物質的生產方法
2023-06-04 02:42:16
專利名稱：物質的生產方法
技術領域：
本發明涉及利用微生物來生產目的物質的方法。本發明的典型微生物包括屬於埃希氏桿菌屬(Escherichia)的微生物和棒狀桿菌，它們被傳統用於多種物質生產中。所生產的目的物質，包括L-胺基酸、抗生素、維生素、生長因子、生理活性物質，以及其他傳統由微生物生產的物質。本發明公開了在利用微生物的物質生產方法中，提高最終目的產物產率所使用的方法。
背景技術：
L-胺基酸發酵是使用微生物生產目的產物的公知方法的典型例證。L-胺基酸不僅被用於調味品和食品，也用於作各種的醫藥營養混合物組分，用作動物飼料添加劑，製藥業及化學工業中的藥劑，以及作為利用微生物產生L-胺基酸如L-賴氨酸和L-高絲氨酸等的生長因子。作為用於發酵法生產L-胺基酸的微生物，眾所周知的有棒狀桿菌屬於埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌屬(Bacillus)、及沙雷氏菌屬(Serratia)的微生物。
野生型微生物(野生型株)、由野生株誘導而得的營養缺陷株、作為多種耐藥性突變株的、由野生株誘導而得的代謝調節變異株以及既有營養缺陷株和代謝調節變異株兩方面性質的株都可用於發酵法生產L-胺基酸。營養缺陷株所需物質隨不同的株而不同，並且，對於同種物質，不同的營養缺陷株要求程度亦不同。同樣，對於作為耐藥性變異株的代謝調節變異株亦有多樣性。
近年來，使用了重組DNA技術進行L-胺基酸的發酵生產。此技術的原理是在宿主微生物中，富集L-胺基酸生物合成酶(系)，強化宿主微生物的L-胺基酸生物合成系統。參見「胺基酸發酵學會出版中心1986」。
但是，傳統用於發酵法生產L-胺基酸的微生物，其L-胺基酸生物合成途徑、以及輔酶的生物合成途徑等，與野生型微生物的生物合成途徑沒有什麼不同。即，L-胺基酸生產微生物的育種，對於在L-胺基酸生物合成途徑中存在的最終產物或類似物是脫敏的。為了如此育種，對微生物細胞提供營養要求性及耐藥性，用重組DNA技術，進行生物合成酶(系)基因的擴增。
另外，除L-胺基酸以外，利用微生物發酵法生產的物質有很多。例如抗生素和維生素。抗生素有各種各樣的種類，有多種物質作為其生物合成的前體。如糖、胺基酸、醋酸、丙酸、甲羥戊酸等。通過前體之外的多種代謝物的轉換過程，從這種前體中產生目的抗生素。對於維生素和其他生物產生物質也有同樣的機制。
在利用微生物生產上述各種物質的時候，每種物質都是由微生物細胞內的生物合成途徑來生產的。有一種重要的輔酶是生物合成體系中相應酶充分起作用所必需的，它就是還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸(以下稱作NADPH)，但是，對於NADPH和利用微生物生產物質的關係，尚未報導。
與NADPH的產生有關的酶之一是煙醯胺二核苷酸轉氫酶(以下稱作轉氫酶)。該酶被公認存在於包括埃希氏桿菌屬微生物的各種生物中。大腸桿菌是埃希氏桿菌屬的典型微生物，其轉氫酶的純化(David M.Clarke and Philip D.Bragg，Eur.J.Biochem.，149，517-523(1985))，其編碼基因的克隆(David M.Clarke and Philip D.Bragg，J.Bacteriology，162，367-373(1985))，基因的核苷酸序列的測定(David M.Clarke，Tip W.Loo，Shirley Gillam，and PhilipD.Bragg，Eur.J.Biochem.158，647-653(1986))已進行，也明確了該酶的存在。然而，該酶的生理活性幾乎未知。這一點被該酶缺陷株沒有表現型表達的事實所證明。
發明公開內容本發明的主題是，提高微生物產生目的物質的產率，包括步驟在培養基中培養微生物，使目的物質在該培養基中生成並蓄積，收集該目的物質。
傳統的提高目的物質的方法是對於目的物質的生物合成途徑產生的終產物或其他物質引起的合成調節的失敏，或對於存在於微生物細胞中的目的物質合成所必需的輔酶的失敏。本發明是根據提及以外的全新的原理，給出一種提高目的物質產率的方法。
對於在生物體內進行的物質如L-胺基酸的生物合成，要起多種還原反應。輔酶NADPH被生理性用作生活期內還原物質。例如，對於L-穀氨酸的生物合成途徑，穀氨酸脫氫酶要求NADPH作為輔酶。對於L-賴氨酸的生物合成途徑中，天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶也要求NADPH作為輔酶。
對於其他L-胺基酸的生物合成途徑也是同樣，NADPH作為輔酶起到了重要的作用。並且，對於多數L-胺基酸的生物合成途徑，L-穀氨酸作為氨基的供給源是必要的，因此，在L-胺基酸生物合成中NADPH是供給氨基必不可少的。
NADPH大部分是由在含有葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶和磷酸葡萄糖脫氫酶的磷酸戊糖循環中，葡萄糖被代謝而生成的。由於磷酸戊糖循環，可以釋放出二氧化碳，因此，NADPH的產率，可以按每一個葡萄糖分子，相對於12個NADPH分子來計算。
另一方面，雖然還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(以下簡稱為NADH)與NADPH是極為相似的分子，但在許多情況下則不能作為L-胺基酸生物合成的輔酶。NADH在TCA循環中被生物合成，通常大量存在於細胞內。
對於L-胺基酸的生物合成途徑，由葡萄糖生物合成所需L-胺基酸過程中，在很多情況下，產生了不能夠有效地被利用的生物體內的成份。通常這樣的成份在TCA循環中被氧化，結果產生很多NADH。
本發明提出了一種假說，對於利用微生物生產目的物質的方法，在生產目的物質時，需要大量的NADPH，為提供這種NADPH，就要不可避免地消耗葡萄糖，結果引起每消耗糖量的目的物質產率的降低(假說1)。
並且，發明者提出了一種假說，對於利用微生物生產目的物質的方法，在生產目的物質時，不能被有效地利用的生物體內成份會不可避免地蓄積起來，在TCA循環中被代謝，結果引起的細胞內NADH濃度上升(假說2)。
基於上述假說1和假說2，如果細胞內的NADH能夠充分地轉變成NADPH，就可以節約NADPH的生物合成所需要的糖，微生物就可以以更高的產率生產目的物質。同時假定，作為在TCA循環中所生成的NADH轉變成NADPH的這種方法，也可以考慮利用轉氫酶。
發明者，以上述概念為基礎進行了研究。深入研究的結果，從埃希氏桿菌中獲得含有轉氫酶基因的DNA片段，使用此DNA片段，能夠成功地使微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的生產能力上升。因此，上述具有提高的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的生產能力的微生物能夠提高目的物質的產率。
即，本發明具有以下特徵(1)一種使用微生物生產目的物質的方法，包括步驟在培養基中培養微生物，在該培養基中，使目的物質生成並蓄積，以及從培養基中收集目的物質這個利用微生物生產還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率得到提高。
(2)(1)的方法其中目的物質是L-胺基酸(3)(2)的方法其中L-胺基酸選自L-蘇基酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸或是L-苯丙氨酸；(4)(1)或(2)的方法其中微生物屬於埃希氏桿菌；(5)(1)或(2)的方法其中微生物屬於棒狀桿菌；(6)(1)或(5)的方法其中通過提高微生物細胞內煙醯胺核苷酸轉氫酶的酶活性而提高微生物還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率。
(7)(6)的方法通過增加微生物細胞內編碼煙醯胺核苷酸轉氫酶基因的表達數量，而提高微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率。
(8)(7)的方法通過增加微生物細胞內的煙醯胺核苷酸轉氫酶基因拷貝數，從而提高微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率。
本發明利用微生物所產生的目的物質是如L-蘇基酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸等的各種L-胺基酸。除此之外，任何下面提及的微生物產生的，在其生物合成途徑中必需NADPH的物質，如鳥苷酸、次黃苷酸等的核酸類、維生素類、抗生素、生長因子、生理活性物質等都是可應用的。另外，即使是不是利用微生物生產的物質，假如對於它的生物合成，NADPH是必要的物質，則一定可以使用本發明。
例如，生物合成鏈黴素，在從dTDP-葡萄酸到dTDP-4-氧-4，6-雙脫氧-D-葡萄糖的合成中，要使用NADPH。另外，對於肽抗生素，由於胺基酸成為前體，對於它的生物合成，NADPH是必要的。青黴素是一種β-內醯胺抗生素其前體是L-纈氨酸、L-半胱基酸以及L-α-氨基已二酸，對於它的生物合成，NADPH也是必要的。
試圖知道任何物質的生物合成需要NADPH時，假如生物合成途徑被揭示，從其生物合成途徑可以顯而易見。
本發明所用的微生物，假如它屬於那些用於生產的埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬等，並沒有被特殊地限定。優選微生物，其DNA片段含有從微生物中分離得的質粒的複製起點，轉氫酶基因機能，以及增高的轉氫酶基因的拷貝數。另一方面，具有起始的目的物質的高生產能力的株，根據本發明，最優選為應用提高產率的菌株。因為高產率的菌株引起的上述假說1，假說2的現象更強，因此，利用本方法，產率的改良的效果應該表現得更為明顯。例如，目的物質是L-蘇基酸時，例舉大腸桿菌B-3996(VKPM B-3996)(RIA 1867)(參照美國專利第5,175,170號)、棒狀桿菌。乙醯嗜酸菌AJ12318(FERM BP-1172)(參照美國專利第5,188,949號)等，L-賴氨酸時，例舉大腸桿菌AJ11442(NRRL B-12185，FERM BP-1543)(參照美國專利第4,346,170號)、乳糖發酵短桿菌。AJ 3990(ATCC 31269)(參照美國專利第4,066,501號)等，L-穀氨酸時，例舉大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)(參照法國專利公開申請第2,680,178號)、乳糖發酵短桿菌，AJ12475(FERM BP-2922)(參照美國專利第5,272,067號)等，L-亮氨酸時，例舉大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274)(參見特公昭62-34397號)、乳糖發酵短桿菌AJ 3718(FERM P-2516)(參照美國專利第3,970,519號)等，L-異亮氨酸時，是大腸桿菌KX141(BKTTM B-4781(VKPM B-4781)(參照歐洲專利公開申請第519,113號)、乳糖發酵短桿菌AJ12419(FERM BP-759)(參照美國專利第4,656,135號)等，L-纈氨酸時，是大腸桿菌VL1970(BKTTM B-4411(VKPM B-4411)(參照歐洲專利公開申請第519,113號)、乳糖發酵短桿菌AJ12341(FERM BP-1763)(參照美國專利第5,188,948號)等，L-苯丙氨酸時，是大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579)(參照歐洲專利公開申請第488,424號)、乳糖發酵短桿菌AJ12637(FERM BP-4160)(參照法國專利公開申請第2,686,898號)。
本發明使用的生產目的物質的培養基，可以使用對應於所採用的微生物，傳統使用的眾所周知的培養基。即含有碳源、氮源、無機離子以及優選其他有機成份的普通培養基。實施本發明無需特別的培養基。
作為碳源，可以使用例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和澱粉水解物等糖類、甘油和山梨醇等的醇類、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸類。
作為氮源，可以使用硫酸銨、氧化胺、磷酸銨等的無機銨鹽、大豆水解物等的有機氮、氨氣、氨水等。
作為微量有機營養源，例如維生素B1、L-高絲氨酸、L-酪氨酸、酵母提取物等的必需物質，並且優選適量的含有。除此之外，少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等也是任選的。
對應於所採用的微生物，可以在傳統使用的公知的條件下進行。例如，在有氧條件下可以培養16-120個小時，培養溫度為25℃-45℃，培養中的pH值控制在5-8。另外，可以使用無機或有機的酸或鹼物質以及氨氣等調節pH值。
從培養結束後的培養基中收集代謝產物，本發明無須特別的方法。也就是說，本發明將傳統的眾所周知的離子交換樹脂片，沉澱法及其他方法組合起來實施的。
作為使微生物的NADPH的生產能力上升的方法，可以例舉微生物細胞內的轉氫酶的酶活性上升。
作為使轉氫酶的酶活性上升的方法之一，可以例舉提高轉氫酶的基因的表達量。另一種提高轉氫酶酶活性的方法是修飾轉氫酶基因以產生具有的升高活性的轉氫酶。
微生物細胞內的轉氫酶基因的表達數量上升的方法，可例舉微生物細胞內的轉氫酶的拷貝數提高。
為了提高轉氫酶基因的拷貝數，含有上述基因的DNA片段是必要的。轉氫酶基因已被克隆到埃希氏桿菌屬的大腸桿菌K-12中，其核酸序列已被確定(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)。製備上述基因的DNA片段，可以使用D.M.Clarke et al.所揭示的方法。另外，使用參照D.M.Clarkeet al.所揭示的鹼基序列製成的合成DNA探針進行雜交法，或使用按照上述鹼基序列製成的合成DNA為引物的PCR法，用以上兩種方法能夠得到所期望的DNA片段。將能夠在目的微生物內自主複製的質粒-DNA，與含有轉氫酶基因的DNA片段相連，將其導入上述微生物，能夠使轉氫酶基因的拷貝數上升。
在使用PCR法從埃希氏桿菌屬細菌中克隆轉氫酶基因時，所使用的DNA引物，對於大腸桿菌，可以基於合適的已知的序列(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)製成。由於轉氫酶是兩個亞基組成的，因此必須把它們各自的基因pntA pntB的擴增。能夠擴增pntA，pntB兩個基因的3Kb的區的兩個引物、5′-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3′(SEQ ID NO1)，5′-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3′(SEQ ID NO2)是適合的。這些引物與D.M.Clarke et al.，所報告的序列略有不同，然而由於其序列的變化，可以在pntA，pntB兩個基因的上遊導入BamHI酶切位點，在其下遊導入HindIII酶切位點，BamHI和HindIII位點在兩基因內以及它們附近都不存在。所以，當使用這些限制酶進行克隆擴增的DNA片段，以及轉運到其他載體-DNA時，是很方便的。引物-DNA的合成，可以使用Applied Biosystems公司製造的DNA合成儀model 380 B，用phosphoamidite法(Tetrahedron letters，22，1859(19817)按常規進行。PCR反應，可用寶酒造有限公司製造的DNAサ-マルサイクゥ-PJ2000型，使用Taq DNA聚合酶，依照廠家指定的方法進行。
含轉氫酶基因的DNA片段，可以從埃希氏桿菌屬細菌以外的微生物中取得，取得方法是參考D.M.Clarke et al.，公開的鹼基序列，製備DNA探針進行雜交，或按照上述鹼基序列合成DNA引物進行PCR，就可以得到所希望的DNA片段。
在雜交法中使用的DNA探針，或用PCR法克隆基因時使用的DNA引物，可以基於已知的序列，例如大腸桿菌的序列(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)適當地製成。預計對各種微生物，基因的鹼基序列是不同的，主張製備的合成DNA應匹配於那些在來源於各種微生物轉氫酶之間的保守的部分。
用PCR法擴增的轉氫酶基因，在導入埃希氏桿菌屬細菌時，連接到能夠在埃希氏桿菌屬細菌細胞中自主複製的載體DNA上，導入埃希氏桿菌屬細菌細胞。
對於將得到的含有轉氫酶基因的DNA片段，導入埃希氏桿菌屬細菌以外的微生物時，將上述DNA片段連接到能夠在待導入上述DNA片段的微生物細胞中自主複製的載體DNA上，導入上述細胞。
本發明使用的載體-DNA，優選質粒載體DNA。可例舉pUC19、pUC 18、pBR 322、pHSG 299、pHSG 399、RSF 1010等。另外也可以使用噬菌體DNA載體。為有效地表達轉氫酶，也可以使用微生物內起作用的啟動子，如lac、trp和PL。另外，為使轉氫酶基因拷貝數上升，可採用轉座子(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))Mu噬菌體(專利申請平成2-109985)或同源性重組(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.1972))的方法，將含有上述基因的DNA(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))整合入染色體。
在導入基因的是微生物是棒狀桿菌時，本發明能夠使用的載體-DNA是棒狀桿菌中能夠自主複製的質粒載體、如pAM 330(參照專利申請平成1-11280公報)和pHM 519(參照專利申請昭和58-77895號公報)等。
從具有提高的轉氫酶活性的可能性的待選株中，為了選擇在實際上具有提高的轉氫酶活性的株，可使用已知的方法(David M.Clarkeand Philip D.Bragg，Journal of Bacteriolony，162，367-373(1985))來確認轉氫酶活性的增強。
附圖簡述
圖1、表示質粒pMW∷THY的製備。
圖2、表示質粒pHSG∷THYB的製備。
圖3、表示質粒pSU∷THY的製備。
實施本發明的最佳方式通過列舉以下實施例，更加具體地說明本發明。
實施例1轉氫酶基因的克隆編碼大腸桿菌的轉氫酶的pntA，pntB基因的鹼基序列已經報導過(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)、pntA編碼502胺基酸殘基的蛋白質、pntB編碼462胺基酸的蛋白質。另外，這兩種蛋白質對於轉氫酶活性的表達都是必要的，兩個基因在染色體DNA上連續排列因而兩基因可作為1個DNA片段得以克隆。
本發明者，為以後的操作的方便，不僅克隆兩個基因，並同時對於已知的存在於這些基因的上遊的有啟動子活性的區域，進行克隆。具體說就是用PCR法，放大含有基因和啟動子區的DNA片段，進行克隆。
用常規法製備5′-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3′(SEQ ID NO1)，5′-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3′(SEQ ID NO2)的二種合成DNA，作為PCR反應用的引物。對於PCR反應DNA模板，用齋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))製備大腸桿菌K-12 MC 1061株的總染色體組DNA。使用兩種引物-DNA和模板染色體DNA，根據Erlich等人的方法(PCR Technology，Stockton press(1989))進行PCR反應，進行最終DNA片段的擴增。另外，作為引物使用的兩個合成DNA的鹼基序列與D.M.Clarkeet al.報告的序列，在其合成DNA片段中央部分有若干不同。這是由於在設計合成寡核苷酸時，它們各自分別導入BamHI酶切位點和HindIII酶切位點。這兩個限制酶切位點，在將擴增的DNA片段插入載體時是必要的。在PCR反應時兩限制酶切位點的導入，引起引物和染色體DNA之間失配，但由於這些限制酶切位點被限定在合成DNA片段的中央部位，PCR反應的DNA的擴增可以不受失配影響進行。可以用瓊脂糖凝膠電泳，確認3.0KbDNA片段的擴增。
用BamHI和HindIII消化擴增的3.0Kb DNA片段。另和具有氨苄抗性標記的質粒載體-pMW 118(從Nippon Gene公司購入)。用DNA連結酶連結兩片段。由此得到的重組DNA命名為pMW∷THY質粒(圖1)用pMW∷THY質粒轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造(株)公司購入)，得到轉化子大腸桿菌JM109(pMW∷THY)。使用已知的方法(David M.Clarke and Philip D.Bragg，Journal ofBacteriolony，162，367-373(1985))，測定大腸桿菌JM109和大腸桿菌JM109(pMW∷THY)的細胞提取液中存在的轉氫酶的活性，結果用表1表示。
表1菌株名JM109 JM109 pMW∷THY轉氫酶比活(u/mg proteion)1.01.7根據表1所示，將大腸桿菌JM109(pMW∷THY)株與大腸桿菌JM109株比較，可以看到前者的轉氫酶的酶活性被提高了。其結果，證明在THY質粒中插入的DNA片段被確認含有轉氫酶基因。具有pMW∷THY質粒的大腸桿菌起名為AJ12929株。此菌株在平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通產省工業技術院生命工業技術研究所(郵政編號305，日本國茨城縣つくば市未一街第一排3號)，以保藏號為FERM P-13890保藏，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根據布達佩斯條約由原保藏單位轉移為國際保藏單位，保藏號為FERM BP-4798。
用常規方法製備pMW∷THY質粒的DNA，用BamHI和HindIII切斷，以分離含有轉氫酶基因的3.0Kb DNA片段。另外，用BamHI和HindIII切斷具有氯黴素抗性標記的質粒載體pHSG 399(從寶酒造購入)，並分離大片段。使用DNA-連結酶連結轉氫酶基因的片段和pHSG 399的BamHI和HindIII大片段，以獲得pHSG∷THY質粒。
雖然pHSG∷THY質粒，在埃希氏桿菌屬細菌細胞內，能夠自主複製，但不能穩定地存在於棒狀桿菌細胞內，因此，從棒狀桿菌衍生的自主複製質粒中獲得複製起點，並將其引入質粒pHSG∷THY。
用BamHI酶切在棒狀桿菌細胞內能自主複製的質粒pHM 1519(參照專利申請昭和58-77895號公報)，得到含有複製起點的3.0Kb DNA片段。另一方面，得到用BamHI酶切pHSG∷THY質粒而成的DNA片段。用DNA-連結酶，連結兩DNA片段，製成質粒pHSG∷THYB(圖2)，含有此pHSG∷THYB的大腸桿菌，命名為AJ12872株。此菌株，於平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通產省工業技術院生命工業技術研究所(日本國茨城縣筑波市未一街第一排3號)保藏，保藏號為FERM P-13889，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根據布達佩斯條約，從原保藏單位移到國際保藏單位，保藏號為FERM BP-4797。
並且，將在埃希氏桿菌屬細菌細胞內能夠自主複製的質粒pSU 18，用限制酶BamHI和HindIII酶切(Borja，Bartolome et al.，Gene，102，75-78(1991))，得到大片段。用DNA連結酶，將此大片段與上述的含轉氫酶基因的3.0Kb DNA片段連結，製成質粒pSU∷THY(圖3)。含有此pSU∷THY的大腸桿菌，命名為AJ12930株。此菌株，平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通產省工業技術院生命工業技術研究所保藏，保藏號為FERM P-13891，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根據布達佩斯條約，從原保藏單位移至國際保藏單位，保藏號為FERM BP-4799。
已證明通過增加細菌中的轉氫酶活性，在埃希氏桿菌屬和棒狀桿菌的細菌細胞中對多種胺基酸的產率有何種影響。
實施例2 具有導入轉氫酶的菌株的L-蘇氨酸的發酵生產作為L-蘇氨酸大腸桿菌生產菌，到現在所知，B-3996(參照日本專利公開N0.3-501682(PCT))具有最高的生產能力，因此，對於評價轉氫酶的提高效果，可以將B-3996作為宿主以評價轉氫酶的提高效果，B-3996菌株含有質粒pVIC 40(InternationalPublication Pamphlet WO90/04636)。質粒pVIC 40是在含有鏈黴素抗性標記的廣泛宿主範圍的質粒載體pAYC 32(參見chistorerdov，A.Y.Tsgankov Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)中插入蘇氨酸操縱子而得到的。B-3996株，以保藏號RIA 1867保藏於USSR Antibiotics Research Institute(VNIIA)。
根據Maniatis的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，從實施例1中所得到的大腸桿菌AJ12929株中，回收pMW∷THY質粒，用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymo-logy，68，326(1979))在B-3996株中導入所得到的pMW∷THY質粒，命名為B-3996(pMW∷THY)。在以下條件下培養B-3996株和B-3996(pMW∷THY)。
使用含有表2記載的組成成份的培養基，培養時間為38小時，溫度為37℃，攪拌114-116rpm進行培養。如表2所示，分別製備A成份、B成份、C成份、殺菌、冷卻後，按A成份為16/20體積、B成份4/20體積、C成份30g/L的比例混合，培養結果用表3表示。對於L-蘇氨酸埃希氏桿菌屬細菌生產菌，根據細胞內的轉氫酶活性的增強，可以判明L-蘇氨酸的產率被改善。
表2 蘇氨酸生產培養基(g/l)(A) (NH4)2SO416KH2PO41MgSO47H2O 1FeSO47H2O 0.01MnSO45H2O 0.01Yeast Ext.(Difco) 2L-甲硫氨酸0.5用KOH調pH值為7.0並於115℃下高壓滅菌10分鐘(16/20體積)(B) 20％葡萄糖115℃下高壓10分鐘(4/20容體積)(C) 藥典CaCO3180℃下，乾熱2天(30g/l)抗生素(鏈黴素100μg/ml，卡那黴素5μg/ml)
表3菌株名 B-3996B-3996(pMW∷THY)蘇氨酸(g/l) 12.97 13.99實施例3 導入轉氫酶的菌株的L-賴氨酸的發酵生產對於L-賴氨酸生產棒狀桿菌，根據細胞內的轉氫酶活性的增強，可以確定L-賴氨酸產率是否被改善。作為棒狀桿菌的L-賴氨酸生產菌，可以使用乳糖發酵短桿菌AJ 3990(BrevibacteriumLactofermentum)。AJ 3990株從昭和52年2月8日起(1977年2月8日)，以保藏號ATCC 31269保藏於美國。類型，培養，收集，核對(American Type Culture Collection美國、馬裡蘭20852、羅克維爾、バクロニドライプ10301)、平成6年10月11日(1994年10月11日)，根據布達佩斯條約，從原保藏單位移交國際保藏單位，保藏號相同。
用Maniatis的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，從實施例1中所得到的大腸桿菌AJ 12872株中，回收pHSG∷THYB質粒，用電脈衝法(參照專利申請平成2-207791號公報)，將所得到的質粒導入AJ 3990。將導入pHSG∷THYB AJ 3990株命名為AJ 3990(pHSG∷THYB)。在如下的條件下，培養AJ 3990株和AJ 3990(pHSG∷THYB)。
使用含有表4記載的組成成份的培養基，培養時間為72小時，溫度為31.5℃，攪拌114-116rpm，進行培養。三種不同的糖，葡萄糖、蔗糖和果糖被用作糖源。培養結果用表5表示。己證明對於L-賴氨酸生產棒狀桿菌，通過提高細胞內轉氫酶活性而提高L-賴氨酸產率。
表4賴氨酸生產培養基糖 36 g/lNH4Cl 20 g/lKH2PO41 g/lMgSO47H2O 0.4g/lFeSO47H2O 10 mgMnSO47H2O 8 mg大豆蛋白水解物 1 mg(作為氮源)Thiamine-HCl 100mg生物素 300mg在115℃下高壓10分鐘後，添加3％分別殺菌的碳酸鈣表5賴氨酸鹽酸蓄積量(g/l)AJ 3990 AJ 3990(pHSG∷THYB)葡萄糖13.614.5蔗糖 11.112.6果糖 8.2 11.9實施例4 導入轉氫酶的菌株的苯丙氨酸的發酵生產對於苯丙氨酸生產埃希氏桿菌屬細菌，可以確認在細胞內的轉氫酶活性的增強之後，苯丙氨酸生產性是否被改善。作為埃希氏桿菌屬細菌的苯丙氨酸生產菌，可以使用大腸桿菌AJ 12604株。AJ 12604株具有質粒pBR-aroG以及質粒pACMAB。質粒pBR-aroG是在含有氨苄抗性標記的載體-質粒pBR 322中插入突變型aroG基因而得到的。質粒pACMAB是在含有氯黴素抗性標記的載體-質粒pALYC 184中插入突變型RheA基因而得到的(參照專利申請平成5-344881號公報)。AJ 12604株，平成3年1月28日(1994年1月28日)，以保藏號為FERM P-11975保藏於通產省工業技術院生命工業技術研究所，平成3年9月26日(1994年9月26日)，根據布達佩斯條約，從原保藏單位移交國際保藏單位，保藏號為FERM BP-3579。用Maniatis的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，從實施例1中所得到的大腸桿菌AJ 12930株中，回收pSU∷THY質粒，用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymo-l0gy，68，326(1979))在AJ 12604株中導入所得到的質粒。將導入pSU∷THY，AJ 12604株命名為AJ 12604(pSU∷THY)株。在以下條件下培養AJ 12604株和AJ 12604(pSU∷THY)。
使用含有表6中記載的組成成份的培養基，培養時間為16小時，溫度為37℃，攪拌114-116rpm進行培養。培養結果用表7表示。對於L-苯丙氨酸生產埃希氏桿菌屬細菌，根據細胞內的轉氫酶活性的增強，可以判明L-苯丙氨酸的產率被改善。
表6苯丙氨酸生產培養基g/l葡萄糖 20Na2HPO429.4KH2HPO46NaCl 1NH4Cl 2檸檬酸鈉 20L-穀氨酸單鈉 0.4MgSO47H2O 3CaCl20.23Thiamine-HCl 2mgL-酪氨酸 75mg在115℃下高壓10分鐘後，添加3％分別滅菌的碳酸鈣。
表7AJ 12604 AJ 12604(pSU∷THY)苯丙氨酸4.28 4.89蓄積量(g/l) 3.75 4.28在生產上利用的可能性依據本發明，在培養基中培養微生物，使目的物質在該培養基中蓄積，並取得這種目的物質，關於這個利用微生物製造目的物質的方法，用與傳統不相同的方法，能夠改善目的物質產率。
序列表(1)一般資料(i)申請人Ajinomoto Co.Inc.(ii)發明題目物質生產方法(iii)序列數2(iv)通訊地址(A)地址(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(F)郵編(vi)目前申請資料(A)申請號(B)提交日(C)分類(vii)先有申請資料(A)申請號(B)提交日(viii)律師/代理人信息(A)姓名(B)註冊號(C)查詢/案號(ix)電信信息(A)電話(B)電傳(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iii)假設無(xi)SEQ ID NO1序列描述CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG 24(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iii)假設無(xi)SEQ ID NO2序列描述CGTTCTGTTA AGCTTTCTCA ATAA 2權利要求
1.使用微生物生產目的物質的方法，包括步驟在培養基中培養微生物以在所述培養基中產生及蓄積目的物質，以及從所述培養基收集目的物質，其中所述微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸產率提高。
2.權利要求1的方法，其中所述目的物質是L-胺基酸。
3.權利要求2的方法，其中所述L-胺基酸選自L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸。
4.權利要求1或2的方法，其中所述微生物屬於埃希氏桿菌(Escherichia)屬。
5.權利要求1或2的方法，其中所述微生物是棒狀桿菌。
6.權利要求1-5之任一的方法，其中通過提高所述微生物細胞內的煙醯胺核苷酸轉氫酶的酶活性而提高所述微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率。
7.權利要求1-5之任一的方法，其中通過增加所述微生物細胞內的煙醯胺核苷酸轉氫酶編碼基因的表達數量來提高所述微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率。
8.權利要求1-5之任一的方法，其中通過增加所述微生物細胞內的煙醯胺核苷酸轉氫酶編碼基因的拷貝數來提高所述微生物的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率。
全文摘要
通過提高微生物細胞的還原型煙醯胺腺苷二核苷酸磷酸的產率，來提高微生物發酵中一些物質，例如L-胺基酸、抗生素、維生素、生長因子和生理活性物質的產率。
文檔編號C12N9/02GK1139956SQ9419470
公開日1997年1月8日 申請日期1994年10月26日 優先權日1993年10月28日
發明者児島宏之, 戶一彥 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (4),