟。產中國長江以南各地。生於山地或丘陵常綠或落葉闊葉混交林中。喜雨量充沛和溫暖氣候，能耐蔭，喜深厚、溫潤之中性和酸性土，亦耐乾旱和貧瘠。既是優良的用材樹種，又是培育食用菌的優良原料，培肥土壤、涵養水源能力都比較強。米櫧樹形高大、美觀，葉橢圓或長圓形。早期生長迅速，適應能力強，抗風力強，又耐煙塵、抗汙染並能殺菌。在庭院觀賞及營造防火林帶中有著廣闊的應用前景和發展潛力。組織培養能通過無性繁殖，遺傳樹種的優良特性，能在短時間內快速繁殖獲得大量優質的組培苗，為優質種源推廣提供可能。

技術實現要素：

本發明的目的是針對米櫧組織培養過程中芽增殖係數低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、擴繁快的米櫧嫩枝組培繁殖方法。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種米櫧組織培養的快速繁殖方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導培養、增殖培養、壯芽培養和生根培養工序，採集半木質化、生長健壯的當年生米櫧嫩枝作為外植體，對外植體進行修剪、滅菌消毒處理後接種於初始芽誘導培養基中獲取初始芽，再將初始芽接種於增殖培養基中經過3-4個周期增殖培養，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養基中培養，最後將高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根，具體操作步驟如下：

（1）外植體選擇：採集半木質化、生長健壯的當年生米櫧嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置於自來水下衝洗10-15 min，然後去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡時間15-20 min，最後用純淨水洗淨藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；

（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種於初始芽誘導培養基中培養，培養30-35 d，初始芽萌發、生長；

（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；

（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，培養35-40 d，形成壯芽；

（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根；餘下小芽叢再次接種於步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然後再重複步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽。

以上所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+IAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L。

以上所述的增殖培養基的配方為：改良1/2MS培養基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+IAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+IAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L。

以上所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+IAA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述的改良MS培養基的配方為： KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。

以上步驟（3）所述的初始芽誘導培養的培育控制條件為：光培養、光照500-1000 lx，培養溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養、步驟（5）所述的壯芽培養、步驟（6）所述的生根培養的培育控制條件均為：光培養，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃。

相對於現有技術，本發明具有的優點和有益效果如下：

1、本發明以米櫧當年生嫩枝作為外植體，經過初始芽培養基培養，初始芽萌動率90%以上；經過3-4個周期增殖培養，形成叢生芽，芽增殖係數5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養基中培養，最後將高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根，從而縮短了米櫧的育苗周期，節省育苗材料，克服了傳統育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產成本，提高了生產效率。

2、本發明將高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根，餘下小芽叢繼續增殖培養，使得材料能夠多次繼代，實現大量增殖，規模化生產壯芽，實現黃樟油素型樟樹的擴繁。

3、本發明對MS基本培養基進行了改良，同時重點調整了與米櫧出芽壯芽相關元素，使得培養基更科學，更有針對性，更易促使米櫧芽誘導的發生、增殖和壯芽，效果顯著。

4、本發明操作過程簡便，培養周期短，繼代芽產量大,並且質量優，增殖係數達到5以上的組培苗產業化技術要求，具有很好的經濟效益、生態效益和社會效益。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。

實施例1：

（1）外植體選擇：採集半木質化、生長健壯的當年生米櫧嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置於自來水下衝洗10 min，然後去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡時間15 min，最後用純淨水洗淨藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；

（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種於初始芽誘導培養基中培養，置於光培養、光照500 lx，培養溫度20±1℃的環境中培養30-35 d，初始芽萌發、生長；所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 4.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；

（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，置於光培養，光照2500 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；所述的增殖培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 6.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；

（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，置於光培養，光照2500 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中培養35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 3.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；

（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中，餘下小芽叢再次接種於步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然後再重複步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽；生根培養是置於光培養，光照2500 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中誘導生根，生根率為89%；所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 1.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良MS培養基的配方為：KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4 280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。

實施例2：

（1）外植體選擇：採集半木質化、生長健壯的當年生米櫧嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置於自來水下衝洗15 min，然後去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最後用純淨水洗淨藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；

（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種於初始芽誘導培養基中培養，置於光培養、光照1000 lx，培養溫度20±1℃的環境中培養30-35 d，初始芽萌發、生長；所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 5.0 mg/L+IAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；

（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，置於光培養，光照3000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；所述的增殖培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 7.0 mg/L+IAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；

（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，置於光培養，光照3000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中培養35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 3.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；

（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中，餘下小芽叢再次接種於步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然後再重複步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽；生根培養是置於光培養，光照3000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中誘導生根，生根率為92%；所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 2.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良MS培養基的配方為：KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4 280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。

實施例3：

（1）外植體選擇：採集半木質化、生長健壯的當年生米櫧嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置於自來水下衝洗15 min，然後去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最後用純淨水洗淨藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；

（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種於初始芽誘導培養基中培養，置於光培養、光照1000 lx，培養溫度20±1℃的環境中培養30-35 d，初始芽萌發、生長；所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 6.0 mg/L+IAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；

（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，置於光培養，光照4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；所述的增殖培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 8.0 mg/L+IAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；

（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，置於光培養，光照4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中培養35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；

（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中，餘下小芽叢再次接種於步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然後再重複步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽；生根培養是置於光培養，光照4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中誘導生根，生根率為93%；；所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 2.5 mg/L+IAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良MS培養基的配方為：KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4 280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。