細胞分離器及其製作方法

2023-06-04 17:33:11

專利名稱:細胞分離器及其製作方法
本發明涉及一種能由其它類型細胞中分離特定細胞的細胞分離器及其製作方法。
為了臨床試驗、免疫診斷及免疫治療，常常要從含有各種類型之細胞混合物中分離某種特定類型的細胞。
然而，要從淋巴細胞中分離T細胞、B細胞、k細胞或Nk細胞時，至今尚未找到不改變細胞群體而分離出所要之細胞的方法。
日本專利公開204454(82)和140886(81)號公開了一種使用有機高分子化合物來分離和回收T細胞的方法，更具體地說，其中T細胞是使用一種顆粒狀的、有酸性功能團如磺酸基、羧酸基、膦酸基及酚基團的乙烯、丙烯、氯乙烯、醋酸乙烯、苯乙烯、二乙烯苯、丙烯腈、甲基異丁烯酸的聚合物或共聚物分離的。然而，使用這種方法時，剩餘的單體可對細胞產生細胞毒性作用。此外，由於顆粒的平均直徑小，柱子便易於堵塞。
將交聯的葡聚糖，即Sephadex 10(為Pharmacia公司之產品的商品名)用作細胞分離器的方法是已知的。在該方法中，大的和粘附的細胞如巨噬細胞和輔助細胞可被粘附到交聯葡聚糖上而得以被分離，T細胞和B細胞則通過葡聚糖柱被洗脫。然而，這種方法中卻是使T細胞粘附，而非粘附的輔助細胞則通過交聯葡聚糖。因此，便不能得到完整的T細胞群體。
使用尼龍棉作細胞分離器的方法也是公知的富集T細胞的細胞分離方法。然而，用這種方法雖然可以得到比較高純度的T細胞，但卻改變了T細胞的細胞群體。此外，其分離能力和分離範型(圖形)將隨著尼龍棉的特定種類、散開尼龍棉的方式、裝填尼龍棉的方法以及洗脫尼龍棉的方法的不同而改變。
因此，有必要提供一種能高選擇性地、但不改變細胞群體的分離細胞的細胞分離器。
本發明的目的在於提供一種具有高選擇性和重現性的、又不改變細胞群體的分離特定細胞的細胞分離器。
本發明的另一個目的是提供一種製作細胞分離器的方法。
本發明的再一個目的是提供一種分離細胞的裝置，用這種裝置可使細胞更易於分離，並且有高選擇性和重現性。
本發明提供了一種包括含羥基磷灰石之纖維的纖維狀細胞分離器。
可按本發明的方法製作纖維狀細胞分離器，其包括將含羥基磷灰石和粘合劑的水成懸液紡成纖維，並在一移動的表面上收集纖維以製得纖維狀羥基磷灰石。
本發明還提供了一種分離細胞的裝置，其包括一個柱子以及其中所裝有的本發明之纖維狀細胞分離器。
本發明的細胞分離器對於回收T細胞和去除免疫抑制細胞，例如抑制性T細胞是特別有效的。使用本發明之細胞分離器可高選擇性地回收T細胞而不改變細胞群體。此外，由於本發明的細胞分離器可有效地粘附抑制性免疫細胞如抑制性T細胞，故該細胞分離器亦可用於免疫治療。
圖1圖解說明了製備本發明之細胞分離器的方法。
圖2顯示用於本發明之細胞分離器的具體裝置剖面示意圖。
如上所述，本發明的細胞分離器包括含羥基磷灰石之纖維的纖維狀材料。在纖維中羥基磷灰石的含量較好是佔25%(重量)，最好是佔50%(重量)。由分離的選擇性來看，構成纖維狀材料的纖維最好主要由羥基磷灰石構成。然而應指出的是，如果纖維主要由羥基磷灰石組成，則其強度就會降低。為此，可在纖維內加入某種加固材料，如磷酸鈣基化合物和水玻璃，以增加纖維的強度。所用加固材料中，優選的是磷酸鈣基化合物，纖維中所用加固材料的量一般不超過25%(重量)。細胞分離器亦可含有水份。細胞分離器內之含水量一般為少於50%。優選的羥基磷灰石是Ca5(PO4)3(OH)。其中Ca/P之摩爾比為1.4至1.8。
構成本發明之細胞分離器的纖維之直徑不受限制，但一般為1～100微米。本發明之纖維狀細胞分離器的重量也不限，但一般是5克/米2～500克/米2。
本發明的纖維狀細胞分離器可用一種特殊粘合劑經溶液紡絲之方法製成。所用粘合劑最好是水溶性的。為滿足要求最好選用有機大分子材料。用作粘合劑最好選用含-OH、-COOH和-CONH2等功能團的水溶性線形大分子化合物。
優選的用作粘合劑的水溶性大分子化合物有聚乙烯醇、聚羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、膠原、支鏈澱粉(pullulan)和幾丁質、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚衣康酸、聚環氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞甲基醚、黃嘌呤膠(Xanthine gum)和瓜耳膠(guar gum)。其中最好的是支鏈澱粉。所用大分子化合物的分子量一般可在20000～2000000，最好是50000～1000000。這些大分子化合物可單獨使用或結合使用。
用作本製作工藝之原料的羥基磷灰石最好是呈超細顆粒形式的。超細顆粒可以是棒狀的，直徑最好為5毫微米至1微米。這種羥基磷灰石可用已知的慣用方法製成，例如在含有鈣離子的鹼性溶液(PH7～11)中加入磷酸水溶液而製得。
在生產本發明之纖維狀細胞分離器的方法中，是將一種含上述粘合劑和羥基磷灰石的水成懸浮液用作原料。水成懸浮液可含10～90%(重量)、較好是50～70%(重量)、最好是60～65%(重量)的水;含5～70%(重量)、更好是15～30%(重量)、最好是15～20%(重量)的羥基磷灰石;以及含5～40%(重量)、更好是15～30%(重量)、最好是20～25%(重量)的粘合劑。如果羥基磷灰石含量少於5%(重量)則所生產的纖維狀材料的強度就小，反之如果羥基磷灰石的含量大於70%(重量)則水成懸浮液的粘度就會變得過高。
為增加懸浮液的流動性以改善羥基磷灰石的分散性，可根據需要在懸浮液內加入碳酸基表面活性劑、增塑劑和/或軟化劑，如甘油、山梨醇、甘露糖醇、1，2-亞乙基二醇和聚丙二醇的多羥基化合物。也可以加入一種消泡劑，該試劑的加入量一般為0.01～5%(重量)。當使用上述加固材料時，可將加固材料分散於懸浮液中。但必須注意的是，如果加固材料是Ca3(PO4)2，則其可用下述的步驟製成。
水成懸浮液可於大約20～70℃的溫度下製備。
使用上述水成懸浮液作原料製備本發明之纖維狀細胞分離器的方法實例，將參照如下。
水成懸浮液通過供料口1進入儲罐2。之後懸浮液再進入紡絲噴嘴5並用以發動機3帶動的齒輪泵4從噴嘴將其噴出。由鼓風機6將空氣送到空氣噴嘴7並從空氣噴嘴7噴出，該空氣噴嘴繞於紡絲噴嘴5的外周。空氣流速可在大約5～1000米/秒之間，空氣溫度可為大約20～60℃。可以裝配許多紡絲和空氣噴嘴，而空氣噴嘴則可排列成行或成環狀。在同時噴射水成懸浮液及空氣時，水成懸浮液便紡成細纖維束8。可以藉助調節空氣流速將纖維直徑控制在大約1～30微米內，最好是大約1～10微米內。使用較高的空氣流速，則纖維的直徑便會更小。當空氣流速為1000米/秒時，所得纖維的直徑即約為1微米。當空氣流速為300米/秒和30米/秒時，則所得到的纖維直徑分別為大約3～5微米和20微米。
之後將如此製得的細纖維束8用加熱器9加熱乾燥。加熱器可以是紅外加熱器、遠紅外加熱器或微波加熱器。用加熱器9將纖維乾燥並固化後，應使其中含水量達到大約10%(重量)或更少些，最好是7%(重量)或更少些。如果幹燥程度不夠，便不能製得由細纖維構成的纖維狀材料。加熱溫度的改變決定於紡絲噴嘴5噴出之材料量、空氣射流的溫度以及空氣射流的量。一般說來，加熱器9的溫度可在大約200～500℃之範圍內(纖維溫度為大約80～150℃)。如果加熱溫度太高，則可導致粘合劑分解。
之後再以相互交叉的方式將如此乾燥後的纖維滴落在移動的收集裝置11上，從而得到纖維狀材料。收集裝置11可以是一種金屬絲筒或金屬絲網帶。最好使用以相反方向旋轉的兩個金屬網筒。如果纖維滴落在兩個筒的相接部分，則可製得一種呈盤繞狀的纖維材料，其中交叉的纖維是三維排列的，即一種呈棉花或脫脂棉形式的纖維材料。如果纖維是落在園筒接觸部分以外的其它部位，則得到一種平面纖維材料，其中交叉纖維是按二維排列的，即一種無紡織物形成的纖維材料。一種粗紗形式的纖維材料可用排成環形的許多紡絲噴嘴製得。控制收集裝置的移動速度可以得到5克/米2～500克/米2的纖維材料。
這樣製得的纖維材料可以繞在卷線軸13上。
最好將這樣製得的、其纖維是以粘合劑相互粘合的纖維材料經燒結以除去粘合劑。燒結溫度可在350～1350℃之間，較好是大約400～1200℃，最好是大約650～1100℃進行。如果燒結是在高於1350℃的溫度下進行的，則羥基磷灰石分子上的羥基基團將會分解而降低細胞分離器的選擇性。如果燒結是在1100～1300℃進行，則生成Ca3(PO4)2，這樣就可以改善纖維的強度。
對本發明的纖維狀細胞分離器的改變可包括將其與透明質酸、硫酸軟骨素、幾丁質衍生物、纖粘連蛋白(fibronectin)，骨粘連蛋白(osteonectin)或粘多糖(mucopotysaccharide)或其衍生物相附著以改變羥基磷灰石表面的物理化學性質和免疫學性質。這樣即可以有效地改變細胞分離器的分離性質，得到一個尖銳的洗脫圖形，或控制分離譜。此外，可以選擇性地收集到細胞的某一特殊亞群。
一種使用本發明之細胞分離器分離細胞的裝置的優選方案，可參照圖2說明如下。該裝置包括柱21及裝於其中的纖維狀羥基磷灰石22。使用這種簡單結構的裝置能夠滿意地進行細胞分離。然而，如果羥基磷灰石顆粒與纖維狀羥基磷灰石一起使用，則細胞分離效果會大大改善。為此，在圖2所示的優選方案中，裝於柱21內之羥基磷灰石顆粒是裝在纖維狀羥基磷灰石下面的。羥基磷灰石顆粒的平均直徑一般為1微米～2000微米，最好是50～2000微米。燒結羥基磷灰石顆粒最好在600～1350℃的溫度下進行。同時優選其中Ca/P摩爾比為1.4～1.8的羥基磷灰石。為防止顆粒23漏出柱21，須在羥基磷灰石顆粒23下面的柱底部放一濾層24。濾層24可以是一般常用的塑料、玻璃或陶瓷的纖維狀材料的多孔體。羥基磷灰石顆粒也可以置於纖維狀磷灰石22的上面。
將含有各種類型細胞的血液樣品或細胞懸浮液從柱頂加入以進行細胞分離。
使用上述本發明的裝置，細胞可被分離而對其沒有免疫學刺激作用，且可有高的靈敏度。分離方法非常簡單，並可減少分離細胞所需的時間。一般只有用常規方法的十分之一時間。可以使用本發明的裝置收集T細胞而基本上沒有巨噬細胞汙染。此外還可使單核細胞汙染降到很小的程度。
再者，本發明的裝置還可用於去除免疫抑制細胞，如抑制性T細胞，這樣便可使用本裝置進行免疫治療。由體內除去免疫抑制細胞，可使病人的免疫能力得以恢復。正如下面的實施例中所描述的，可通過一個可彎曲的管子使裝置直接與血管接觸，用以除去免疫抑制細胞。
下面給出本發明之優選的實施例，所有實施例均旨在闡明本發明，而不應理解為對本發明的限定。
實施例1將含有9%(重量)平均分子量為200000的支鏈澱粉粉末、42%(重量)的羥基磷灰石顆粒(顆粒直徑為5～80毫微米)、1%(重量)的分散劑(碳酸基表面活性劑)和48%(重量)的水的懸浮液於室溫下劇烈攪拌，以使支鏈澱粉均勻地分散於水系中。之後消除掉水懸液的泡沫。使用這種懸浮液作原料，並用圖1所示的設備製備平均直徑為10～15微米的纖維狀羥基磷灰石(Ca/p比為1.66)。然後將纖維狀羥基磷灰石於1100℃燒結。
在內體積為10毫升的柱中裝入0.02克玻璃棉，使所裝玻璃棉體積為0.8毫升。在玻璃棉濾層上再裝入依上述方法製得的0.7克纖維狀羥基磷灰石(體積為1.5毫升)，由此即製成用於細胞分離的裝置。
首先用生理鹽水、之後用37℃的培養基RPMI-1640，最後用含有10%(重量)胎牛血清的RPMI-1640洗柱。
預先用常規的Ficoll-Isopaque比重離心方法(Ficoll-Isopaque specific gravity centrifugation method)由人的外周血中分離淋巴細胞。之後將細胞懸浮於含10%(重量)胎牛血清的RPMI-1640培養基中，細胞群體密度為1×108細胞/毫升。取其中0.4毫升加於柱頂，使之滲透到纖維狀羥基磷灰石中，之後將柱於37℃保溫1小時。保溫後用RPMI-1640培養基洗脫細胞。
用血球計數器計數通過柱前、後的細胞群體，其回收率為58%。
實施例2在內體積為5毫升的柱中裝入0.02克玻璃棉，使所裝玻璃棉的體積為0.8毫升。在玻璃棉濾層上再裝入0.2克例1中製得的平均直徑為5～10微米的纖維狀羥基磷灰石(Ca/P比為1.66)，所裝體積為0.7毫升，以製成細胞分離裝置。
進行實施例1所述的同樣操作，所得細胞之回收率為82%。
實施例3在內體積為5毫升的柱中裝入0.02克玻璃棉，所裝體積為0.8毫升。在玻璃棉濾層上裝入0.15克如例1方法製得的平均直徑為5～10微米的纖維狀羥基磷灰石(Ca/P比為1.66)，其體積為0.5毫升，以製成細胞分離裝置。
進行如實施例1所述的同樣操作，所得細胞的回收率為74%。
實施例4在內體積為5毫升的柱中裝入0.02克玻璃棉，所裝體積為0.8毫升。在玻璃棉濾層上裝入0.35克於700℃燒結的、平均直徑為400～500微米的羥基磷灰石顆粒(Ca/P比為1.67)，所裝體積為0.4毫升。在羥基磷灰石顆粒上再裝入0.15克於1000℃燒結的、平均直徑為5～10微米的纖維狀羥基磷灰石(Ca/P比為1.66)至所裝體積為0.4毫升，製成如圖2所示的細胞分離裝置。
進行實施例1所述的同樣操作，所得細胞的回收率為80%。
實施例5在內體積為5毫升的柱中裝入0.02克玻璃棉，裝至體積為0.8毫升。在玻璃棉濾層上裝入0.35克於700℃燒結的、平均直徑為400～500微米的羥基磷灰石顆粒(Ca/P比為1.67)，所裝之體積為0.4毫升。再在羥基磷灰石顆粒上裝入0.1克於1000℃燒結的、平均直徑為5～10微米的纖維狀羥基磷灰石(Ca/P比為1.66)，其所裝體積為0.4毫升，即可製成如圖2所示的細胞分離裝置。
進行實施例1所述同樣操作，所得細胞的回收率為84%。
比較例1在內體積為5毫升的柱中裝入0.02克玻璃棉，所裝體積為0.8毫升。之後裝入0.8克於700℃燒結的、平均直徑為400～500微米的羥基磷灰石顆粒(Ca/P比為1.67)，所裝體積為0.8毫升，由此製成細胞分離裝置。
比較例2製作如比較例1所述之同樣的裝置，不同的是用尼龍棉代替羥基磷灰石顆粒。
試驗使用實施例1～5及比較例1和2的細胞分離裝置，在洗脫液通過柱之後計數洗出的T細胞、B細胞和單核細胞。計數是用常規方法，使用螢光標記的抗體Leu1、Leu2或LeuM3(由日本大阪的Fujisawa醫藥公司購得)標記細胞，並用螢光活化的細胞分析器完成的。結果示於表1，其中列出了細胞群體中各種細胞的百分率。
表1實施例 回收率 T細胞 B細胞 單核細胞% (Leu1) (Leu12) (Leu M3)1 75 97 1.3 0.82 82 95 1.0 0.53 74 96 1.1 1.14 80 97 0.8 0.85 84 95 2.7 0.8比較例1 85 94 3.5 2.3比較例2 37 90 5.0 4.8如表1所示，本發明各實施例中被汙染之B細胞和單核細胞的百分率均小於比較例的汙染率。可見，本發明的細胞分離器顯然比通常的細胞分離器具有更高的選擇性。
實施例6～8在內體積為1毫升的結核菌素注射器內裝入0.02克玻璃棉，所裝體積為0.02毫升。在玻璃棉濾層上依前述次序分別裝入0.4克/0.4毫升直徑為400～600微米的羥基磷灰石顆粒和0.1克/0.4毫升的纖維狀羥基磷灰石(直徑為5～20微米)，製成如圖2所示的細胞分離裝置。
從正常人的外周血中用Ficoll-Isopaque比重離心方法分離淋巴細胞，取2×107個細胞懸浮於0.2毫升含10%(重量)胎牛血清的RPMI-1640培養基中。
將細胞懸液加於柱頂端，並使之滲入柱內之填料中。之後加5毫升RPMI-1640培養基通過注射器以洗脫細胞。使用螢光標記的抗體Leu2和Leu15(購自日本大阪Fujisawa醫藥公司)對洗脫之細胞群體進行雙色染色，並用螢光活化的細胞分析器進行計數。
實施例9重複例6～8的同樣實驗程序，不同的是所用樣品為自聽神經瘤患者之外周血分離的淋巴細胞。
實施例10重複實施例6～8的同樣實驗程序，不同的是自上領腫瘤患者的外周血中製備樣品淋巴細胞。
實施例11重複實施例6～8的實驗程序，不同的是自結腸癌患者的外周血中製備樣品淋巴細胞。
實施例12用生理鹽水將採自正常人的外周血(內含肝素)稀釋兩倍，取其5毫升細胞懸液通過實施例6～7所述的注射器。之後用在Tris緩衝液內製成的氯化銨溶液溶解紅細胞以分離淋巴細胞，並按實施例6～8所述的方法檢測淋巴細胞的細胞群體。
試驗結果表2中顯示細胞群體通過柱前、後其中免疫抑制細胞的百分率。
表2實施例 過柱前 過柱後6 1.33 0.777 5.12 1.268 1.41 0.549 15.05 0.1810 1.91 0.8111 7.97 2.7312 7.49 0.26由表2可明顯看出，當淋巴細胞通過本發明的細胞分離裝置之後，其中的很大一部分免疫抑制細胞被除去。
實施例13用WalKer 256細胞(一種大鼠腫瘤細胞)接種10隻8周令的大鼠。接種後3天由大鼠的右股部靜脈採血，在其通過如實施例6～8所述的注射器後重新注入大鼠的左股部靜脈內。持續循環1小時。操作中加肝素用以防止血液凝固。循環4天後，使用羊紅細胞作遲發性足趾反應(delayed footpad reaction)試驗。另外還記錄大鼠的存活期。結果示於表3中。
表3免疫功能 存活期(天數)實驗組 正常 22天對照組 減弱 15天由表3所示的結果可明顯看出血細胞經通過本發明的細胞分離裝置後再進入循環，則動物的免疫功能保持正常且存活期延長1.5倍。可見，本發明的細胞分離裝置對於除去免疫抑制細胞也是有效的。
權利要求
1.一種由含羥基磷灰石的纖維構成的纖維狀細胞分離器。
2.根據權利要求
1的細胞分離器，其中所有的羥基磷灰石基本上都是Ca5(PO4)3OH。
3.根據權利要求
2的細胞分離器，其中纖維的平均直徑是1微米至100微米。
4.根據權利要求
2的細胞分離器，其中Ca/P比是1.4至1.8。
5.製作權利要求
1之細胞分離器的方法，其包括以下步驟將含有羥基磷灰石和粘合劑的水成懸浮液紡成纖維，並在移動的表面上收集纖維以製得纖維狀細胞器。
6.根據權利要求
5的方法、其還包括於收集纖維之前經加熱乾燥纖維的步驟。
7.根據權利要求
6的方法，其還包括燒結所得纖維的步驟。
8.根據權利要求
5的方法，其中水成懸浮液含有10～90%(重量)的水、5～70%(重量)的羥基磷灰石和5～40%(重量)的粘合劑。
9.根據權利要求
8的方法，其中水成懸浮液含有50～70%(重量)的水、15～30%(重量)的羥基磷灰石和15～30%(重量)的粘合劑。
10.根據權利要求
9的方法，其中水成懸浮液含有60～65%(重量)的水、15～20%(重量)的羥基磷灰石和20～25%(重量)的粘合劑。
11.根據權利要求
5的方法，其中粘合劑選自於聚乙烯醇、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、膠原、支鏈澱粉和幾丁質、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚衣康酸、聚環氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞甲基醚、黃嘌呤膠及瓜耳膠。
12.根據權利要求
11的方法，其中粘合劑是幾丁質。
13.根據權利要求
11的方法，其中粘合劑的分子量為20000至2000000。
14.根據權利要求
13的方法，其中粘合劑的分子量為50000至1000000。
15.根據權利要求
7的方法，其中燒結是在350至1350℃的溫度下進行的。
16.根據權利要求
15的方法，其中燒結是在400至1200℃的溫度下進行的。
17.一種包括一個柱和權利要求
1之纖維性細胞分離器的用於分離細胞的裝置。
18.根據權利要求
18的裝置，其還包括置於柱之底部的濾層，含羥基磷灰石的纖維置於濾層之上。
19.根據權利要求
18的裝置，其還包括裝於柱內之羥基磷灰石顆粒。
20.根據權利要求
19的裝置，羥基磷灰石顆粒是裝在濾層之上並在纖維狀羥基磷灰石的下面。
21.根據權利要求
19的裝置，其中羥基磷灰石顆粒的直徑為1至2000微米。
22.根據權利要求
21的裝置，其中羥基磷灰石顆粒的直徑為50至2000微米。
23.根據權利要求
20的裝置，其中羥基磷灰石顆粒是於500至1400℃的溫度下燒結的。
24.一種除去免疫抑制性淋巴細胞和/或產生免疫抑制因子之細胞的方法，其包括使含有免疫抑制性淋巴細胞和/或產生免疫抑制因子之細胞的細胞懸液通過權利要求
17至23之一的裝置，從而使免疫抑制性淋巴細胞和/或產生免疫抑制因子之細胞吸附於裝在柱內的纖維狀細胞分離器上。
專利摘要
一種可分離細胞，特別是分離淋巴細胞的細胞分離器，其具有高度選擇性和高分離效率，而又不會改變細胞的細胞群體比率。該細胞分離器包括含羥基磷灰石之纖維的纖維狀材料。
文檔編號C12M1/12GK87102643SQ87102643
公開日1987年12月30日 申請日期1987年3月22日
發明者鶴純明, 森省一, 小松紀子, 藤井茂夫 申請人:東亞燃料工業株式會社, 旭光學工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan