一種製備誘導多潛能幹細胞的方法,試劑盒及用途的製作方法

2023-06-04 16:24:56 1

專利名稱：一種製備誘導多潛能幹細胞的方法,試劑盒及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備誘導多潛能幹細胞的方法，試劑盒及用途。
背景技術：
(一 )幹細胞多能性(pluripotency)的特點胚胎幹細胞因為具有向三個胚層細胞的分化能力而被稱為「多潛能」幹細胞，此外，胚胎瘤(EC)細胞和胚胎生殖(EG)細胞均具有和胚胎幹細胞類似的多能性。多潛能幹細胞共同的特點是細胞核質比比較大，克隆樣生長(人胚胎幹細胞較扁平，而小鼠胚胎幹細胞較為隆起，細胞界限不明顯)，具有AP酶活性，特異地表達SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面標誌(小鼠胚胎幹細胞還特異性地表達SSEAl，而人胚胎幹細胞不表達SSEA1)，及0ct4， Nanog，Sox2, rexl (ZFP42)，⑶F3，lin28，TDGFl等標誌性基因。此外，還可以在懸浮培養條件下，形成胚胎小體(Embryonid bodies)結構，並發生自發分化，EB形成6_9天後貼壁培養，可檢測到向內、中、外三個胚層分化的細胞。( 二)誘導多能性幹細胞(IPS細胞)的研究2006年8月，日本京都大學再生醫科學研究所教授山中伸彌(Yamanaka)實驗室首先宣布在小鼠的成纖維細胞中導入4個基因⑴ct4，Sox2, c-Myc和KLF4)成功地將其誘導成為全能性的幹細胞，其性質和胚胎幹細胞類似，(Takahashi and Yamanaka, 2006)從而首次揭示了通過轉基因可以在分化的細胞中建立全能性。這是對許多年來的生物學觀念的一次巨大的衝擊，並且有望使基於幹細胞技術的治療性克隆徹底擺脫卵子來源的困境和破壞胚胎引起的倫理爭議。目前使用這種人工幹細胞米進行細胞治療患者尚存在安全隱患，但它不久後可能被應用於疾病模型的製作和新藥研發等研究工作。這一成果加快了再生醫學的研究步伐，具有劃時代的意義。在該實驗中，Yamanaka等人首先選取了和小鼠胚胎幹細胞自我更新及維持多能性相關的M個基因，分別將他們克隆到逆轉錄病毒載體，對胚胎成纖維細胞進行共轉染，在進行基於 ^χ15報告體系的篩選之後，他們觀察到了 ES-Iike的細胞集落的形成。經過對這M個基因的進一步分析，他們發現，僅轉導0ct4，Sox2, c-Myc, KLF4就可以使胚胎成纖維細胞完全轉變成為誘導的多潛能幹細胞(iPS細胞-Induced Pluripotent Stem Cells，俗稱「誘導的多潛能幹細胞」)。該IPS細胞擁有正常的核型，表達類似胚胎幹細胞的分子標誌，可以在體外被誘導分化為內、中、外三個胚層的終末分化的細胞，能夠在裸鼠體內形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有內、中、外三個胚層的分化細胞。此外，和胚胎幹細胞一樣，IPS細胞在Nanog和0ct4promoter上檢測到H3的低甲基化和高乙醯化。然而，採用 Fbx 15基因作為importer篩選出來的細胞並不具有完整的全能性，如內源0ct4等乾性基因仍然沒有能夠正常地啟動表達，不能通過囊胚注射的方法製成嵌合小鼠等。此後，2007年5月份，Yamanaka實驗室和Jaenisch實驗室同時在Nature雜誌上發表文章聲明(Okita et al.，2007 ；Wernig et al.，2007)，他們採用新的報告基因(基於 0ct4或nanog的promoter)進行抗藥性篩選可以產生完全重編程的IPS細胞，新的IPS細胞可以使內源基因重新啟動，並且可以通過囊胚注射製備成為嵌合小鼠，並整合到生殖系統中，產生完全由該IPS細胞生成的後代小鼠。Jaenisch實驗室的實驗結果表明，該IPS細胞甚至通過四倍體胚胎嵌合技術製備發育正常的小鼠胚胎。此外，新的IPS細胞的0ct4啟動子及Nanog啟動子的甲基化修飾也幾乎被完全擦除。同時，Hochedlinger實驗室和Plath實驗室合作在Cell stem cells上發表文章， 用更加豐富的手段驗證了 IPS細胞完全重編程的效果。(Maherali et al.，2007)例如，同分化細胞融合使分化細胞去分化的能力，雌性細胞的X染色體失活現象，H3K4和H3K27的甲基化譜等等。由此，4個因子誘導分化細胞成為全能性幹細胞的事實被完全確認！同時，研究發現只用0ct4，Sox2和KLF4 —樣可以獲得IPS細胞，cMyc並不是體細胞重編程所必需的轉錄因子。(Nakagawa et al.，2008)隨後發現，組蛋白去乙醯化酶抑制劑內戊酸(Valproic acid, VPA) (0. 5mM-3mM) (Huangfu et al.，2008)能夠在 0ct4， Sox2和KLF4三因子水平大大提高重編程的效率。隨後的研究發現，重編程因子Sox2也能夠被進一步替代，對於人和小鼠的體細胞如胚胎成纖維細胞，在0ct4和KLf4兩個因子的作用下就能夠實現重編程，雖然效率會明顯降低。多家實驗室篩選鑑定了一系列小分子以提高0ct4和Klf4誘導重編程的效率如組蛋白甲基轉移酶G9a抑制劑BIX01294， H3K4 組蛋白甲基化酶抑制劑 tranylcypromine (2 μ M) (Lin et al. ,2009), GSK3beta 抑制劑 CHIR99021(2yM-10yM) (Lin et al. ,2009), TGFbeta 抑制劑 616452 (2-5 μ Μ_4 μ Μ) (Maherali and Hochedlinger, 2009)等。但是，目前在小鼠成纖維細胞上利用單因子誘導體細胞重編程的方法仍未見報導。

發明內容
本發明提供了一種小分子組合，在只導入一個轉錄因子(0ct4)的情況下，誘導產生誘導多潛能幹細胞(iPS細胞)的方法。該方法通過向分化的細胞中提供特定組合的小分子，在外源表達0ct4因子的作用下，誘導產生IPS細胞-誘導的多潛能幹細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,俗稱「萬能細胞」)，其中所使用的小分子包括一個HDAC抑制齊[J，一個GSK3_beta抑制劑，一個TGF-beta抑制劑和一個H3K4去甲基化抑制劑。在一個特例中，所使用的小分子組合是VPA(HDAC抑制劑)，CHIR99021 (GSK3-beta抑制劑)， Tranylcypromine (H3K4 去甲基化抑制劑)，和 616452 (TGF-beta 抑制劑)。具體地，一個方面，本發明提供由HDAC抑制劑，GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合或它們中的至少兩種組成的組合用於誘導多潛能幹細胞產生的用途。在一個具體的實施方案中，所述至少兩種的組合是GSK3_beta抑制劑和TGF-beta 抑制劑的組合，是由GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，是由HDAC抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，或是由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑組成的組合。優選地，所述HDAC 抑制劑是 VPA，Butyrate, TSA, Scriptaid 等；所述 GSK3_beta 抑制劑是 CHIR99021，BI0，Gene ID :22416 的 wnt3a 編碼的 Wnt3a 蛋白等；所述 TGF-beta 抑制劑是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制劑是tranycypromine和phenelzine寸。
在本發明的另一個方面，提供一種製備誘導多潛能幹細胞的方法，包括向分化的細胞中提供誘導因子，所述誘導因子是0ct4和由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta 抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合或它們中的至少兩種組成的組合。在一個具體的實施方案中，所述至少兩種的組合是GSK3_beta抑制劑和TGF-beta 抑制劑的組合，是由GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的 組合，是由HDAC抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，或是由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑組成的組合。優選地，所述HDAC抑制劑是VPA， Butyrate, TSA, Scriptaid 等；所述 GSK3_beta 抑制劑是 CHIR99021，BIO, Wnt3a 等；所述 TGF-beta抑制劑是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制劑是tranycypromine和 phenelzine 等。在一個優選的實施方案中，所說方法還使用鹼性成纖維細胞生長因子bFGF。在一個具體的實施方案中，所述分化的細胞是皮膚細胞，肝細胞，胃細胞，角質細胞或血液細胞。優選地，所述分化的細胞來源於哺乳動物。更優選地，所述哺乳動物是人、 鼠或靈長類動物。在另一個具體的實施方案中，0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。優選地，0ct4的序列為SEQ ID NO 1所示的序列。在本發明的另一個方面，提供一種製備誘導多潛能幹細胞的試劑盒，包括向分化的細胞中提供的誘導因子，所述誘導因子包括0ct4和由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑， TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合或它們中的至少兩種組成的組合。在一個具體的實施方案中，所述至少兩種的組合是GSK3_beta抑制劑和TGF-beta 抑制劑的組合，是由GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，是由HDAC抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，或是由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑組成的組合。優選地，其中所述HDAC抑制劑是VPA，butyrate, TSA等；所述GSK3_beta抑制劑是0111 99021，810，￥壯33(蛋白編碼自基因￥壯33，661^10 22416)等；所述TGF-beta抑制劑是 616452，SB431542 等；所述 H3K4 去甲基化抑制劑是 tranycypromine，phenelzine。優選地，0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。更優選地，0ct4的序列為SEQ ID NO 1所示的序列。在一個優選的實施方案中，所說試劑盒還包含鹼性成纖維細胞生長因子bFGF。在本發明的另一個方面，提供利用上述方法或試劑盒製備的多潛能幹細胞。對於HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑的用量，對於本領域的普通技術人員而言是可以常規選擇的。通常為HDAC抑制劑如 VPA(0. 5mM-3mM) ；H3K4 去甲基化抑制劑如 tranylcypromine (2 μ M) ；GSK3beta 抑制劑如 CHIR99021(2yM-10yM)，TGFbeta 抑制劑如 616452 (2-5μ M-4 μ M)，優選地，VPA 使用 0. ImM-ImM, CHIR99021 使用 0. 5 μ M-IO μ Μ, 616452 使用 0. 5 μ Μ_5 μ Μ, tranylcypromine 使用 0· 5 μ Μ-5 μ Μ。


圖1.小分子化合物促進重編程的效率
圖 2.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導iPS細胞的時間表示意 3.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS原代細胞集落，phase為細胞克隆的形態圖，GFP為綠色螢光視野。圖 4.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系經長期傳代保持胚胎幹細胞的形態，呈AP染色陽性(見圖AP)， 並且其整合的P0ct4-GFP報告體系表達綠色(見圖GFP)螢光。圖phase表示細胞集落的形態圖。圖 5.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因(0ct4)誘導的iPS細胞系表達多潛能性標誌蛋白，即0ct4, Sox2, Nanog, Utfl, Rexl和 SSEAl。
圖 6.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系中只有0ct4 —個外源重編程基因的整合。0-iPS-la，lb, lc,2a, 2b，3a，3b指單基因(oct4)誘導的不同的iPS細胞系。4F_iPS指4個因子(0ct4，sox2，klf4， c-myc)誘導的iPS細胞系，MEF是未導入外源基因的靶細胞(陰性對照)，H20是RT-PCR實驗的無樣本陰性對照。圖 7.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系表達乾性標誌基因。0-iPS-la，lb，lC，2a，2b指單基因(oct4)誘導的不同的iPS細胞系。H2O是RT-PCR實驗的無樣本陰性對照。圖 8.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系的0ct4，NanOg啟動子DNA甲基化水平很低，和胚胎幹細胞類似。圖 9.用 4 個小分子組合(VPA, CHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系基因表達譜和胚胎幹細胞接近。0-iPS-la，lb，lC，2a指單基因 (oct4)誘導的不同的iPS細胞系，4F-iPS指4個因子(0ct4, sox2, klf4, c-myc)誘導的iPS 細胞系。圖 10.用 4 個小分子組合(VPAjCHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系具有三個胚層組織細胞類型的分化能力。左上軟骨組織(中胚層)；右上類神經管和黑素細胞(外胚層)；下圖類小腸上皮(內胚層)。4個圖中均可見大量肌肉纖維(中胚層)。圖 11.用 4 個小分子組合(VPAjCHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系具有囊胚注射產生嵌合小鼠的能力。圖 12.用 4 個小分子組合(VPAjCHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系具有囊胚注射產生生殖嵌合的能力。圖 13.用 4 個小分子組合(VPAjCHIR 99021,616452, Tranylcypromine)和單基因 (0ct4)誘導的iPS細胞系經囊胚注射產生的嵌合小鼠的各個組織器官均可檢測到供體iPS 細胞的嵌合。其中，泳道1的ICR小鼠尾尖和泳道2的129小鼠尾尖細胞不含有p0ct4-GFP 基因片段，作為陰性對照，泳道3的OG小鼠尾尖細胞和泳道4的OG小鼠胚胎成纖維細胞均含有p0ct4-GFP基因片段，作為實驗的陽性對照；泳道5 嵌合鼠肺；泳道6 嵌合鼠尾尖；泳道7 嵌合鼠肝臟；泳道8 嵌合鼠心臟；泳道9 嵌合鼠胃；泳道10 嵌合鼠腦；泳道11 嵌合鼠睪丸；泳道12 嵌合鼠腎臟；泳道13 嵌合鼠脾臟；泳道14 嵌合鼠皮膚；泳道15 水 (PCR陰性對照)。圖14.用於誘導單基因(oct4)的iPS的小分子的結構式。圖15.用更少的小分子和單基因(0ct4)誘導得到iPS細胞克隆。A.用VC6誘導 MEF細胞成為iPS細胞克隆；B.用VC6誘導成體成纖維細胞成為iPS細胞克隆；C.用C6誘導MEF細胞成為iPS細胞克隆；D.在bFGF存在時，用C6誘導MEF成為iPS細胞克隆。圖16.小分子組合在一定濃度範圍內均有效誘導iPS細胞。圖A中VPA濃度單位為 mM,其餘小分子(CHIR99021，616452，tranylcypromine)的濃度單位為 μ M。 圖17.成體小鼠的成纖維細胞被0ct4和4個小分子的組合誘導成為iPS細胞。 A 新產生的iPS細胞克隆的形態和GFP螢光圖；B 傳代培養後的iPS細胞形態，螢光，AP染色，免疫螢光染色結果圖。C:成體小鼠成纖維細胞誘導的iPS細胞克隆(Adult-0-iPSla， lb, 2a)經基因組PCR檢測確認只有0ct4 —種外源基因的整合。其中0-iPS-la，lb，lc，2a 指單基因(oct4)誘導小鼠胚胎成纖維細胞得到的不同的iPS細胞系。Adult-0-iPS-la，lb， 2a指單基因(oct4)誘導成體小鼠細胞得到的幾株不同的iPS細胞系。MEF是未導入外源基因的靶細胞(陰性對照)，H2O是RT-PCR實驗的無樣本陰性對照。圖18.小分子用相同靶點的其它因子替代後得到單oct4誘導的iPS細胞。右列為克隆形態圖，左列是GFP螢光下的視野圖。a:用Wnt3a(R&D)替代CHIR99021 ;b : butyrate (Tocris)替代VPA得到的iPS細胞克隆。
具體實施例方式以通過實施例進一步舉例說明本發明。本領域的普通技術人員可以理解本發明並不限於所述實施例，並且本領域的普通技術人員可以基於說明書的教導對實施例進行修改。這些修改同樣包含在本發明由後附的權利要求所定義的本發明的範圍內。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。在本發明的實施例中，「VPA」用「V」表示；"CHIR 99021，，用「C」或「CHIR，，表示； 「616452」用「6」表示；「Tranylcypromine」用「T」表示。例如，「VC6」表示「VPA，CHIR99021 和616452的組合」。實施例1 小鼠品系轉基因鼠品系TgN(G0FGFP)lllmeg(簡稱為 0G)購自 RIKENBioResource Center。 其他小鼠品系ICR，129S2/SvPasCrlVr (簡稱為129)和C57BL/6NCrlVr (簡稱為C57)均購自維通利華。細胞培養原代小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)均來自ICRX0G，129XOG和C57XOG轉基因小鼠。MEF和129T細胞培養基為含10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)的Dulbecco，s Modified Eagle Medium(DMEM, Hyclone)培養基。小鼠胚胎幹細胞系 Rl 禾Π iPS 細胞培養基為80 % DMEM/F12 (Invitrogen), 10 % Knockout serum replacement (KSR) (Invitrogen), 10 % FB S,並包含 ImM L-glutamine, 1 % non-essential amino acids, 0. ImMbeta-mercaptoethanol (S Invitrogen) \)JsR lOOOU/mL Lif (Millipore) 。 /]、 胚胎幹細胞系Rl和iPS細胞培養在絲裂黴素C處理後的MEF飼養層細胞上，培養基每天換液。實施例2.慢病毒感染及iPS重編程分別包括oct4(SEQ ID NO 1)，sox2 (SEQ ID NO 2), klf4(SEQ IDNO 3)以及 c-myc (SEQ ID NO 4)的慢病毒載體的構建以及感染方法見(zhao et al.，2008)。用上述分別包含 oct4(SEQ ID NO 1), sox2 (SEQ IDNO :2)，klf4 (SEQ ID NO 3)以及 c_myc(SEQ ID NO 4)的慢病毒載體感染MFF細胞，48小時後換為誘導重編程的培養基。誘導重編程的培養基為 80 % DMEM/F 12 (Invitrogen)，10 % Knockout serum replacement (KSR) (Invitrogen), 10% FBS,並包含 ImM L-glutamine, 1 % non-essential aminoacids, 0. ImM beta-mercaptoethanol, lOOOU/mL Lif以及包含誘導重編程的小分子組合VPA(0. 5mM, Sigma), CHIR99021(3uM, Stemgent)，616452(2uM，Calbiochem)禾口 Tranylcypromine(2uM， Tocris)0為了促進MEF細胞的擴增，在部分實驗中，lOng/ml basic FibroblastGrowth Factor (P&A Biotech)在病毒感染後連續8天持續加入。誘導培養基每四天換一次液。GFP 陽性的iPS克隆在病毒感染後30天左右時間挑出，並在小鼠胚胎幹細胞基礎培養基(即上述小鼠胚胎幹細胞系Rl和iPS細胞培養基)內長期培養。實施例3.鹼性磷酸酶和組化染色鹼性磷酸酶的存在是胚胎幹細胞保持未分化狀態的一個重要指標，通過檢測其的存在與否，可進一步判定胚胎幹細胞。胚胎幹細胞中含有豐富的鹼性磷酸酶(AP)，而已分化的胚胎幹細胞AP呈弱陽性或陰性。按照製造商的說明，用Alkaline Phosphatase Detection Kit (Chemicon)檢測誘導的多潛能幹細胞的鹼性磷酸酶(AP)的表達。結果如圖4所示。為進一步檢測用本發明誘導方法獲得的細胞是否真的像形態上所表現出來的一樣保持了細胞的未分化狀態，使用細胞免疫螢光染色的方法進一步檢測IPS細胞內源性乾性基因的表達情況。組化染色所用抗體為一抗SSEA-I (1 200, Millipore), 0ct4(l 200， Abeam)， Sox2(l 200， SantaCruz)， Rexl(1 200， Santa Cruz), Nanog(l 40, R&D), Utfl(l 200，Abeam)，。 二抗Rhodamine-Iabeled donkey anti-mouse IgG(1 100, Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled donkey anti-rabbit IgG(1 100, Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled donkey anti-goat IgG(1 : 100, Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled donkey anti-goat IgM(l ； 100， Santa Cruz), Rhodamine-Iabeled goat anti-mouse IgG3 (1 : 100, Santa Cruz)。DAPI (Beyotime)用於染細胞核。見結果部分涉及的圖5，圖17B。免疫螢光SSEA-1，0ct4, Sox2, Rexl, Nanog和 UTFl的陽性結果證實所得到的細胞克隆確實是具有類似胚胎幹細胞特性的iPS細胞。實施例4. DNA甲基化分析用EZ-96DNA 甲基化試劑盒(Zymo Research, Orange County, CA)完成全基因組 DNA亞硫酸鈉轉化。採用Sequenom，s MassARRAY分析平臺進行量化甲基化分析(Kim et al.，2009)。用 EpiDESIGNER 軟體(http //www. epidesigner. com)根據擴增的 Naong 序列 (SEQ ID NO 39)及0ct4序列(SEQ ID NO 40)設計PCR引物。檢測DNA甲基化情況。1.組織、細胞及血樣DNA提取
ν ji M Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega) NucleoSpin Tissue(MN)提取組織、細胞或血樣中的DNA，用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質檢。質檢合格的DNA將濃度調整到50ng/ μ L，_20°C儲存備用。2.亞硫酸氫鹽轉化反應使用EZ 96DNA Methylation Kit (Zymo Research)進行 DNA 的轉化。3. PCR 擴增以亞硫酸氫鹽轉化後的DNA為模板，在384孔板進行PCR擴增反應。每個反應總體積 5 μ L，包含模板 DNA lμL(DNA濃度>5ng//μL)，5U/μL Hotstar Taq 0. 2U，引物每條 lpmol，25mM dNTP，0. 04 μ L，反應條件為 94°C 15 分鐘；94°C 20 秒，62°C 30 秒，72°C 1 分鐘，45個循環；72°C 3分鐘；4°C放置。4. PCR產物純化PCR 反應產物使用 2yL SAP (shrimp alkaline phosphatase 來自試劑盒)處理， 去除體系中游離的dNTP。反應體系7 μ L，其中PCR產物5 μ L，SAP混合液2 μ L (SAP 0. 3 μ L, RNase-free ddH20 0. 17 μ L)。反應程序 37°C 20 分鐘；85°C 5 分鐘；4°C放置。5.體外轉錄及RNase A特異性酶切反應RNase A特異性酶切反應分為T切與C切兩種，本實驗中使用單獨的T切反應。 體外轉錄與酶切反應同時進行，總體積7μ L反應體系包含SAP處理後PCR產物2 μ L， RNase-free ddH20 3. 15 μ L,5x T7PolymeraseBuffer 0. 89μ L,T Cleavage Mix(來自試齊[J ^ )0. 24μ L, IOOmM DTT, 0. 22 μ L, T7RNA&DNAPolymerase 0. 44 μ L, RNase A 0· 06 μ L0 反應程序為37°C 3小時，4°C放置。6.樹脂純化每個樣品中加水20 μ L稀釋，震蕩混勻，加入6mg Clean Resin樹脂純化10分鐘， 3200g離心5分鐘。7.晶片點樣及質譜檢測使用MassARRAY Nanodispenser RS 1000 點樣儀(SEQUEN0M)將純化後產物點至384孔SpectroCHIP (SEQUEN0M)晶片上，將點制好的晶片放入MassARAYCompact System(SEQUENOM)進行檢測。SpectroCHIP 晶片使用 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time off light)基質輔助雷射解吸附電離飛行時間質譜分析技術，檢測數據通過EpiTYPER軟體(SEQUEN0M)分析並輸出結果。見結果部分中涉及的圖8。實施例5. RT-PCR檢測iPS細胞全RNA用TRIzol提取(Invitrogen)，按照相關操作手冊用「EasyScript Reverse Transcriptase" (TransGen Biotech) it 於 RNA β i。 PCR M 2XEasyTaq SuperMix (TransGen Biotech)體系完成。引物見下表。
權利要求
1.由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合或它們中的至少兩種組成的組合用於誘導多潛能幹細胞產生的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述至少兩種的組合是GSK3_beta抑制劑和TGF-beta抑制劑的組合，是由GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合， 是由HDAC抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，或是由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑組成的組合。
3.權利要求1的用途，其中所述HDAC抑制劑是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3_beta 抑制劑是 CHIR99021，BI0 或 Gene ID :2M16 的 wnt3a 編碼的 Wnt3a 蛋白；所述 TGF-beta 抑制劑是616452或SB431542 ；所述H3K4去甲基化抑制劑是tranycypromine或phenelzine， 其中 VPA， CHIR99021,616452, tranycypromine, burytrate, TSA, SB431542, BIO 和 phenelzine的結構式如下CHIR 99021
4.一種製備誘導多潛能幹細胞的方法，包括向分化的細胞中提供誘導因子，所述誘導因子是0ct4和由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合或它們中的至少兩種組成的組合。
5.權利要求4的方法，所述至少兩種的組合是GSK3_beta抑制劑和TGF-beta抑制劑的組合，是由GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，是由HDAC抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，或是由HDAC抑制劑， GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑組成的組合。
6.權利要求4的方法，其中所述HDAC抑制劑是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3_beta 抑制劑是 CHIR99021，BI0 或 Gene ID :22416 的 wnt3a 編碼的 Wnt3a 蛋白；所述 TGF-beta 抑制劑是616452或SB431542 ；所述H3K4去甲基化抑制劑是tranycypromine或phenelzine， 其中 VPA， CHIR99021,616452, tranycypromine, burytrate, TSA, SB431542, BIO 和 phenelzine的結構式如權利要求3中所示。
7.權利要求4的方法，還使用鹼性成纖維細胞生長因子。
8.權利要求4的方法，其中所述分化的細胞是皮膚細胞，肝細胞，胃細胞，角質細胞或血液細胞。
9.權利要求4的方法，其中所述分化的細胞來源於哺乳動物。
10.權利要求9的方法，其中所述哺乳動物是人、鼠或靈長類動物。
11.權利要求4的方法，其中0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。
12.—種製備誘導多潛能幹細胞的試劑盒，包括向分化的細胞中提供的誘導因子，所述誘導因子包括0ct4和由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合或它們中的至少兩種組成的組合。
13.權利要求12的試劑盒，還包含鹼性成纖維細胞生長因子。
14.權利要求12的試劑盒，所述至少兩種的組合是GSK3_beta抑制劑和TGF-beta抑制劑的組合，是由GSK3_beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合， 是由HDAC抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑組成的組合，或是由HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑組成的組合。
15.權利要求12-14中任一項的試劑盒，其中所述HDAC抑制劑是VPA，butyrate或TSA；所述 GSK3-beta 抑制劑是 CHIR99021，BI0 或 GeneID 22416 的 wnt3a 編碼的 Wnt3a 蛋白；所述TGF-beta抑制劑是616452或SB431542 ；所述H3K4去甲基化抑制劑是tranycypromine ■ phenelzine，胃中 VPA, CHIR99021,616452, tranycypromine, burytrate, TSA, SB431542, BIO和phenelzine的結構式如權利要求3中所示。
16.權利要求12的試劑盒，其中0ct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。
17.權利要求4-11任一項的方法或權利要求12-16任一項的試劑盒製備的多潛能幹細胞。
全文摘要
本發明提供了一種製備誘導多潛能幹細胞的方法。在體細胞中加入4個小分子化合物的組合(HDAC抑制劑，GSK3-beta抑制劑，TGF-beta抑制劑和H3K4去甲基化抑制劑)或其中至少兩個小分子化合物的組合(例如GSK3-beta抑制劑和TGF-beta抑制劑)，可在只導入一個轉錄因子(Oct4)的情況下，誘導產生誘導多潛能幹細胞(iPS細胞)。
文檔編號C12N5/074GK102260646SQ20101029698
公開日2011年11月30日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年5月26日
發明者尹曉磊, 張薔, 時豔, 李豔琴, 趙揚, 鄧宏魁 申請人:北京大學, 北京瑞普晨創科技有限公司