核苷氨基磷酸酯化合物及其醫藥組合物和用途的製作方法

2023-06-04 11:12:51 2

本發明屬於醫藥化學中的抗病毒研究領域，涉及一類新型的核苷氨基磷酸酯化合物或立體異構體、其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑合物或結晶，及其在抗病毒感染方面，特別是作為治療C型肝炎的應用。

背景技術：

C型肝炎病毒(hcv)每年有3-4百萬新增的患者，世界衛生組織估計在全世界的感染者已超過2億，在中國超過1000萬病人，hcv屬於黃病毒科肝病毒屬病毒。長期C型肝炎病毒感染輕至炎症，重至肝硬化、肝癌。且C肝肝硬化失代償期時，可以出現各種併發症，如腹水腹腔感染，上消化道出血，肝性腦病，肝腎症候群，肝衰竭等表現。最初治療hcv感染的方法是幹擾素以及幹擾素和利巴韋林聯合療法，僅50％的治療者對該方法有反應，且幹擾素具有明顯的副作用，例如流行性感冒樣症狀、體重減低以及疲乏無力，而幹擾素和利巴韋林聯合療法則產生相當大的副作用，包括溶血、貧血症和疲乏等。

近幾年美國fda批准了多個hcv藥物，包括蛋白酶抑制劑、核苷類和非核苷類聚合酶抑制劑以及ns5a抑制劑等。fda批准的蛋白酶抑制劑類藥物有三個：vx-950(telaprevir),sch-503034(boceprevir)和tmc435(simeprevir)，蛋白酶抑制劑的缺點是易產生突變、毒性大、生物利用度差，對個別的基因類型有效。telaprevir作為第一代的蛋白酶抑制劑已經退出市場。高活性和廣譜的第二代和第三代蛋白酶抑制劑主要用作和其他C肝藥物的聯合用藥的組分之一。

C肝的聚合酶抑制劑通常分為核苷類和非核苷類兩種。目前，臨床上僅有索菲布韋一個核苷類C肝藥物被fda批准上市，sofosbuvir與其它抗hcv在研藥物聯用的臨床試驗也表現出積極效果。但是，由於sofosbuvir在體內有近90％代謝為沒有活性的代謝產物,需要用較大的給藥劑量，C肝患者需要接受長期治療，隨之帶來的病毒耐藥以及長期安全性問題不容忽視，因此，開發新的生物利用度高及更長的半衰期，肝臟選擇性好，藥效高的hcv感染治療藥物仍是臨床的迫切需求。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種全新的核苷氨基磷酸酯化合物及其醫藥組合物和用途。

本發明的技術解決方案是：

一種核苷氨基磷酸酯化合物，其特徵是：核苷以磷氧鍵連接磷酸，結構如通式a、b和c所描述的核苷氨基磷酸酯化合物、其立體異構體、其藥學可接受的鹽、水合物、溶劑化物或結晶；

其中，

r1為c1-6烷基、c3-6環烷基、苄基、氘代的c1-6烷基、氘代的c3-6環烷基或氘代的苄基：例如，r1為甲基、乙基、異丙基或異丁基，或者為氘代的甲基、乙基、異丙基或異丁基。優選地，r1為異丙基或氘代異丙基(如(cd3)2ch-、(cd3)2cd-或者(ch3)2cd-)；

r2為任意取代的苯基、聯苯基、雜芳基或萘基，或者氘代的任意取代苯基、聯苯基、雜芳基或萘基，其取代基可以是滷素(氟、氯、溴、碘)、疊氮、氰基、炔基、c1-4烷基、c3-4環烷基或c1-4烷氧基。優選的，r2為苯基、聯苯基、4-環丙基苯基或氘代苯基。

r3選自各種天然或非天然胺基酸醯基、羧酸醯基、多肽醯基或者氫。例如，r3為氫、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、丙氨醯基、甘氨醯基、脯氨醯基、賴氨醯基、苯丙氨醯基、亮氨醯基、異亮氨醯基、纈氨醯基、色氨醯基、酪胺醯基、天冬氨醯基、天冬醯胺醯基、穀氨醯基、穀氨醯胺醯基、甲硫氨醯基、蘇氨醯基、組胺醯基、絲氨醯基、半胱氨醯基、精氨醯基(等d-或l-型胺基酸)或β-丙氨醯基。

r4、r5、r6、r7、r8和r9獨立選自h或者氘。

採用實施例中描述的合成方法，以下的化合物均可以方便地得到:

述的核苷氨基磷酸酯化合物，與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑以及納米製劑，以適合於經口或胃腸外給藥；給藥方法包括，但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內和經口途徑。

一種包含所述的核苷氨基磷酸酯化合物的醫藥組合物。

所述醫藥組合物，還含有獨立地選自以下藥物的其他治療劑：利巴韋林(ribavirin)、幹擾素、C肝ns3蛋白酶抑制劑、hcv逆轉錄酶ns5b非核苷抑制劑、hcv逆轉錄酶ns5b核苷抑制劑、ns5a抑制劑以及ns5a抑制劑的增效劑、進入抑制劑、環孢素免疫抑制劑、ns4a拮抗劑、ns4b抑制劑、親環素抑制劑。

一種所述的核苷氨基磷酸酯化合物及其藥用組合物在製備抗黃病毒科病毒的藥物中的應用，其特徵是：所述黃病毒科病毒是C型肝炎病毒。

本發明提供了上述核苷氨基磷酸酯化合物的製備方法如下式所示：

在鹼性條件下，苯酚或取代苯酚(1)與三氯氧磷後，加入胺基酸酯鹽酸鹽(2)反應，再加入五氟苯酚(3)反應得到化合物(4)和(5)；

在低溫條件下，化合物(4)或(5)與化合物(6)反應，分別得到化合物(7)或(8),然後，在縮合劑作用下分別與boc保護的胺基酸反應，然後在酸性條件下脫去保護基boc，或直接與羧酸反應得到(9)或(10)

其中，化合物中的r2、r3如式a、b和c化合物中所定義，縮合劑可以為常用的n，n'-二環己基碳二亞胺(dcc)、羰基二咪唑(cdi)、n，n'-二異丙基碳二亞胺(dic)、n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edchcl)、o-(7-氮苯並三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、苯並三氮唑-n，n，n'，n-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，boc基團為保護氨基的叔丁基氧羰基保護基。

本發明描述的核苷氨基磷酸酯化合物，其立體異構體、鹽、水合物、溶劑合物或結晶與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內和經口途徑。所述製劑可以通過任何途徑施用，例如通過輸注或推注，通過經上皮或皮膚黏膜(例如口腔黏膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。經口施用製劑的實例包括固體或液體劑型，具體而言，包括片劑、丸劑、粒劑、粉劑、膠囊劑、糖漿、乳劑、混懸劑等。所述製劑可通過本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發明提供的核苷氨基磷酸酯化合物單獨，或者與其他hcv治療劑如ns5a抑制劑或者蛋白酶抑制劑共同構成藥物組合物，用於治療黃病毒科病毒感染的病患。包括向所述患者施用通式a、b和c的化合物、其立體異構體、鹽、水合物、溶劑合物或結晶或者包含通式a、b和c的化合物、其立體異構體、鹽、水合物、溶劑合物或結晶的藥物組合物，以有效治療C型肝炎。在一個實施方案中，本發明提供用於治療和/或預防rna病毒例如黃病毒科病毒感染的方法，包括向需要此治療的病患給予本發明的化合物、其立體異構體、鹽、水合物、溶劑合物或結晶或其藥物組合物。在另一個實施方案中，本發明提供抑制rna病毒例如黃病毒科病毒感染的方法，包括使所述病毒與治療有效量的本發明的化合物、其立體異構體、鹽、水合物、溶劑合物或結晶或其藥物組合物接觸。

"黃病毒科病毒"是指黃病毒科的任何病毒，包括感染人和非人動物的那些病毒，例如黃病毒、鼠疫病毒和C型肝炎病毒，登革熱病毒。本發明的化合物和組合物可特別用於治療或預防性治療hcv和登革熱病毒。

本發明提供的核苷氨基磷酸酯化合物、其立體異構體、鹽、水合物、溶劑合物、結晶或組合物在預防或治療病毒性感染的應用，尤其是在預防或治療黃病毒感染疾病的應用，以及在製備預防和/或治療病毒性感染疾病的藥物中的應用，特別是在製備預防和/或治療hcv病毒感染，如hcv病毒性肝炎疾病的藥物中的應用。該類疾病的實例有急性C型肝炎、慢性C型肝炎以及C型肝炎和B型肝炎或丁型肝炎的混合感染。

術語定義

除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。

術語「立體異構體」是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體。包括順反異構體、對映異構體和構象異構體。所有立體異構體均屬於本發明的範圍。本發明的化合物的單獨立體異構體可基本上不含其它異構體或可以混合成例如外消旋體，或者與所有其它的立體異構體混合。

術語「鹽」是指本發明所述的化合物與酸形成的藥學上可接受的鹽，所述的酸可選自：磷酸、硫酸、鹽酸、氫溴酸、檸檬酸、馬來酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富馬酸、醋酸、乳酸、硝酸、磺酸、對甲苯磺酸、蘋果酸、甲烷磺酸或其類似物。

術語「溶劑化物」是指通過與溶劑分子配位形成固態或液態的配合物的本發明化合物的形式。水合物是溶劑合物的特殊形式，其中與水發生配位。在本發明範圍內，溶劑化物優選是水合物。

術語「結晶」是指本發明所述的化合物形成的各種固體形態，包括晶型、無定形。

術語「烷基」是指直鏈、支鏈或環狀的飽和烴基，優選6個碳原子以下的烴基。烷基的實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、環丁基、正戊基、異戊基、新戊基、環己基、正己基、異己基、2,2,-甲基丁基和2,3-二甲基丁基。術語「c1-6烷基」是指含有1-6個碳原子的直鏈、支鏈或環狀的飽和烴基。術語「c1-4烷基」是指含有1-4個碳原子的直鏈、支鏈或環狀的飽和烴基。

術語「滷素」是指氟、氯、溴、碘。

術語「雜環基」是指至少含有一個雜原子的環狀基團，其中雜原子為n、o或s，包括單雜環基和稠雜環基。其中單雜環基包括但不限於呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、咪唑、1,2,3-三氮唑、1,2,4-三氮唑、1,2,3-噻二唑，噁唑、1,2,4-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、噠嗪、吡嗪、四氫呋喃、四氫吡咯、哌啶、哌嗪、嗎啉、異噁唑啉等。稠雜環基包括但不限於喹啉、異喹啉、吲哚、苯並呋喃、苯並噻吩、嘌呤、吖啶、咔唑、芴、色烯酮、芴酮、喹喔啉、3,4-二氫萘酮、二苯並呋喃、氫化二苯並呋喃、苯並噁唑基等。

氘是氫的同位素，原子質量是後者的2倍，與碳的結合更強。氘化「和」氘「表示氫在指定位置被替換為氘。一個「氘化的取代基」是取代基，其中至少一個氫被以指定的百分比富集取代氘。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明作進一步詳細闡述，但本發明不限於這些實施例。本發明實施例中使用的試劑和原料均為商購所得。

實施例1

((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(i-01b)

步驟1.[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸異丙酯(5)和[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸異丙酯(6)

在反應瓶中加入二氯磷酸苯酯2(11.4克(95％)，51.4毫摩爾)，及d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽1(8.64克，51.4毫摩爾)，冷卻到-70℃，在1.5小時內滴加三乙胺(14.4毫升，103.4毫摩爾)的二氯甲烷(44毫升)溶液,加畢後，升至室溫，攪拌過夜後將反應混合物冷卻至0℃，在40分鐘內將五氟苯酚4(9.46克，51.4毫摩爾)和三乙胺(7.2毫升，51.4毫摩爾)的二氯甲烷(60ml)溶液滴加到上述溶液中，在0℃攪拌1小時，升至室溫，攪拌過夜後，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有機相，用無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱分離(0-30％乙酸乙酯/己烷)得13.9克白色固體，固體用10％用叔丁基甲基醚/己烷重結晶，得白色固體5(6.7克)，母液用矽膠柱分離(50％乙酸乙酯/己烷)得6(4.4克)和5(0.9克)，5和6純度均大於99％。

5：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.39–7.35(m,2h),7.34–7.21(m,3h),5.18–4.97(m,1h),4.28–4.09(m,1h),3.97–3.92(m,1h),1.46(d,j＝7.0hz,3h),1.26(d,j＝5.9hz,3h),1.25(d,j＝5.9hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.85.

6：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.37–7.33(m,2h),7.32–7.19(m,3h),5.20–4.95(m,1h),4.18–4.01(m,1h),3.96–3.90(m,1h),1.48(d,j＝7.0hz,3h),1.25(d,j＝5.9hz,3h),1.24(d,j＝5.9hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.55.

步驟2.i-01b的合成

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑5(725mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物i-01b(296mg),收率56％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.74(s,1h),7.36–7.31(m,3h),7.25-7.22(m,2h),7.20-7.15(m,1h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.58(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.95(m,1h),4.51-4.46(m,2h),4.40–4.34(m,1h),4.27(brs,1h),4.13–4.08(m,1h),3.93–3.78(m,2h),1.37-1.28(m,6h),1.23(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.65；lcms-esi+(m/z):530.2(m+h)+.

實施例2

((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(i-01c)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑6(725mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物i-01c(308mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.76(s,1h),7.38–7.30(m,3h),7.26-7.22(m,2h),7.20-7.16(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.57(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.95(m,1h),4.50-4.46(m,2h),4.40–4.33(m,1h),4.28(brs,1h),4.13–4.08(m,1h),3.92–3.78(m,2h),1.37-1.28(m,6h),1.22(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.60；lcms-esi+(m/z):530.2(m+h)+.

實施例3

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-丙氨酸酯(i-02b)

步驟1.i-02』b的合成

在反應管中將boc-ala-oh,8(43mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-01b(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-02』b,65.1mg，收率62％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.66(d,j＝8.2hz,1h),7.40–7.36(m,2h),7.29-7.27(m,2h),7.22-7.18(m,1h),6.15(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.1hz,1h),5.33–5.41(m,1h),4.98–4.93(m,1h),4.53-4.50(m,1h),4.35–4.27(m,2h),4.22-4.17(m,1h),3.93–3.88(m,1h),1.44(s,9h),1.40-1.31(m,9h),1.21(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.60；lcms-esi+(m/z):701.3[m+1]+。

步驟2.i-02b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-02』b(65mg,93umol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-02b,49.1mg，收率88％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.52(d,j＝8.1hz,1h),7.40–7.37(m,2h),7.29-7.17(m,3h),6.11(d,j＝19.2hz,1h),5.63(d,j＝8.1hz,1h),5.43–5.39(m,1h),4.98–4.94(m,1h),4.53-4.50(m,2h),4.35–4.26(m,2h),3.93–3.88(m,1h),1.61(d,j＝4.3hz,3h),1.43-1.21(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.37；lcms-esi+(m/z):601.4[m+1]+。

實施例4

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((s)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-丙氨酸酯(i-02c)

步驟1.i-02』c的合成

在反應管中將boc-ala-oh,8(43mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-01c(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-02』c，66.9mg，收率63.7％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.65(d,j＝8.2hz,1h),7.42–7.33(m,2h),7.28-7.25(m,2h),7.21-7.18(m,1h),6.14(d,j＝19.2hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.43–5.33(m,1h),4.98–4.92(m,1h),4.54-4.50(m,1h),4.36–4.26(m,2h),4.23-4.17(m,1h),3.94–3.87(m,1h),1.44(s,9h),1.40-1.30(m,9h),1.21(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.55；lcms-esi+(m/z):701.3[m+1]+。

步驟2.i-02c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-02』c(65mg,93umol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-02c，48mg，收率86％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.53(d,j＝8.1hz,1h),7.43–7.37(m,2h),7.29-7.16(m,3h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.60(d,j＝8.1hz,1h),5.45–5.39(m,1h),4.98–4.93(m,1h),4.54-4.50(m,2h),4.33–4.26(m,2h),3.93–3.87(m,1h),1.60(d,j＝4.3hz,3h),1.43-1.20(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.31；lcms-esi+(m/z):601.4[m+1]+。

實施例5

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(i-05b)

步驟1.i-05』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-01b(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-05』b，70.3mg，收率64.4％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.68(d,j＝8.1hz,1h),7.40–7.36(m,2h),7.29-7.26(m,2h),7.20-7.17(m,1h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.1hz,1h),5.41–5.33(m,1h),4.98–4.93(m,1h),4.54-4.51(m,1h),4.37–4.25(m,2h),4.07-4.04(m,1h),3.93–3.89(m,1h),2.18–2.12(m,1h),1.44(s,9h),1.38-1.31(m,6h),1.21(d,j＝6.2hz,6h),0.99(d,j＝6.3hz,3h)0.98(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.74；lcms-esi+(m/z):729.4[m+1]+。

步驟2.i-05b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-05』b(70mg,96umol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-05b，53.8mg，收率89％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.42-7.38(m,2h),7.30-7.2(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.94，(m,1h)，4.54-4.47(m,2h),4.38–4.34(m,1h),4.15–4.12(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):629.3(m+h)+.

實施例6

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(i-05c)

步驟1.i-05』c的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-01c(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-05』c，65.5mg，收率60％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.65(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.35(m,2h),7.29-7.25(m,2h),7.22-7.17(m,1h),6.14(d,j＝19.2hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.43–5.35(m,1h),4.96–4.93(m,1h),4.52-4.50(m,1h),4.38–4.25(m,2h),4.08-4.05(m,1h),3.95–3.88(m,1h),2.19–2.12(m,1h),1.44(s,9h),1.39-1.31(m,6h),1.21(d,j＝6.2hz,6h),0.99(d,j＝6.2hz,3h)0.98(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.90；lcms-esi+(m/z):729.5[m+1]+。

步驟2.i-05c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-05』c(65mg,89umol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-05c，50.3mg，收率90％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(d,j＝8.0hz,1h),7.44-7.39(m,2h),7.31-7.21(m,3h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.69(d,j＝8.1hz,1h),5.45–5.36(m,1h),5.01-4.94，(m,1h)，4.53-4.47(m,2h),4.38–4.35(m,1h),4.16–4.12(m,1h),3.93–3.86(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.41-1.34(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.1hz,3h),1.14(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.98；lcms-esi+(m/z):629.2(m+h)+.

實施例7

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基異丁酸酯(i-22b)

在反應管中將異丁酸10(20mg,225μmol)與0.5ml1，4-二氧六環混合，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-01b(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體產物i-22b，46mg，收率51％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.41-7.36(m,2h),7.30-7.20(m,3h),6.15(d,j＝19.0hz,1h),5.71(d,j＝8.1hz,1h),5.47–5.35(m,1h),5.02-4.93(m,1h)，4.52-4.47(m,2h),4.16–4.12(m,1h),3.93–3.85(m,1h),2.45–2.35(m,1h),1.43(d,j＝19.0hz,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.16(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):600.3(m+h)+.

實施例8

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基異丁酸酯(i-22c)

在反應管中將異丁酸10(20mg,225μmol)與0.5ml1，4-二氧六環混合，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-01c(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體產物i-22c，50mg，收率55.4％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.60(d,j＝8.1hz,1h),7.43-7.37(m,2h),7.33-7.22(m,3h),6.11(d,j＝19.2hz,1h),5.70(d,j＝8.0hz,1h),5.48–5.36(m,1h),5.03-4.92(m,1h)，4.55-4.48(m,2h),4.16–4.13(m,1h),3.95–3.85(m,1h),2.47–2.35(m,1h),1.45(d,j＝19.2hz,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.18(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.11；lcms-esi+(m/z):600.4(m+h)+.

實施例9

((r)-([1,1』-聯苯]-4-基氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)d-丙氨酸異丙酯(i-23b)

步驟1((r)-([1,1』聯苯]-4-基氧基)(五氟苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(12)和((s)-([1,1』聯苯]-4-基氧基)(五氟苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(13)

在反應瓶中加入三氯氧磷(9克,58.7mmol),加二氯甲烷200ml,冷卻到-70℃，緩慢滴加對苯基苯酚(l0克,58.7mmol)和三乙胺(6克,58.7mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，滴加完畢，緩慢升至室溫，反應過夜。將上述混合液冷卻到0℃，加入d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(9克，53.1mmol)，冷卻到-70℃,滴加三乙胺(13.4克,130mmol)的二氯甲烷溶液60ml,加畢，升溫到0℃,反應3小時，將五氟苯酚(l0克,53mmol)和三乙胺(8克，77.6mmol)的二氯甲烷溶液100ml液體滴加到上述溶液中，在0℃攪拌1小時，升至室溫，攪拌過夜後，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有機相，用無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱分離(0-30％乙酸乙酯/己烷)得13.6克白色固體，固體用10％用叔丁基甲基醚/己烷重結晶，得白色固體12(5.3克)，母液用矽膠柱分離(50％乙酸乙酯/己烷)得13(3.7克)和12(0.8克)，12和13純度均大於99％。

12：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.78–7.70(m,4h),7.50–7.33(m,5h),5.16–4.97(m,1h),4.26–4.08(m,1h),3.97–3.93(m,1h),1.45(d,j＝7.0hz,3h),1.27(d,j＝5.9hz,3h),1.26(d,j＝5.9hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.65.

13：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.75–7.68(m,4h),7.48–7.32(m,5h),5.20–4.98(m,1h),4.22–4.05(m,1h),3.96–3.91(m,1h),1.47(d,j＝7.0hz,3h),1.26(d,j＝6.2hz,3h),1.25(d,j＝6.2hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.05.

步驟2.i-23b的合成

向10ml反應管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑12(846mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(150ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物i-23b(176mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.76–7.69(m,4h),7.51-7.39(m,6h),6.21(d,j＝19.2hz,1h),5.68(d,j＝8.1hz,1h),5.03–4.93(m,1h),4.56-4.53(m,1h),4.40–4.34(m,1h),4.13–4.09(m,1h),3.93–3.79(m,2h),1.38-1.28(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.85；lcms-esi+(m/z):606.3(m+h)+.

實施例10

((s)-([1,1』-聯苯]-4-基氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)d-丙氨酸異丙酯(i-23c)

向10ml反應管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑13(846mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(150ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物i-23c(158mg),收率52％)。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.77–7.69(m,4h),7.53-7.40(m,6h),6.18(d,j＝19.2hz,1h),5.66(d,j＝8.0hz,1h),5.04–4.95(m,1h),4.55-4.52(m,1h),4.41–4.34(m,1h),4.15–4.08(m,1h),3.94–3.79(m,2h),1.39-1.27(m,6h),1.24(d,j＝6.0hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.75；lcms-esi+(m/z):606.2(m+h)+.

實施例11

(2r,3r,4r,5r)-2-((((r)-([1,1』-聯苯基]-4-基氧基)(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷醯基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氫呋喃-3-基)l-丙氨酸酯(i-25b)

步驟1.i-25』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-23b(90.8mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-25』b，63.9mg，收率53％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.77–7.63(m,4h),7.56-7.31(m,6h),6.18(d,j＝19.4hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.38(m,1h),4.96–4.93(m,1h),4.56-4.52(m,1h),4.38–4.26(m,2h),4.09-4.04(m,1h),3.94–3.86(m,1h),2.19–2.11(m,1h),1.47(s,9h),1.39-1.31(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,6h),0.98(d,j＝6.3hz,3h)0.97(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.94；lcms-esi+(m/z):805.4[m+1]+。

步驟2.i-25b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-25』b(60mg,74μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-25b，44.3mg，收率85％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.80–7.65(m,4h),7.58-7.33(m,6h),6.17(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.0hz,1h),5.51–5.36(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.55-4.48(m,2h),4.39–4.36(m,1h),4.16–4.10(m,1h),3.90–3.83(m,1h),2.44–2.33(m,1h),1.42-1.35(m,6h),1.25(d,j＝6.2hz,3h),1.24(d,j＝6.0hz,3h),1.13(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.38；lcms-esi+(m/z):705.3(m+h)+.

實施例12

(2r,3r,4r,5r)-2-((((s)-([1,1』-聯苯基]-4-基氧基)(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷醯基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氫呋喃-3-基)l-丙氨酸酯(i-25c)

步驟1.i-25』c的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-23c(90.8mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-25』c，68.7mg，收率57％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.74–7.62(m,4h),7.55-7.30(m,6h),6.15(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.0hz,1h),5.43–5.36(m,1h),4.97–4.92(m,1h),4.54-4.50(m,1h),4.39–4.25(m,2h),4.08-4.02(m,1h),3.93–3.84(m,1h),2.20–2.10(m,1h),1.45(s,9h),1.38-1.30(m,6h),1.24(d,j＝6.0hz,6h),0.99(d,j＝6.0hz,3h)0.98(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.65；lcms-esi+(m/z):805.3[m+1]+。

步驟2.i-25c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-25』c(60mg,74μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-25c，41.8mg，收率80％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.78–7.62(m,4h),7.52-7.32(m,6h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.77(d,j＝8.0hz,1h),5.52–5.35(m,1h),5.05-4.94，(m,1h)，4.53-4.46(m,2h),4.37–4.32(m,1h),4.14–4.10(m,1h),3.92–3.82(m,1h),2.43–2.33(m,1h),1.41-1.34(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.0hz,3h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.18；lcms-esi+(m/z):705.2(m+h)+。

實施例13

((r)-(4-環丙基苯氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(i-27b)

步驟1.((r)-(4-環丙基苯氧基)(五氟苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(15)和((s)-(4-環丙基苯氧基)(五氟苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(16)

在反應瓶中加入三氯氧磷(9g,58.7mmol),加二氯甲烷200ml,冷卻到-70℃，緩慢滴加對環丙基苯酚(7.88g,58.7mmol)和三乙胺(6g,58.7mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，滴加完畢，緩慢升至室溫，反應過夜。將上述混合液冷卻到0℃，加入d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(9g，53.1mmol)，冷卻到-70℃,滴加三乙胺(13.4g,130mmol)的二氯甲烷溶液60ml,加畢，升溫到0℃,反應3小時，將五氟苯酚(l0g,53mmol)和三乙胺(8g，77.6mmol)的二氯甲烷溶液100ml液體滴加到上述溶液中，在0℃攪拌1小時，升至室溫，攪拌過夜後，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有機相，用無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱分離(0-30％乙酸乙酯/己烷)得11.2克白色固體，固體用10％用叔丁基甲基醚/己烷重結晶，得白色固體15(3.8g)，母液用矽膠柱分離(50％乙酸乙酯/己烷)得16(3.1g)和15(0.6g)，15和16純度均大於99％。

15：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.45(d,2h),7.33(d,2h),5.16–4.97(m,1h),4.16–4.08(m,1h),3.97(brs,1h),1.88–1.78(m,1h),1.61–1.43(m,2h),1.33–1.22(m,11h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.85.

16：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.44(d,2h),7.35(d,2h),5.13–4.96(m,1h),4.01–3.90(m,1h),3.87(brs,1h),1.86–1.75(m,1h),1.63–1.46(m,2h),1.35–1.23(m,11h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.15.

步驟2.i-27b的合成

向10ml反應管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑15(790mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(150ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物i-27b(151mg),收率53％)。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.48–7.39(m,3h),7.35(d,2h),6.28(d,j＝19.0hz,1h),5.62(d,j＝8.2hz,1h),5.01–4.92(m,1h),4.55-4.52(m,1h),4.43–4.36(m,1h),4.15–4.09(m,1h),3.95–3.78(m,2h),1.86–1.75(m,1h),1.63–1.46(m,2h),1.40(d,j＝19.0hz,3h),1.35–1.23(m,11h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.65；lcms-esi+(m/z):570.2(m+h)+.

實施例14

((s)-(4-環丙基苯氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(i-27c)

向10ml反應管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑16(790mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(150ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物i-27c(151mg),收率53％)。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.45–7.35(m,3h),7.33(d,2h),6.25(d,j＝19.2hz,1h),5.60(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.93(m,1h),4.53-4.50(m,1h),4.41–4.35(m,1h),4.13–4.07(m,1h),3.93–3.75(m,2h),1.86–1.76(m,1h),1.62–1.43(m,2h),1.41(d,j＝19.0hz,3h),1.36–1.21(m,11h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.25；lcms-esi+(m/z):570.3(m+h)+.

實施例15

(2r,3r,4r,5r)-2-((((r)-(4-環丙基苯氧基))(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷醯基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氫呋喃-3-基-l-丙氨酸酯(i-29b)

步驟1.i-29』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-27b(85.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-29』b，63.4mg，收率55％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.46–7.36(m,3h),7.34(d,2h),6.19(d,j＝19.2hz,1h),5.74(d,j＝8.0hz,1h),5.44–5.37(m,1h),4.97–4.93(m,1h),4.55-4.51(m,1h),4.39–4.26(m,2h),4.08-4.05(m,1h),3.95–3.87(m,1h),2.18–2.11(m,1h),1.87–1.75(m,1h),1.63–1.52(m,2h),1.48(s,9h),1.43–1.37(m,6h),1.35–0.96(m,14h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.98；lcms-esi+(m/z):769.3[m+1]+。

步驟2.i-29b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-29』b(60mg,78μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-29b，43.8mg，收率84％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.43–7.37(m,3h),7.33(d,2h),6.12(d,j＝19.2hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.41–5.35(m,1h),4.95–4.93(m,1h),4.54-4.49(m,1h),4.38–4.25(m,2h),4.09-4.03(m,1h),3.93–3.85(m,1h),2.20–2.10(m,1h),1.86–1.75(m,1h),1.61–1.52(m,2h),1.45–1.36(m,6h),1.35–0.93(m,14h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.18；lcms-esi+(m/z):669.3(m+h)+.

實施例16

(2r,3r,4r,5r)-2-((((s)-(4-環丙基苯氧基))(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷醯基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氫呋喃-3-基-l-丙氨酸酯(i-29c)

步驟1.i-29』c的合成

在反應管中將boc-val-oh，9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入i-27c(85.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體i-29』c，61.6mg，收率53％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.47–7.36(m,3h),7.35(d,2h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.38(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.55-4.50(m,1h),4.38–4.26(m,2h),4.10-4.05(m,1h),3.96–3.87(m,1h),2.20–2.11(m,1h),1.89–1.75(m,1h),1.62–1.51(m,2h),1.46(s,9h),1.45–1.37(m,6h),1.35–0.98(m,14h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.65；lcms-esi+(m/z):769.3[m+1]+。

步驟2.i-29c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體i-29』c(60mg,78μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物i-29c，45.1mg，收率86％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.42–7.37(m,3h),7.34(d,2h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.70(d,j＝8.0hz,1h),5.43–5.33(m,1h),4.95–4.91(m,1h),4.52-4.49(m,1h),4.37–4.25(m,2h),4.09-4.01(m,1h),3.96–3.84(m,1h),2.21–2.11(m,1h),1.85–1.73(m,1h),1.62–1.51(m,2h),1.48–1.37(m,6h),1.35–0.90(m,14h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.11；lcms-esi+(m/z):669.4(m+h)+.

實施例17

d-丙氨酸氘代異丙酯鹽酸鹽19、20、21的製備

在0℃下，將參照文獻方法(journaloflabelledcompounds&radiopharmaceuticals,41(12),1145‐1163；1998)合成的六氘代異丙醇(17，1.05g)與n‐boc保護的d‐丙氨酸(1.8g)、edc(2.74g)及4‐n,n‐二甲胺基吡啶(100mg)混溶於無水二氯甲烷(20ml)中，撤去冰浴後室溫下攪拌過夜，tlc檢測反應結束後加入二氯甲烷(100ml)稀釋，有機相分別用5％碳酸氫鈉溶液和飽和鹽水洗滌，乾燥，濃縮後殘餘物用柱層析(己烷：乙酸乙酯＝4：1)純化，得到無色油狀液體產物(18，2.3g)。

0℃下將化合物(18，2.3g)溶於4mhcl的二氧六環溶液中，室溫下攪拌過夜，tlc檢測反應結束後減壓蒸除溶劑，殘餘物加入甲醇(2x3ml)並蒸除，殘餘物中加無水乙醇(5ml)析出白色沉澱即為d-丙氨酸六氘代異丙酯鹽酸鹽(19)。

用同樣的方法製備d-丙氨酸單氘代異丙酯鹽酸鹽(20)和d-丙氨酸七氘代異丙酯鹽酸鹽(21)。

實施例18

氘代異丙基[(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸酯22、23、24、25、26、27的製備

參考[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸異丙酯(5)和[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸異丙酯(6)的製備方法，用同樣的方法製備[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸六氘代異丙酯(22)和[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸六氘代異丙酯(23)

22：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.38–7.35(m,2h),7.33–7.21(m,3h),4.87(s,1h),3.92(brs,1h),3.68–3.60(m,1h),1.41(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.05.

23：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.40–7.36(m,2h),7.32–7.20(m,3h),4.91(m,1h),3.86(brs,1h),3.66–3.61(m,1h),1.43(d,j＝7.2hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.65.

[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸單氘代異丙酯(24)和

[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸單氘代異丙酯(25)

24：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.40–7.35(m,2h),7.33–7.20(m,3h),3.95(brs,1h),3.65–3.60(m,1h),1.43(s,6h),1.41(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.99.

25：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.42–7.34(m,2h),7.32–7.19(m,3h),3.89(brs,1h),3.66–3.61(m,1h),1.45(s,6h),1.42(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.63.

[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸七氘代異丙酯(26)和

[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸七氘代異丙酯(27)

26：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.40–7.36(m,2h),7.33–7.21(m,3h),3.98(brs,1h),3.65–3.59(m,1h),1.37(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.97.

27：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.42–7.34(m,2h),7.32–7.19(m,3h),3.89(brs,1h),3.66–3.60(m,1h),1.35(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.60.

實施例19

異丙基[(五氟苯氧基)(五氘代苯氧基)磷醯基]—d—丙氨酸酯30、31的製備

在反應瓶中加入二氯磷酸五氘代苯酯28(11.1克，51.4毫摩爾)，及d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽1(8.64克，51.425.7毫摩爾)，冷卻到-70℃，在1.5小時內滴加三乙胺(14.4毫升，103.4毫摩爾)的二氯甲烷(44毫升)溶液,加畢後，升至室溫，攪拌過夜後將反應混合物冷卻至0℃，在40分鐘內將五氟苯酚4(9.46克，51.4毫摩爾)和三乙胺(7.2毫升，51.4毫摩爾)的二氯甲烷(60ml)溶液滴加到上述溶液中，在0℃攪拌1小時，升至室溫，攪拌過夜後，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有機相，用無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱分離(0-30％乙酸乙酯/己烷)得13.9克白色固體，固體用10％用叔丁基甲基醚/己烷重結晶，得白色固體30(6.5克)，母液用矽膠柱分離(50％乙酸乙酯/己烷)得31(4.5克)和30(1.0克)，30和31純度均大於99％。

30：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):5.22–4.96(m,1h),4.25–4.09(m,1h),3.97–3.91(m,1h),1.47(d,j＝7.0hz,3h),1.25(d,j＝6.0hz,3h),1.24(d,j＝6.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.05.

31：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):5.24–4.97(m,1h),4.16–4.03(m,1h),3.95–3.90(m,1h),1.48(d,j＝7.0hz,3h),1.23(d,j＝6.0hz,3h),1.22(d,j＝6.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.75.

實施例20

((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸七氘代異丙酯(ii-01b)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑26(736mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物ii-01b(322mg),收率60％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.78(s,1h),7.40–7.33(m,3h),7.25-7.20(m,2h),7.19-7.15(m,1h),6.17(d,j＝19.0hz,1h),5.56(d,j＝8.1hz,1h),5.06–4.95(m,1h),4.50-4.46(m,2h),4.42–4.33(m,1h),4.29(brs,1h),3.93–3.78(m,2h),1.38-1.29(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.68；lcms-esi+(m/z):537.2(m+h)+.

實施例21

((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸七氘代異丙酯(ii-01c)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑27(736mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物ii-01c(305mg),收率57％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.70(s,1h),7.41–7.34(m,3h),7.25-7.21(m,2h),7.20-7.15(m,1h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.53(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.93(m,1h),4.50-4.45(m,2h),4.42–4.31(m,1h),4.26(brs,1h),3.94–3.77(m,2h),1.38-1.30(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.59；lcms-esi+(m/z):537.2(m+h)+.

實施例22

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-七氘代異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(ii-03b)

步驟1.ii-03』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入ii-01b(80.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體ii-03』b，72.2mg，收率65.4％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.67(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.36(m,2h),7.28-7.23(m,2h),7.20-7.16(m,1h),6.17(d,j＝19.0hz,1h),5.77(d,j＝8.1hz,1h),5.40–5.32(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.55-4.51(m,1h),4.38–4.24(m,2h),3.97–3.88(m,1h),2.16–2.11(m,1h),1.48(s,9h),1.39-1.30(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.78；lcms-esi+(m/z):736.4[m+1]+。

步驟2.ii-03b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體ii-03』b(70.6mg,96μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物ii-03b，54.7mg，收率89.6％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝8.1hz,1h),7.45-7.38(m,2h),7.32-7.22(m,3h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.49–5.35(m,1h),5.02-4.93，(m,1h)，4.53-4.48(m,2h),4.39–4.35(m,1h),3.96–3.88(m,1h),2.45–2.35(m,1h),1.44-1.36(m,6h),1.16(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.33；lcms-esi+(m/z):636.3(m+h)+.

實施例23

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-七氘代異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(ii-03c)

步驟1.ii-03』c的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入ii-01c(80.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體ii-03』c，68.5mg，收率62％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.63(d,j＝8.1hz,1h),7.42–7.33(m,2h),7.27-7.26(m,2h),7.23-7.18(m,1h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.75(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.36(m,1h),4.95–4.92(m,1h),4.53-4.50(m,1h),4.39–4.26(m,2h),3.98–3.88(m,1h),2.19–2.13(m,1h),1.46(s,9h),1.39-1.31(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.91；lcms-esi+(m/z):736.4[m+1]+。

步驟2.ii-03c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體ii-03』c(65.5mg,89μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物ii-03c，48.2mg，收率85％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.60(d,j＝8.0hz,1h),7.43-7.38(m,2h),7.30-7.20(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.68(d,j＝8.1hz,1h),5.43–5.38(m,1h),5.00-4.94，(m,1h)，4.53-4.46(m,2h),4.39–4.35(m,1h),3.95–3.88(m,1h),2.46–2.37(m,1h),1.40-1.33(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.95；lcms-esi+(m/z):636.2(m+h)+.

實施例24

((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸l六氘代異丙酯(iii-01b)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑22(735mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物iii-01b(311mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.73(s,1h),7.42–7.32(m,3h),7.26-7.20(m,2h),7.17-7.13(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.58(d,j＝8.1hz,1h),5.06–4.96(m,1h),4.52-4.46(m,2h),4.41–4.32(m,1h),4.25(brs,1h),4.18–4.09(m,1h),3.93–3.79(m,2h),1.38-1.27(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.69；lcms-esi+(m/z):536.2(m+h)+.

實施例25

((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸六氘代異丙酯(iii-01c)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑23(735mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物iii-01c(303mg),收率56.6％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.68(s,1h),7.41–7.33(m,3h),7.25-7.20(m,2h),7.18-7.13(m,1h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.55(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.95(m,1h),4.52-4.45(m,2h),4.41–4.31(m,1h),4.29(brs,1h),4.16–4.06(m,1h),3.96–3.79(m,2h),1.39-1.31(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.52；lcms-esi+(m/z):536.3(m+h)+.

實施例26

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-六氘代異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(iii-03b)

步驟1.iii-03』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入iii-01b(80.3mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體iii-03』b，73.6mg，收率66.8％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.61(d,j＝8.1hz,1h),7.43–7.37(m,2h),7.25-7.22(m,2h),7.19-7.15(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.75(d,j＝8.1hz,1h),5.42–5.32(m,1h),4.99–4.92(m,1h),4.58-4.51(m,1h),4.39–4.23(m,2h),4.19–4.09(m,1h),3.98–3.89(m,1h),2.17–2.10(m,1h),1.46(s,9h),1.38-1.30(m,6h),1.25(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.75；lcms-esi+(m/z):735.4[m+1]+。

步驟2.iii-03b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體iii-03』b(70.5mg,96μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物iii-03b，51.6mg，收率84.6％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.53(d,j＝8.1hz,1h),7.46-7.38(m,2h),7.34-7.20(m,3h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.75(d,j＝8.1hz,1h),5.47–5.34(m,1h),5.01-4.92，(m,1h)，4.54-4.49(m,2h),4.37–4.33(m,1h),4.11–4.06(m,1h),3.97–3.86(m,1h),2.42–2.31(m,1h),1.45-1.38(m,6h),1.20(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.28；lcms-esi+(m/z):635.3(m+h)+.

實施例27

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-六氘代異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(iii-03c)

步驟1.iii-03』c的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入iii-01c(80.3mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體iii-03』c，66.3mg，收率60％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.65(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.32(m,2h),7.26-7.24(m,2h),7.23-7.17(m,1h),6.15(d,j＝19.2hz,1h),5.74(d,j＝8.0hz,1h),5.44–5.36(m,1h),4.95–4.91(m,1h),4.54-4.48(m,1h),4.39–4.28(m,2h),4.15–4.08(m,1h),3.98–3.86(m,1h),2.18–2.12(m,1h),1.45(s,9h),1.38-1.31(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.88；lcms-esi+(m/z):735.4[m+1]+。

步驟2.iii-03c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體iii-03』c(65.4mg,89μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物iii-03c，46.2mg，收率82％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.0hz,1h),7.42-7.38(m,2h),7.32-7.20(m,3h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.65(d,j＝8.1hz,1h),5.44–5.37(m,1h),5.02-4.95，(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.38–4.35(m,1h),4.17–4.09(m,1h),3.95–3.86(m,1h),2.47–2.35(m,1h),1.41-1.33(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.92；lcms-esi+(m/z):635.2(m+h)+.

實施例28

((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸單氘代異丙酯(iv-01b)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑24(727mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物iv-01b(350mg),收率66％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.98(s,1h),7.43–7.35(m,3h),7.28-7.22(m,2h),7.19-7.15(m,1h),6.21(d,j＝19.0hz,1h),5.55(d,j＝8.1hz,1h),5.06–4.96(m,1h),4.52-4.47(m,2h),4.43–4.36(m,1h),4.30(brs,1h),3.98–3.78(m,2h),1.42-1.28(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.69；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.

實施例29

((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸單氘代異丙酯(iv-01c)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑25(727mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物iv-01c(308mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.71(s,1h),7.40–7.34(m,3h),7.25-7.22(m,2h),7.20-7.14(m,1h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.52(d,j＝8.1hz,1h),5.03–4.93(m,1h),4.50-4.42(m,2h),4.40–4.31(m,1h),4.29(brs,1h),3.94–3.78(m,2h),1.41-1.27(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.55；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.

實施例30

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-單氘代異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(iv-03b)

步驟1.iv-03』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入iv-01b(79.6mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體iv-03』b，74mg，收率67.6％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.89(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.34(m,2h),7.28-7.22(m,2h),7.20-7.15(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.78(d,j＝8.1hz,1h),5.40–5.31(m,1h),4.97–4.91(m,1h),4.58-4.51(m,1h),4.37–4.24(m,2h),3.95–3.87(m,1h),2.15–2.10(m,1h),1.49(s,9h),1.40-1.23(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.77；lcms-esi+(m/z):730.4[m+1]+。

步驟2.iv-03b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體iv-03』b(70mg,96μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物iv-03b，51.7mg，收率85％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.44-7.37(m,2h),7.31-7.22(m,3h),6.19(d,j＝19.2hz,1h),5.75(d,j＝8.0hz,1h),5.47–5.34(m,1h),5.02-4.92，(m,1h)，4.55-4.48(m,2h),4.37–4.35(m,1h),3.96–3.89(m,1h),2.46–2.34(m,1h),1.44-1.20(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.38；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.

實施例31

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-單氘代異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(iv-03c)

步驟1.iv-03』c的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入iv-01c(79.6mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體iv-03』c，71.8mg，收率65.7％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(d,j＝8.1hz,1h),7.40–7.32(m,2h),7.26-7.23(m,2h),7.21-7.16(m,1h),6.10(d,j＝19.2hz,1h),5.74(d,j＝8.0hz,1h),5.44–5.36(m,1h),4.94–4.90(m,1h),4.55-4.51(m,1h),4.39–4.24(m,2h),3.98–3.86(m,1h),2.19–2.12(m,1h),1.47(s,9h),1.39-1.19(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.97；lcms-esi+(m/z):730.4[m+1]+。

步驟2.iv-03c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體iv-03』c(70mg,96μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物iv-03c，49.5mg，收率82％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.61(d,j＝8.0hz,1h),7.42-7.35(m,2h),7.30-7.22(m,3h),6.14(d,j＝19.2hz,1h),5.66(d,j＝8.0hz,1h),5.41–5.35(m,1h),5.00-4.95，(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.39–4.34(m,1h),3.96–3.88(m,1h),2.48–2.37(m,1h),1.40-1.20(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.93；lcms-esi+(m/z):630.2(m+h)+.

實施例32

((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(五氘代苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(x-01b)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑30(733mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物x-01b(302mg),收率56％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.79(s,1h),7.42(d,j＝8.0hz,1h),6.19(d,j＝19.2hz,1h),5.57(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.95(m,1h),4.52-4.46(m,2h),4.40–4.33(m,1h),4.29(brs,1h),4.15–4.07(m,1h),3.95–3.78(m,2h),1.39-1.21(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.69；lcms-esi+(m/z):535.2(m+h)+.

實施例33

((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(五氘代苯氧基)磷醯基)-d-丙氨酸異丙酯(x-01c)

向10ml反應管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml無水thf，混合物在冰水浴中冷卻至0℃。滴加叔丁基氯化鎂格氏試劑(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反應混合物在o℃下攪拌30min，隨後在0℃下滴加磷試劑31(733mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。將所得到的澄清反應溶液升溫,攪拌1天。加入飽和nh4cl(15ml)，攪拌5分鐘，將混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋。分出有機相，水層用乙酸乙酯(30ml)萃取。合併的有機層用水(30ml)、飽和nahco3(2x3oml)、鹽水(3oml)洗滌，並經na2so4乾燥。減壓蒸去溶劑，殘留物經由矽膠柱層析(0-10％甲醇的二氯甲烷)純化，得白色固體產物x-01c(301mg),收率55％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.76(s,1h),7.38(d,j＝8.1hz,1h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.56(d,j＝8.1hz,1h),5.02–4.93(m,1h),4.50-4.45(m,2h),4.40–4.31(m,1h),4.25(brs,1h),4.19–4.09(m,1h),3.90–3.78(m,2h),1.37-1.19(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.58；lcms-esi+(m/z):535.2(m+h)+.

實施例34

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(五氘代苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(x-03b)

步驟1.x-03』b的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入x-01b(80.2mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體x-03』b，72mg，收率65.4％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.69(d,j＝8.2hz,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.76(d,j＝8.2hz,1h),5.40–5.33(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.55-4.50(m,1h),4.38–4.25(m,2h),4.13-4.06(m,1h),3.93–3.87(m,1h),2.17–2.11(m,1h),1.47(s,9h),1.40–0.99(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.76；lcms-esi+(m/z):734.4[m+1]+。

步驟2.x-03b的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體x-03』b(70.4mg,96μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物x-03b，55.3mg，收率91％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝8.1hz,1h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.54(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.94，(m,1h)，4.54-4.47(m,2h),4.38–4.32(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.93–3.85(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.43-1.11(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.32；lcms-esi+(m/z):634.3(m+h)+.

實施例35

(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-異丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(五氘代苯氧基)磷醯基)氧)甲基)-4-甲基四氫呋喃-3-基l-纈氨酸酯(x-03c)

步驟1.x-03』c的合成

在反應管中將boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六環溶解，降溫至-5℃，攪拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室溫下反應30min，繼續降溫至-5℃，然後依次加入x-01c(80.2mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六環溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫反應過夜，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到固體中間體x-03』c，72.7mg，收率66％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.66(d,j＝8.1hz,1h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.36(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.52-4.49(m,1h),4.39–4.25(m,2h),4.09-4.03(m,1h),3.95–3.86(m,1h),2.19–2.11(m,1h),1.43(s,9h),1.39-0.98(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.91；lcms-esi+(m/z):734.5[m+1]+。

步驟2.x-03c的合成

在反應管中加入4mhcl的1，4-二氧六環(2ml)，降溫至0℃，攪拌下加入中間體x-03』c(70.4mg,96μmol)，室溫下反應1小時，反應結束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合併的有機層用水、飽和nahco3、鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋幹溶劑後，用矽膠柱層析分離得到產物x-03c，51.7mg，收率85％。

1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(d,j＝8.0hz,1h),6.10(d,j＝19.0hz,1h),5.68(d,j＝8.1hz,1h),5.44–5.36(m,1h),5.00-4.92，(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.39–4.33(m,1h),4.18–4.12(m,1h),3.95–3.86(m,1h),2.45–2.35(m,1h),1.41-1.14(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.95；lcms-esi+(m/z):634.2(m+h)+.

實施例36

類似的方法合成了化合物i-31b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.57(d,j＝8.1hz,1h),7.43-7.38(m,2h),7.30-7.21(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.71(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.54-4.45(m,2h),4.38–4.34(m,1h),4.15–4.11(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.13(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):629.3(m+h)+.

實施例37

類似的方法合成了化合物ii-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.42-7.36(m,2h),7.30-7.20(m,3h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.46–5.34(m,1h),4.53-4.45(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.15–4.12(m,1h),3.92–3.84(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.35(m,6h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.29；lcms-esi+(m/z):636.3(m+h)+.

實施例38

類似的方法合成了化合物iii-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.40-7.35(m,2h),7.31-7.22(m,3h),6.15(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.1hz,1h),5.44–5.35(m,1h),4.93(s,1h),4.53-4.44(m,2h),4.37–4.33(m,1h),4.15–4.12(m,1h),3.95–3.84(m,1h),2.44–2.36(m,1h),1.42-1.35(m,6h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.25；lcms-esi+(m/z):635.2(m+h)+.

實施例39

類似的方法合成了化合物iv-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝8.0hz,1h),7.42-7.38(m,2h),7.32-7.21(m,3h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.38(m,1h),4.54-4.43(m,2h),4.39–4.34(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.90–3.84(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.26(s,6h),1.09(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.18；lcms-esi+(m/z):630.2(m+h)+.

實施例40

類似的方法合成了化合物v-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.60(s,1h),7.44-7.38(m,2h),7.32-7.21(m,3h),6.15(d,j＝19.0hz,1h),5.45–5.34(m,1h),5.05-4.96，(m,1h)，4.56-4.43(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.13–4.10(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.29；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.

實施例41

類似的方法合成了化合物vi-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.45-7.39(m,2h),7.32-7.22(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.47–5.36(m,1h),5.03-4.97，(m,1h)，4.57-4.46(m,2h),4.39–4.34(m,1h),4.16–4.12(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.44-1.35(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):631.4(m+h)+.

實施例42

類似的方法合成了化合物x-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.54(d,j＝8.1hz,1h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.50–5.39(m,1h),5.04-4.95，(m,1h)，4.55-4.47(m,2h),4.38–4.35(m,1h),4.16–4.12(m,1h),3.93–3.82(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.45-1.34(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.2hz,3h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.31；lcms-esi+(m/z):634.2(m+h)+.

實施例43

類似的方法合成了化合物xi-01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.79(s,1h),7.38–7.30(m,3h),7.25-7.18(m,2h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.56(d,j＝8.0hz,1h),5.06–4.95(m,1h),4.51-4.45(m,2h),4.42–4.36(m,1h),4.25(brs,1h),4.13–4.09(m,1h),3.94–3.78(m,2h),1.36-1.28(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.63；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.

實施例44

類似的方法合成了化合物xi-03b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.57(d,j＝8.1hz,1h),7.43-7.37(m,2h),7.29-7.22(m,2h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.36(m,1h),5.05-4.95，(m,1h)，4.54-4.47(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.93–3.84(m,1h),2.46–2.37(m,1h),1.43-1.33(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.20；lcms-esi+(m/z):630.4(m+h)+.

實施例45

類似的方法合成了化合物xi-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.44-7.38(m,2h),7.31-7.20(m,2h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.0hz,1h),5.48–5.37(m,1h),5.02-4.95，(m,1h)，4.53-4.45(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.36(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.2hz,3h),1.08(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.27；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.

實施例46

類似的方法合成了化合物xii-01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.73(s,1h),7.34–7.30(m,2h),7.25-7.18(m,2h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.59(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.94(m,1h),4.52-4.47(m,2h),4.41–4.35(m,1h),4.25(brs,1h),4.15–4.09(m,1h),3.93–3.83(m,2h),1.37-1.26(m,6h),1.20(d,j＝6.0hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.59；lcms-esi+(m/z):531.3(m+h)+.

實施例47

類似的方法合成了化合物xii-03b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.45-7.22(m,4h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.71(d,j＝8.2hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.58-4.49(m,2h),4.39–4.35(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.92–3.86(m,1h),2.42–2.35(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.33；lcms-esi+(m/z):630.4(m+h)+.

實施例48

類似的方法合成了化合物xii-04b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.43-7.22(m,4h),6.17(d,j＝19.2hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.47–5.39(m,1h),5.02-4.95(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.15–4.11(m,1h),3.92–3.86(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.42(d,j＝19.0hz,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.32；lcms-esi+(m/z):601.3(m+h)+.

實施例49

類似的方法合成了化合物xii-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.45-7.23(m,4h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.2hz,1h),5.51–5.42(m,1h),5.09-4.98，(m,1h)，4.55-4.45(m,2h),4.38–4.32(m,1h),4.17–4.12(m,1h),3.92–3.83(m,1h),2.44–2.37(m,1h),1.43-1.35(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.0hz,3h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.19；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.

實施例50

類似的方法合成了化合物xii-06c：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.75(s,1h),7.34–7.30(m,2h),7.24-7.17(m,2h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.59(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.94(m,1h),4.52-4.47(m,2h),4.40–4.35(m,1h),4.27(brs,1h),4.15–4.09(m,1h),3.93–3.83(m,2h),1.34-1.26(m,6h),1.20(d,j＝6.0hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.53；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.

實施例51

類似的方法合成了化合物xii-07c：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.0hz,1h),7.48-7.21(m,4h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.2hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.58-4.49(m,2h),4.39–4.35(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.92–3.86(m,1h),2.42–2.35(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.38；lcms-esi+(m/z):630.1(m+h)+.

實施例52

類似的方法合成了化合物xii-08c：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.51(d,j＝8.0hz,1h),7.45-7.20(m,4h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.2hz,1h),5.51–5.41(m,1h),5.09-4.98，(m,1h)，4.55-4.43(m,2h),4.38–4.32(m,1h),4.17–4.13(m,1h),3.92–3.82(m,1h),2.41–2.36(m,1h),1.43-1.35(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.0hz,3h),1.13(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):630.2(m+h)+.

實施例53

類似的方法合成了化合物xiii-01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.77(s,1h),7.39(d,j＝8.0hz,1h),7.30(s,2h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.59(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.97(m,1h),4.50-4.44(m,2h),4.41–4.36(m,1h),4.23(brs,1h),4.12–4.08(m,1h),3.95–3.78(m,2h),1.37-1.29(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.61；lcms-esi+(m/z):533.3(m+h)+.

實施例54

類似的方法合成了化合物xiii-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.29(s,2h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.2hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.97，(m,1h)，4.52-4.43(m,2h),4.36–4.32(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.91–3.85(m,1h),2.45–2.37(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.0hz,3h),1.08(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.35；lcms-esi+(m/z):632.4(m+h)+.

實施例55化合物鹽酸鹽的製備

索菲布韋在鹼性或酸性條件下都無法成鹽，在中性的水中溶解度很差。而本發明中，3』-位用胺基酸酯保護的化合物可以與酸成鹽，能增加其在水中的溶解度，在製劑上提供便利。

化合物鹽酸鹽的製備：將3』-位用胺基酸酯保護的化合物(i-02b、i-02c、i-05b、i-05c、i25b、i-25c、i-29b、i-29c、i-31b、ii-03b、ii-03c、ii-13b、iii-03b、iii-03c、iii-13b、iv-03b、iv-03c、iv-13b、v-13b、vi-13b、x-03b、x-03c、xi-03b、xi-05b、xii-03b、xii-05b、xii-07c、xii-08c、xiii-05b)用乙酸乙酯溶解，在0℃下滴加1mhcl的乙酸乙酯溶液，攪拌10min，加入環己烷，析出沉澱，沉澱用環己烷洗滌三遍，減壓除去溶劑，乾燥得鹽酸鹽產品。

生物學評價

1.本發明的化合物在hcv複製子(hcvpp)系統中的抗病毒活性檢測

hcv複製子測定程序

一般程序:使帶有hcv基因型1b複製子和螢光素酶報導基因的huh-7來源的細胞系(zluc)在補充10％胎牛血清、2mmglutamax、1％mem非必需胺基酸、100iu/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素和0.5mg/ml(g418)的dulbecco改進eagle培養基(dmem)中生長。通過採用基於脂質/組蛋白的轉染過程，用人類羰酸酯酶1(ces1)瞬時轉染zluc細胞。轉染24和48小時後，使用抗ces1和抗標籤抗體，通過蛋白質印跡(westernblot)確認ces1的表達。對於劑量反應測試，以7.5xl03個細胞/孔，在50μl體積中，將細胞接種在96孔板，並在37℃/5％co2下孵育。在huh-7培養基中新鮮配製藥物溶液作為2x儲液。在不含g418的dmem中從這些儲液製備10個另外的5倍稀釋液。在接種huc細胞後至少3小時，通過向板中一式兩份加入50μl的藥物稀釋液以開始藥物處理。藥物終濃度的範圍為1oonm-0.0000512nμ。然後將細胞在37℃/5％co2下孵育。或者以兩種濃度(1onm和1oonm)測試化合物。在所有情況下，huh-7(其未帶有hcv複製子)用作陰性對照。在孵育72小時後,通過量化通過螢火蟲螢光素酶將5』-氟螢光素單氧合成為氧基氟螢光素(oxyfiuoroluciferin)所發射的光子,來測量hcv複製的抑制。為此，通過輕叩，從板中除去培養基，將50微升one-glo螢光素酶測定試劑加入各孔。在室溫下將板輕輕振蕩3分鐘，使用700nm截止濾波器，在具有1秒鐘讀出時間的victor3v1420多標記記數器(perkinelmer)上測量發光。通過microsoftexcel和xlfit4.1軟體求出的所得最佳擬合方程式的劑量反應曲線計算ec50值。

對於細胞毒性評價，將zluc細胞用上述化合物處理，採用celltiter-blue細胞存活力測定法(promega)，將20μl測定溶液加入各孔中，來監測細胞存活力。然後將板在37℃/5％co2下孵育至少3小時。分別用560和590nm的激發和發射波長，在victor3v1420多標記記數器(perkinelmer)中檢測板的螢光,應用microsoftexcel和xlfit4.1軟體求出cc50值。

根據上述複製子測定法測定下表提供的化合物。

*索菲布韋是依照參考文獻j.org.chem.2011,76,8311製備

2.實施例化合物體內pk試驗數據

hcvns5b是一種rna聚合酶，負責hcv病毒複製，複製所用底物為三磷酸核苷。本發明的實施例化合物為磷醯胺酯核苷酸類似物前藥，在肝細胞內代謝生成活性成分三磷酸核苷類似物，從而抑制ns5b的活性和hcv病毒的複製。作為一個前藥，體內生成三磷酸尿苷類似物的能力與對ns5b的抑制活性直接相關聯，因此發明人做了體內pk試驗以檢測本發明化合物生成活性藥三磷酸尿苷類似物的能力,體內pk試驗模型為cd-1小鼠體內肝臟pk分析。

實施例化合物在小鼠肝臟內代謝生成活性成分2』-甲基-2』-氟代尿苷三磷酸的藥物代謝動力學試驗是用cd-1小鼠進行的。給藥為單次灌胃給藥，給藥劑量為10毫克/5毫升/千克。索菲布韋的製劑處方為20％peg200和0.5％羧甲基纖維素鈉；實施例化合物的製劑處方為30％peg200和0.5％羧甲基纖維素鈉。肝臟樣品的取樣點為給藥後1、2、4、6、12、24小時。取樣時，小鼠先用co2處死，通過肝門靜脈用冰冷的生理鹽水衝洗肝臟，切成大約0.2克的小塊肝臟樣品，在液氮中速凍，並在-80℃中保存。

通過lc-ms/ms分析肝臟樣品中的活性物種核苷三磷酸。內標準(is)採用美國trilinkbiotechnologies公司(2』r)-2』-脫氧-2』-甲基-2』-氟尿苷三磷酸，以正離子模式的串聯質譜法在美國ab公司的api5500型液質聯用儀上對待測樣品進行檢測及定量,測得小鼠肝臟活性藥(2』r)-2』-脫氧-2』-甲基-2』-氟尿苷三磷酸的暴露量(2』-deoxy-2』-me-2』-f-utpauc)。

由實施例中製備的差向異構體的測試結果表可得知，實施例化合物中rp構型的化合物在肝細胞中的生成2』-deoxy-2』-me-2』-f-utp的濃度遠遠優於sp構型的異構體，也遠遠超過同樣劑量的索菲布韋在肝臟中的濃度。所有實施例中製備的化合物(d-丙氨酸磷酸酯前藥)其體外活性高於索菲布韋(l-丙氨酸磷酸酯前藥)，其體內活性更顯著的優越於索菲布韋，顯示出極高的臨床應用價值。

對照兩對化合物xii-06c和xii-04b以及x-06c和x-04b，可以看到d-胺基酸酯構成的核苷氨基磷酸酯相較於對應的l-胺基酸酯構成的核苷氨基磷酸酯具有5倍以上的三核苷酸輸送能力，說明本發明的d-胺基酸酯構成的核苷氨基磷酸酯比天然胺基酸酯的前藥更佳的肝靶向成藥性。

以上實驗結果表明，本發明的化合物具有高效的抑制hcv病毒的能力，與陽性對照藥索菲布韋相比，體外和體內的活性評價都下顯示出顯著的優越性，本發明的化合物在測試的濃度範圍內沒有表現出細胞毒性，安全性好，對於治療hcv感染具有極好的前景。

儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下對本發明進行各種修改和改變均在本發明的保護範圍。本發明的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於權利要求書。