自體角膜上皮的製備方法
2023-06-04 03:44:26
專利名稱：自體角膜上皮的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種自體角膜上皮的製備方法。
背景技術：
燒傷、化學燒傷、眼表皮腫瘤、過敏性或放射性損傷、遺傳性眼病、眼表面化膿和其他眼綜合症可以導致眼角膜上皮細胞脫落，並使眼結膜覆蓋於眼角膜表面，產生角膜大量新生血管增生、復發性翼狀胬肉甚至失明等角膜性疾病。對於這類眼科疾病的治療，一般需要進行手術切除，但是切除後仍然會復發和增生。因而，要從根本上治療此類疾病，必須構建眼角膜的組織結構且補充角膜緣的幹細胞。
為了解決此類問題，人們發明了生物工程角膜，它是通過將從胚胎角膜緣組織或者另一側眼睛的角膜緣獲得的角膜幹細胞在體外培養至第三、四代時，構建在一個生物支架上而形成。它可用於治療由於各種原因導致的角膜損傷或角膜脫落病人的角膜移植。
但是，胚胎角膜緣組織生物工程角膜上皮存在著許多不足第一，由於胚胎角膜緣組織來源於異體，由其製備的角膜上皮會與患者角膜緣中的免疫細胞發生免疫排斥反應，從而增加了患者的痛苦和手術失敗的可能性。第二，由於製備角膜採用的生物支架為膠原蛋白、隱形眼鏡或羊膜，使得角膜幹細胞和上皮細胞在其表面難以均勻生長，手術後降解速度緩慢，因而限制了臨床應用。第三，角膜緣細胞的生長採用的鼠源性滋養層細胞，具有潛在的非人類來源的傳染；而且採用的胎牛血清培養基，也易於傳染牛的傳染病等，這些潛在的感染源對於患者是一個威脅。
申請號為03150375.6的中國專利申請公開了一種自體角膜上皮及其製備方法，該角膜上皮是將來源於患者自體的角膜上皮幹細胞在體外擴增和分化後，接種到纖維蛋白生物支架上進行培養構建而成。該組織工程角膜克服了上述缺點，但是當雙側眼角膜部位都出現問題時，自體角膜緣幹細胞來源就缺失了。
因而，需要這樣一種新的組織工程自體角膜上皮，它能克服上述非自體角膜的缺點，同時它源於非眼角膜組織，以便在雙側角膜組織都無法獲得時，仍然能構建出可用於移植的自體角膜上皮。另外，最好能有這樣一種組織工程自體角膜上皮的製備方法，該方法既能採用非自體角膜細胞，也可以用自體角膜緣細胞來製備角膜上皮，以使該方法能具有通用性，便於掌握和操作。
發明內容
本發明一個目的是提供一種組織工程自體角膜上皮的製備方法，該方法可以採用自體的口腔黏膜細胞製備角膜上皮，從而排除了當雙側眼睛都出現問題時對眼角膜緣細胞來源的限制，同時該方法還能用自體的角膜緣細胞製備角膜上皮。
本發明所提供的組織工程自體角膜上皮的製備方法，包括如下步驟(a)原代培養患者自體的口腔黏膜組織或角膜緣組織的細胞3-15天；(b)對所得細胞進行傳代擴增培養7-30天；以及(c)以纖維蛋白原為支架材料，與傳代培養的細胞一起構建成組織工程角膜上皮。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，將所得到的組織工程角膜上皮在37℃，5％CO2下，繼續培養5-45分鐘，優選10-30分鐘，更優選20分鐘，再加入1ml DMEM後用於移植。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，用角膜培養液進行細胞的原代培養和傳代培養，所述角膜培養液選自DMEM(Dulbecco改良的最低基礎培養液)或Epilife(購自美國CascadeBiologics公司)，優選為Epilife；可選地再添加以角膜培養液總量計的下列物質0.1-0.5％(質量百分數)的腦垂體提取液、0.1-5ng/ml的上皮生長因子、0.05-0.5μg/ml的氫化可的松、1-20μg/ml的轉鐵蛋白以及1-20μg/ml的胰島素，其中各物質的進一步優選加量為腦垂體提取液0.3％、上皮生長因子3ng/ml、氫化可的松0.2μg/ml、轉鐵蛋白10μg/ml以及胰島素10μg/ml。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，所述培養容器為培養皿、六孔板等，更優選為35mm的細胞培養皿。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，步驟(a)所述自體口腔黏膜組織為取自患者自體舌下、面頰內側或舌面等口腔黏膜部位的1-3平方毫米的口腔黏膜組織塊；角膜緣組織為取自患者正常眼角膜緣的1-2平方毫米大小的組織塊。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，在步驟(a)之前，用慶大黴素消毒所述口腔黏膜組織或者所述角膜緣組織，其濃度為50-200mg/ml，優選為100mg/ml，再用0.05％的胰酶/EDTA液消化20分鐘後，用DMEM衝洗組織2次，以去除表面的消化酶。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，在步驟(a)中，將組織塊剪碎並均勻分布於培養容器的內部表面，加入角膜培養液進行原代培養，每2-3天更換一次培養液，優選每3天更換一次培養液，培養時間為4天-12天，優選5天-10天，更優選7天。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，在步驟(b)中，用角膜培養液在37℃，5％CO2下，每2-3天更換一次培養液，在細胞達到50％-90％匯集後傳代，優選在細胞達到70％匯集後傳代，共培養9天-25天，優選12天-20天，再優選13天-16天，更優選14天。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，在步驟(c)中，以培養容器中待構建的體系的總體積為準，先將加量為1-8mg/ml的纖維蛋白原平鋪於培養皿底面，然後再將加量為1-5單位(unit)/ml的人凝血因子、加量為1-5μmol/ml的鈣離子和約20000-80000個已傳代的細胞，在室溫下與鋪好的纖維蛋白原混合均勻，使混合液體在培養容器中的厚度為0.5mm-1.5mm。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮製備方法的一個優選方案，在步驟(c)中，以培養容器中待構建的體系的總體積為準，先將加量為5mg/ml的人纖維蛋白原平鋪於培養皿底面，然後再將加量為2單位/ml的人凝血因子、加量為2.5μmol/ml的CaCl2和約40000個已傳代的細胞，在20-25℃下與鋪好的人纖維蛋白原混合均勻，使混合液體在培養容器中的厚度為1mm。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮的製備方法的一個優選方案，所述纖維蛋白原為人的纖維蛋白原或凍幹人纖維蛋白原；所述凝血因子從人或動物血液提取，優選為人凝血因子，可選自凝血因子II-XII的任何一種或多種，從動物提取的凝血因子是指非人重組的動物自身的凝血因子，所述動物可以是豬、牛等，優選豬。
按照本發明的組織工程自體角膜上皮的製備方法的一個優選方案，所述人的纖維蛋白原按下述方法製備取200ml人血漿，在4℃、3500轉/min的條件下離心30分鐘，棄上清液，加10ml注射用水，製成懸濁液，保存備用。
按照本發明所述方法製備的組織工程自體角膜上皮，可作為角膜移植用的生物材料，可移植到病人損傷角膜表面，從而修復和恢復角膜功能。
本發明組織工程自體角膜上皮的製備方法以口腔黏膜作為角膜上皮細胞來源，在克服了現有技術的免疫排斥反應、非人類來源的傳染和其生物支架不適於細胞均勻生長、降解慢等缺陷的同時，使得自體角膜的製備不受雙側角膜上皮缺損的限制，使患者在任何情況下都能得到適合的角膜。此外，該方法也能應用角膜緣細胞來製備角膜上皮，而且其效果比現有的方法更佳。這樣，就可以選擇使用角膜緣細胞/口腔黏膜細胞，使操作更加靈活。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步說明。
圖1A為本發明以口腔黏膜為細胞來源的成品外觀圖，圖1B為本發明以角膜緣為細胞來源的成品外觀圖；
圖2A為培養成功的以口腔黏膜為細胞來源的角膜上皮細胞在100倍光學顯微鏡下的形態學照片，圖2B為培養成功的以角膜緣為細胞來源的角膜上皮細胞在100倍光學顯微鏡下的形態學照片；圖3A、4A、5A、6A和7A是當採用口腔黏膜作為細胞來源時，患者術前的眼角膜情況圖；圖3B、4B、5B、6B和7B是當採用口腔黏膜作為細胞來源時，患者術後的眼角膜情況圖；圖8A、9A、10A、11A是當採用眼角膜緣作為細胞來源時，患者術前的眼角膜情況圖；圖8B、9B、10B、11B是當採用眼角膜緣作為細胞來源時，患者術後的眼角膜情況圖。
具體實施例方式
從正常人的眼角膜或口腔黏膜中分離出幹細胞，進行體外培養、增殖和分化，在二到三周內使這些細胞增殖數百萬倍，然後將這些帶有幹細胞的上皮細胞種在一種生物膜上，從而長成生物工程角膜，將其移植到角膜損傷病人的病變部位，進行修復，使病人症狀減輕、視力恢復。
在確定取角膜或口腔黏膜組織之前，由具有執業醫師資格的醫務人員向患者或患者家屬解釋原因，爭得患者或家屬同意，角膜上皮的取材部位由具有執業醫師資格的醫務人員確定，並按照醫院規定的手術原則取材。患者進行體檢和化驗，包括常規檢驗、傳染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的檢查。所取的口腔黏膜立即由專業人員放入無菌容器內，並立即冷藏(10℃以下)，然後按規定的標準操作程序處理。
實施例1口腔黏膜為細胞來源的組織工程自體角膜上皮的製備一、口腔黏膜組織健康細胞的提取和原代培養1.手術室取材(百級空氣淨化)由專業醫生從患者的舌下口腔黏膜取1mm×3mm大小的組織塊。
2.所取組織的保存在送達實驗室運輸過程中，可以將組織塊放入含有保存液的15ml保存管中保存(4℃)，所述保存液含DMEM和10％血清。
3.在超淨工作檯中消毒、清洗，修剪組織取新鮮的組織或者經過保存的組織，用含100mg/ml慶大黴素的PBS(磷酸緩衝液)衝洗3次，修剪多餘的脂肪和皮下結締組織。
4.組織消化(Thermo CO2培養箱)將上述組織塊放置於35mm培養皿中，加入濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，消化20分鐘，並將組織塊用鑷子提起放入DMEM中衝洗2次，去除表面的消化酶。
5.細胞分離將消化後的組織塊剪碎並均勻分布於35mm的培養皿內部表面，加入0.5ml角膜培養液培養，每三天更換培養液一次，培養5天後收穫細胞。
6.細胞鑑定1)形態學採用倒置光學顯微鏡觀察。細胞多呈多角型，角為鈍角，細胞呈圓性。細胞外觀透明，細胞緊密聯結成單層或多層。為典型正常的口腔黏膜上皮細胞。
2)細胞表型採用Keratin角質蛋白3的抗體(美國ICN公司)進行細胞免疫抗原結合反應，鑑定為典型正常的口腔黏膜上皮細胞。
3)致癌性採用裸鼠試驗，見《美國FDA關於生物製品生產用細胞株鑑定和指控的考慮要點)》，結果無致癌性。
4)無菌檢測按《中國生物製品規程》(2000版)通則《生物製品無菌試驗規程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
5)細胞存活率採用臺盼藍(trypan blue)染色法檢查，核染色的細胞為死亡細胞，不著色的細胞為活細胞，計數總細胞數和死細胞數，計算細胞存活率。
細胞存活率＝[(總細胞數-死細胞數)/總細胞數]×100％經測定，細胞存活率超過80％。
二、細胞培養傳代在細胞中加入Epilife(美國Cascade Biologics公司，編目碼M-EPI-500-CA)，接種入35mm培養皿，在Thermo CO2培養箱，37℃，5％CO2下進行培養，每3天換液1次，在上皮細胞達到70％匯集細胞後傳代，培養14天。
三、構建組織工程自體角膜上皮1.製備人纖維蛋白原用200ml血漿在4℃離心，3500轉/min，離心30分鐘，棄上清液，加10ml注射用水，製成懸濁液，保存備用。
2.構建角膜上皮採用人的纖維蛋白原為材料，按照濃度為5mg/ml，加入2unit/ml人的凝血因子(購於Sigma公司)和2.5μmol/ml CaCl2，同時加入約40000個左右傳代至第三代的細胞，室溫下混合，立刻倒入35mm的培養皿中，形成0.8mm厚的液體層。將培養皿放入37℃，5％CO2培養箱中20分鐘後，加入1ml DMEM培養液即可。
四、使用方法和效果使用前，用不含血清的培養液衝洗三次。在角膜的移植前，需要眼外科醫生對病人進行360度的環狀的病變部位切除，將本發明組織工程自體角膜做四針縫合於環狀切割部位，用隱形鏡片壓迫，將眼瞼採用兩針縫合，一周後拆除縫線，有新生的角膜上皮形成，角膜的功能和視力得到改善。
產品的儲存和運輸應在2℃-10℃、陰涼、乾燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的環境中進行。
本發明主要應用於燒傷，化學燒傷，眼表皮腫瘤，過敏性、放射性損傷，遺傳性眼病，眼表面化膿和其他眼綜合症導致的眼角膜上皮細胞脫落，結膜覆蓋於眼角膜表面而致的失明。
實施例2角膜緣為細胞來源的組織工程自體角膜上皮的製備一、角膜緣組織健康細胞的提取和原代培養1.手術室取材(百級空氣淨化)由專業醫生從患者的另一側正常眼角膜緣取1mm×1mm大小組織塊。
2.所取組織的保存在送達實驗室運輸過程中，可以將組織塊放入含有保存液的15ml保存管中保存(4℃)，所述保存液含有DMEM和10％血清。
3.在超淨工作檯中消毒、清洗，修剪組織取新鮮的組織或者經過保存的組織，用含100mg/ml慶大黴素的PBS衝洗3次，修剪多餘的脂肪和皮下結締組織。
4.組織消化(Thermo CO2培養箱)將上述組織塊放置於35mm培養皿中，加入濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，消化20分鐘，並將組織塊用鑷子提起放入DMEM中衝洗2次，去除表面的消化酶。
5.細胞分離將消化後的組織塊剪碎並均勻分布於35mm的培養皿內部表面，加入0.5ml角膜培養液培養，每三天更換培養液一次，培養14天後收穫細胞。
6.細胞鑑定1)形態學採用倒置光學顯微鏡觀察。細胞多呈多角型，角為鈍角，細胞呈圓性。細胞外觀透明，細胞緊密聯結成單層或多層。為典型正常的角膜上皮細胞。
2)細胞表型採用Keratin角質蛋白3的抗體(美國ICN公司)進行細胞免疫抗原結合反應，鑑定為典型正常的角膜上皮細胞。
3)致癌性採用裸鼠試驗，見《美國FDA關於生物製品生產用細胞株鑑定和指控的考慮要點》，結果無致癌性。
4)無菌檢測按《中國生物製品規程》(2000版)通則《生物製品無菌試驗規程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
5)細胞存活率採用臺盼藍染色法檢查，核染色的細胞為死亡細胞，不著色的細胞為活細胞，計數總細胞數和死細胞數，計算細胞存活率。
細胞存活率＝[(總細胞數-死細胞數)/總細胞數]×100％經測定，細胞存活率超過80％。
二、細胞培養傳代細胞培養在細胞中加入Epilife，接種入35mm培養皿，在ThermoCO2培養箱，37℃，5％CO2下進行培養，每3天換液1次，在上皮細胞達到70％匯集細胞後傳代，培養14天。
三、構建組織工程自體角膜上皮1.製備人纖維蛋白原用200ml血漿在4℃離心，3500轉/min，離心30分鐘，棄上清液，加10ml注射用水，製成懸濁液，保存備用。
2.構建角膜上皮採用人的纖維蛋白原為材料，按照濃度為5mg/ml，加入2unit/ml人的凝血因子(購於Sigma公司)和2.5μmol/ml CaCl2，同時加入約40000個左右傳代至第三代的細胞，室內溫下混合，立刻倒入35mm的培養皿中，形成1mm厚的液體層。將培養皿放入37℃，5％CO2培養箱中20分鐘後，加入1ml DMEM培養液即可。
四、使用方法和效果使用前，用不含血清的培養液衝洗三次。在角膜的移植前，需要眼外科醫生對病人進行360度的環狀的病變部位切除，將本發明組織工程自體角膜做四針縫合於環狀切割部位，用隱形鏡片壓迫，將眼瞼採用兩針縫合，一周後拆除縫線，有新生的角膜上皮形成，角膜的功能和視力得到改善。
產品的儲存和運輸應在2℃-10℃、陰涼、乾燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的環境中進行。
本發明主要應用於燒傷，化學燒傷，眼表皮腫瘤，過敏性、放射性損傷，遺傳性眼病，眼表面化膿和其他眼綜合症導致的眼角膜上皮細胞脫落，結膜覆蓋於眼角膜表面而致的失明。
組織工程自體角膜上皮的臨床報告一、診斷標準角膜緣幹細胞缺乏診斷標準角膜緣新生血管生長或角膜上皮結膜化大於或等於一個象限。
角膜上皮長期缺損診斷標準角膜上皮缺損時間7天以上。
病因診斷1.酸、鹼等化學燒傷及熱燒傷；2.藥物過敏；3.各種原因所致的角膜緣大量淺層新生血管；4.復發性翼狀胬肉。
二、納入病例標準1.符合角膜緣幹細胞缺乏或角膜上皮長期缺損診斷標準。
2.患者年齡≥12歲，可配合各項檢查。
3.單眼患病，對側眼無明顯眼病史。
4.籤署知情同意書者。
5.基礎淚液分泌試驗≥5mm(濾紙統一規格)。
6.裂隙燈檢查角膜及結膜無明顯感染及免疫性炎症表現。
角膜新生血管位於上皮下及基質淺層(≤1/4角膜厚度)。
瞼球粘連≤2個象限。
瞼裂閉合完全。無眼瞼內翻倒睫。
三、取材術前檢查血、尿常規，肝、腎功能，澳抗，愛滋病抗體。
取材應在正規手術室內進行。
取材部位舌下口腔黏膜取1mm×1mm大小的組織塊。另一側正常眼角膜緣取1mm×1mm大小組織塊。
四、實驗室體外培養標本取材後立即置於保存液中，放在2℃-10℃的保溫箱中運輸及保存，於6小時內進行培養，以生物組織工程技術培養自體口腔黏膜/眼角膜緣幹細胞，並符合其組織工程自體角膜上皮註冊產品標準。
五、剔除病例標準口腔黏膜/眼角膜緣幹細胞培養失敗，培養所得的產品不符合產品標準者。
六、移植手術1.術前點用抗生素眼藥水3天，4次/天。
2.手術應在正規手術室顯微鏡下進行。
3.角膜上皮刮除範圍應大於病變2mm2。
4.移植片與植床應貼合緊密，不應有積血或積液殘留。
5.以8-0可吸收線間斷縫合固定植片。
6.如有瞼球粘連，應將結膜與角膜組織徹底分離，充分止血並將結膜後退。
7.術畢，術眼塗點必舒眼膏並包紮。
七、術後處理1.連續包紮2天，第三天打開點藥。
2.口服抗生素3天，打開包紮後點用點必舒液1周，4次/天。可同時點用人工淚液，但禁用上皮生長因子。
八、療效評定標準(一)顯效1.角膜新生血管減少在二級(含二級)以上或消失。
2.角膜上皮缺損修復在二級(含二級)以上或消失。
3.眼部自覺刺激症狀減輕在二級(含二級)以上或消失。
(二)有效1.角膜新生血管減少在一級或以上。
2.角膜上皮缺損修復在一級或以上。
3.眼部自覺刺激症狀減輕在一級或以上。
(三)無效各項指標未達到上述標準者。
顯效、有效的判定標準至少滿足第(1)條加第(2)或第(3)條。九、數據管理和統計1.數據收集所有入選病例均必須完成病例觀察表，研究者將觀察、檢查結果及時、準確、完整、規範、真實地記錄於病歷及病例觀察表中。
全部數據錄入資料庫並校對後，將資料庫交統計分析人員進行統計分析，並提供統計報告，交臨床試驗的主要研究者寫出臨床總結報告。
2.統計分析根據數據性質，對基礎資料數據、療效分析(各指標分析)及安全性分析、分別進行統計描述。
計量數據統計方法觀察組內前後變化情況採用配對樣本t檢驗。
計數數據統計方法採用確切概率法。
等級型數據統計方法觀察組內前後變化情況採用符號秩和檢驗。
3.統計軟體所有的統計均利用SAS JMP5.0軟體進行統計學分析，採用雙側檢驗，以P≤0.05作為有統計學意義。
十、結論本產品在北京市兩家三甲醫院進行了臨床研究，共入選16例口腔黏膜為細胞來源的患者和18例角膜緣為細胞來源的患者，經六個月觀察後評價其對於角膜上皮長期缺損和角膜緣幹細胞缺乏患者的角膜刺激症、角膜上皮缺損、角膜新生血管以及視力的改善情況，各主要觀察指標的療效如下(一)口腔黏膜為細胞來源1.角膜刺激症狀明顯改善8例，改善6例，無改善2例，改善率87.5％；2.角膜上皮缺損明顯改善8例，改善4例，無改善4例，改善率75％；3.角膜新生血管明顯改善6例，改善5例，無改善5例，改善率68.75％；4.視力明顯改善2例，改善2例，無改善12例，改善率25％。
總體評價顯效(3)明顯改善+(2)或(1)明顯改善共計6例；有效(3)改善+(2)或(1)明顯改善或改善共計4例；即總體有效10例，總有效率62.5％。
本說明書附圖中3A-7A和3B-7B分別例舉了口腔黏膜為細胞來源的患者術前和術後的眼角膜情況圖以作說明，其中圖3A和圖3B來源於患者李××，女，32歲，診斷熱燒傷，病程40天；圖4A和圖4B來源於患者閆××，女，38歲，診斷病毒性角膜炎致角膜上皮糜爛，病程34月；圖5A和圖5B來源於患者張××，男，28歲，復發性翼狀胬肉，病程6月；圖6A和圖6B來源於患者常××，男，26歲，過氧乙酸燒傷，病程30天；圖7A和圖7B來源於患者張××，男，40歲，翼狀胬肉，病程6月。
從圖中可以看出在手術移植本發明的組織工程自體角膜後，患者的病情得到了改善。
(二)角膜緣為細胞來源1.角膜刺激症狀明顯改善8例，改善7例，無改善3例，改善率83.3％；
2.角膜上皮缺損明顯改善8例，改善6例，無改善4例，改善率77.8％；3.角膜新生血管明顯改善6例，改善7例，無改善5例，改善率72.2％；4.視力明顯改善2例，改善3例，無改善13例，改善率27.8％。
總體評價顯效(3)明顯改善+(2)或(1)明顯改善共計6例；有效(3)改善+(2)或(1)明顯改善或改善共計7例；即總體有效13例，總有效率72.2％。
本說明書附圖中8A-11A和8B-11B分別例舉了角膜緣為細胞來源的患者術前和術後的眼角膜情況圖以作說明，其中圖8A和圖8B來源於患者史××，男，40歲，診斷血管增生，病程3月；圖9A和圖9B來源於患者馬××，女，28歲，診斷復發性翼狀胬肉、血管增生，病程5個月；圖10A和圖10B來源於患者梅××，男，35歲，鐵水燒傷，病程20天；圖11A和圖11B來源於患者尹××，男，46歲，鹼燒傷，病程30個月。
從圖中可以看出在手術移植本發明的組織工程自體角膜後，患者的病情得到了改善。
權利要求
1.一種自體角膜上皮的製備方法，包括如下步驟(a)原代培養患者自體的口腔黏膜組織或角膜緣組織的細胞3-15天；(b)對所得細胞進行傳代擴增培養7-30天；以及(c)以纖維蛋白原為支架材料，與傳代培養的細胞一起構建成組織工程角膜上皮。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，將所得到的組織工程角膜上皮在37℃，5％CO2下，繼續培養5-45分鐘。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟(a)所述自體口腔黏膜組織為取自患者自體舌下、面頰內側或舌面的1-3平方毫米的組織塊；角膜緣組織為取自患者正常眼角膜緣的1-2平方毫米大小的組織塊。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，用角膜培養液進行細胞的原代培養和傳代培養，所述角膜培養液為DMEM或Epilife，或者是添加有以角膜培養液總量計的質量百分數為0.1-0.5％的腦垂體提取液、0.1-5ng/ml的上皮生長因子、0.05-0.5μg/ml的氫化可的松、1-20μg/ml的轉鐵蛋白以及1-20μg/ml的胰島素的DMEM或Epilife。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述角膜培養液為添加有以角膜培養液總量計的質量百分數為0.3％的腦垂體提取液、3ng/ml的上皮生長因子、0.2μg/ml的氫化可的松、10μg/ml的轉鐵蛋白以及10μg/ml的胰島素的DMEM或Epilife。
6.根據權利要求1或5所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)之前，用慶大黴素消毒所述口腔黏膜組織或者所述角膜緣組織，其濃度為50-200mg/ml，再用0.05％的胰酶/EDTA液消化20分鐘後，用DMEM衝洗組織2次。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中，將組織塊剪碎並均勻分布於培養容器的內部表面，加入角膜培養液進行原代培養，每2-3天更換一次培養液，培養時間為5-10天。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，在步驟(b)中，用角膜培養液在37℃，5％CO2下，每2-3天更換一次培養液，在細胞達到50％-90％匯集後傳代，培養12-20天。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，在步驟(c)中，以培養容器中待構建的體系的總體積為準，先將加量為1-8mg/ml的纖維蛋白原平鋪於培養皿底面，然後再將加量為1-5單位/ml的人凝血因子、加量為1-5μmol/ml的鈣離子和20000-80000個已傳代的細胞，在室溫下與鋪好的纖維蛋白原混合均勻，使所得到的混合液體在培養容器中的厚度為0.5mm-1.5mm。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，先將加量為5mg/ml的人纖維蛋白原平鋪於培養皿底面，然後再將加量為2單位/ml的人凝血因子、加量為2.5μmol/ml的CaCl2和40000個已傳代的細胞，在20-25℃下與鋪好的人纖維蛋白原混合均勻，使混合液體在培養容器中的厚度為1mm。
全文摘要
本發明公開了一種自體角膜上皮的製備方法，包括如下步驟(a)原代培養患者自體的口腔黏膜組織或角膜緣組織的細胞3－15天；(b)對所得細胞進行傳代擴增培養7－30天；(c)以纖維蛋白原為支架材料，與傳代培養的細胞一起構建成組織工程角膜上皮。本發明方法在克服了現有技術的免疫排斥反應、非人類來源的傳染和其生物支架不適於細胞均勻生長、降解慢等缺陷的同時，使得自體角膜的製備不受雙側角膜上皮缺損的限制，使患者在任何情況下都能得到適合的角膜。
文檔編號C12N5/08GK1916166SQ200610128698
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月8日 優先權日2006年9月8日
發明者韓斌 申請人:北京賽爾泰和生物醫藥科技有限公司