新型抗-PD-L1抗體的製作方法
2023-06-04 11:48:27
本發明涉及新的抗PD-L1抗體。
背景技術：
越來越多的臨床前和臨床結果的證據表明，靶向免疫檢查點正在成為最有希望的治療癌症患者的方法。程序性細胞死亡分子1是免疫檢查點蛋白之一，其在限制T細胞活性中起主要作用，所述T細胞提供了主要的免疫抵抗機制，通過這種限制作用腫瘤細胞能夠躲過免疫監視。在活化的T細胞上表達的PD-1與在腫瘤細胞上表達的PD-L1的相互作用對免疫應答起負調節並減弱抗腫瘤免疫力。PD-L1在腫瘤上的表達與食管癌、胰腺癌和其它類型的癌症的生存率下降相關，突出了該通路可以作為新的有前途的腫瘤免疫治療靶點。製藥公司已經開發了多種針對PD-1通路的藥物，如百時美施貴寶公司(BMS)、默克公司、羅氏公司和葛蘭素史克(GSK)公司。臨床試驗的數據顯示了在各種腫瘤類型的患者中持久的臨床活性和良好的安全性的早期證據。Nivolumab是BMS開發的PD-1藥物，其正被投入到下一代領域的中心階段。目前在6個後期研究中，在研究的5個癌症組中的3個中，治療促使了腫瘤的縮小，其中包括72例肺癌患者中的18％，98例黑色素瘤患者中的接近三分之一和33例腎癌患者中的27％。由默克公司研製的lambrolizumab是人源化單克隆IgG4抗體，其作用於PD-1，其在針對皮膚癌獲得的令人印象深刻的IB數據後抓住了FDA的新突破指標。階段性IB研究的結果顯示在85例癌症患者中有51％的客觀的抗腫瘤反應，並在9％的患者中出現完全的反應。羅氏公司的實驗性MPDL3280A證明了其在140例攜帶各種大小的腫瘤的晚期癌症患者中縮小了29例(21％)患者的腫瘤。
然而，現有的治療方法不都是盡如人意的，因此仍然需要新的抗PD-L1的抗體。
發明簡述
本申請提供了新的抗PD-L1單克隆抗體、編碼其的多核苷酸和使用其的方法。
在一個方面，本申請提供了一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其能夠以不超過10-9M(例如，≤9x10-10M、≤8x10-10M、≤7x10-10M、≤6x10-10M、≤5x10-10 M、≤4x10-10M、≤3x10-10M、≤2x10-10M、or≤10-10M)的Kd值特異性地與人PD-L1結合，所述Kd值通過等離子共振結合法測定。
在某些實施方式中，所述的抗體或其抗原結合片段以不超過10nM(如不超過1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM或0.01nM)的EC50與猴PD-L1結合。在某些實施方式中，所述的抗體或其抗原結合片段不與小鼠PD-L1結合，但以人PD-L1相似的結合親和性與猴PD-L1結合。在某些實施方式中，所述的抗體或其抗原結合片段以不超過100nM(如不超過50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM或0.01nM)的IC50高效地抑制人或猴PD-L1與其受體(如PD-1)的結合。在某些實施方式中，所述EC50或IC50通過螢光激活的細胞分選(FACS)分析進行測定。
在某些實施方式中，所述的抗體或其抗原結合片段具有基本上減少的效應功能。在某些實施方式中，所述的抗體或其抗原結合片段不介導ADCC或CDC或兩者均不介導。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括重鏈CDR序列，所述序列選自：SEQ ID NO:1、2、3。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括輕鏈CDR序列，所述序列選自：SEQ ID NO:4、5、6。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的CDR。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的重鏈可變區。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6的輕鏈可變區。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的重鏈可變區；和如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或 SEQ ID NO:6的輕鏈可變區。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區，其中所述重鏈可變區選自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括輕鏈可變區，其中所述輕鏈可變區選自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括：
a)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:7；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:9；
b)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:11；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:13；
c)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:11；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:16；
d)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:18；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:13；
以及
e)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:18；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:22。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段包括例如2.74.15、2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7、和2.74.15.hAb8。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段與抗體2.74.15、2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7或2.74.15.hAb8競爭相同的表位。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段能夠阻斷人PD-L1與其受體結合，並且因此提供以下活性中的至少一個：
a)在CD4+T細胞中誘導IL-2的產生；
b)在CD4+T細胞中誘導IFNγ的產生；
c)誘導CD4+T細胞的增殖；以及
d)逆轉T reg抑制功能。
在某些實施方式中，本申請所述抗體是單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重 組抗體、雙特異抗體、標記抗體、雙價抗體或抗獨特型抗體。
在某些實施方式中，本申請中提供的抗原結合片段是駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds雙功能抗體(ds diabody)、納米抗體、域抗體或雙價域抗體。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段進一步包括免疫球蛋白恆定區。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段進一步包括綴合物。
在某些實施方式中，所述綴合物可以是可檢測標記、藥代動力學修飾部分或純化部分。
在另一方面，本申請提供了分離的多核苷酸，其編碼如本申請所述的抗體或其抗原結合片段。在某些實施方式中，本申請提供的多核苷酸編碼如本申請所述的抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列。在某些實施方式中，本申請提供了包括這些多核苷酸的載體。在某些實施方式中，本申請提供了表達本申請所述的一種或多種抗體或抗原結合片段的方法，其通過在載體中表達由多核苷酸編碼的抗體或抗原結合片段的條件下培養宿主細胞實現。在某些實施方式中，本申請提供的多核苷酸在載體中與啟動子如SV40啟動子可操作地連接。在某些實施方式中，包括本申請提供的載體的宿主細胞是中國倉鼠卵巢細胞，或293細胞。
在另一方面，本申請提供了包括本申請所述的抗體或其抗原結合片段的試劑盒。
在另一方面，本申請提供了在生物樣品中檢測PD-L1(例如人或猴)的存在情況或水平的方法，包括將所述生物樣品與本申請所述的抗體或其抗原結合片段接觸，並在所述樣品中確定人或猴PD-L1的存在情況或水平。
在另一方面，本申請提供了鑑別患有可能對PD-L1拮抗劑響應的病症或狀況的個體的方法，其包括：用本申請所述的抗體或其抗原結合片段在來自所述個體的待測生物樣品中確定PD-L1(例如人或猴)的存在情況或水平，其中在所述生物樣品中PD-L1的存在或水平上調表示響應的可能性。在某些實施方式中，所述方法進一步包括對所述個體施用有效量的本申請所述的抗體或其抗原結合片段，所述個體被鑑定患有可能對PD-L1拮抗劑響應的病症或狀況。
本申請進一步提供了在用PD-L1拮抗劑治療的受試者中監測治療反應或疾病進展的方法，其包括用本申請所述的抗體或其抗原結合片段在來自所述個體的待測生物樣品中確定PD-L1(例如人或猴)的存在情況或水平。
在另一方面，本申請提供了藥物組合物，包括本申請所述的抗體或其抗原結合片段以及一種或多種藥學上可接受的載體。在某些實施方式中，所述藥學載體可以是例如稀釋劑、抗氧化劑、輔劑、賦形劑或無毒的輔助物質。
在另一方面，本申請提供了治療會從上調的免疫響應獲益的受試者的狀況的方法，包括對所述受試者施用有效量的本申請所述的抗體或其抗原結合片段。在某些實施方式中，所述受試者具有上調的PD-L1表達。
在另一方面，提供了本申請所述的抗體或其抗原結合片段在製備用於治療會從上調的免疫響應中獲益的狀況的藥物中的用途。在某些實施方式中，所述狀況是癌症或慢性病毒感染。
附圖簡述
圖1顯示了FACS分析測定的鼠科抗-人PD-L1抗體與表達PD-L1的CHO細胞的結合。EC50以nM表示。
圖2顯示了FACS分析測定的人源化的PD-L1抗體與表達PD-L1的CHO細胞的結合。
圖3顯示了FACS分析測定的人源化的PD-L1抗體與表達PD-L1的活化的樹突細胞(DC)細胞的結合。EC50以nM表示。
圖4顯示了FACS分析測定的人源化的PD-L1抗體阻斷了PD-1與轉染了PD-L1的CHO細胞的結合。EC50以nM表示。
圖5顯示了FACS分析測定的人源化的PD-L1抗體與PD-L1特異性結合，而不與PD-L2結合。
圖6顯示了PD-L1抗體與食蟹猴PD-L1結合。EC50以nM表示。
圖7顯示了PD-L1抗體與人PD-L1結合親和性的完整動力學。
圖8顯示了在混合的淋巴細胞反應(MLR)中人源化抗-PD-L1抗體對IL-2的生產的影 響。
圖9顯示了在MLR中人源化抗-PD-L1抗體對IFNγ的生產的影響。
圖10顯示了在MLR中人源化抗-PD-L1抗體促進T細胞增殖。
圖11顯示了人源化PD-L1抗體在特異性T細胞響應中增加了IFNγ的產生。所述特異性T細胞響應是由巨細胞病毒(CMV)特異性T細胞與負載CMV-pp65肽的DC共培養5天產生的。
圖12顯示了人源化PD-L1抗體在特異性T細胞響應中促進T細胞增殖。
圖13顯示了抗PD-L1抗體逆轉了Treg抑制功能。
圖14顯示了抗PD-L1抗體在mDC中缺少ADCC。
圖15顯示了抗PD-L1抗體在活化的T細胞中缺少CDC。
發明詳述
本申請的以下描述只為說明本申請的多種實施方式。因此，此處討論的具體修改方式不應理解為對申請範圍的限制。本領域的技術人員在不偏離本申請範圍的情況下即可很容易地得出多種等同方式，變化和修改，應理解這樣的等同實施方式包括在本發明範圍內。在本申請中引用的所有文獻，包括公開出版物、專利和專利申請都通過引用的方式全文併入。
定義
本發明中的「抗體」一詞包括任意可結合某特定抗原的免疫球蛋白、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體或雙特異性(雙價)抗體。一個天然的完整抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈由一可變區和第一、第二、第三恆定區組成；每條輕鏈由一可變區和一恆定區組成。哺乳動物的重鏈可分為α、δ、ε、γ和μ，哺乳動物的輕鏈可分為λ或κ。抗體呈「Y」型，「Y」型結構的頸部由兩條重鏈的第二和第三恆定區組成，其通過二硫鍵結合。「Y」型結構的每條臂包括其中一條重鏈的可變區和第一恆定區，其與一條輕鏈的可變區和恆定區結合。輕鏈和重鏈的可變區決定抗原的結合。每條鏈的可變區均含有三個高變區，稱互補決定區(CDR)(輕鏈(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中公開的抗體和抗原結合片段的CDR邊界可通過Kabat，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別。(Al-Lazikani, B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。其中，三個CDR由被稱為框架區(FR)的側面連續部分間隔開，框架區比CDR更加高度保守並形成一個支架支撐超變環。重鏈和輕鏈的恆定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據重鏈恆定區的胺基酸序列可以分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ和μ重鏈，抗體可分別分為五個主要的分類或異構體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。幾個主要的抗體分類還可分為亞類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)等。
本申請中的「抗原結合片段」一詞，指由含有一個或多個CDR的抗體部分或者任何其他結合抗原但不具有完整抗體結構的抗體片段所形成的一種抗體片段。抗原結合片段的例子包括，但不限於，如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、雙價單鏈抗體(BsFv)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、納米抗體、域抗體和雙價域抗體。抗原結合片段可以與母體抗體結合相同的抗原。在某些實施方式中，抗原結合片段可以含有來自某特定人抗體的一個或多個CDR，移接至來自一個或多個不同人抗體的框架區。
抗體的「Fab」片段是指由一條輕鏈(包括可變區和恆定區)和一條重鏈的可變區和恆定區經二硫鍵結合起來的那部分抗體分子。
「Fab'」片段是指包含了部分鉸鏈區的Fab片段。
「F(ab')2」指的是Fab的二聚體。
抗體的「Fc」指的是由重鏈的第二、第三恆定區經二硫鍵結合組成的那部分抗體。抗體的Fc段負責多種不同的效應功能如ADCC和CDC，但不參與抗原的結合。
抗體的「Fv」段指的是含有完整抗原結合位點的最小抗體片段。Fv片段由一條輕鏈的可變區和一條重鏈的可變區組成。
「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相連或通過一個肽鏈連接而成的工程抗體(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA,85:5879(1988))。
「單鏈抗體Fv-Fc」或「scFv-Fc」是指由連接到某抗體Fc段的scFv組成的工程抗體。
「駱駝化單域抗體(Camelized single domain antibody)」、「重鏈抗體」或「HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)」都是指含有兩個VH域而不含有輕鏈的抗體(Riechmann L.和Muyldermans S.,J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.Patent No.6,005,079)。重鏈抗體最初從駝科(駱駝、單峰駝和美洲駝)衍生得到。雖然缺失輕鏈，駱駝化抗體(camelized antibodies)有確證的抗原結合全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，「Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation,」Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重鏈抗體的可變區(VHH域)是最小的已知的獲得性免疫產生的抗原結合單位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007Jun 15(2007))。
「納米抗體」是指一種抗體片段，其由一個來自重鏈抗體的VHH域和兩個恆定區CH2和CH3組成。
「雙功能抗體(diabody)」包括帶有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其中該片段含有在同一條多肽鏈上相連的VH域和VL域(VH-VL或VH-VL)(請參見，Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci U S A.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。兩個域之間銜接物很短，使同一條鏈上的兩個域不能互相配對，從而迫使兩個域與另一條鏈的互補域配對，形成兩個抗體結合位點。這兩個抗體結合位點可靶向結合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
「域抗體」是指僅含有一條重鏈可變區或一條輕鏈可變區的抗體片段。在某些情況下，兩個或多個VH域由一個多肽銜接物共價結合併形成雙價域抗體。雙價域抗體的兩個VH域可靶向作用於相同或不同的抗原。
在某些實施方式中，「(dsFv)2」含有三條肽鏈：兩個VH基團間通過一條多肽銜接物相連，並通過二硫鍵與兩個VL基團結合。
在某些實施方式中，「雙特異性ds雙功能抗體」含有VL1-VH2(由一個多肽銜接物相連)和VH1-VL2(也是由一個多肽銜接物相連)，兩者在VH1和VL1間通過二硫鍵結合。
「雙特異性dsFv」或「dsFv-dsFv」含有三條多肽鏈：VH1-VH2基團，其中兩者的重鏈通過多肽銜接物(如：長的彈性銜接物)相連，並通過二硫鍵分別與VL1和VL2基團結合，每對通過二硫鍵配對的重鏈輕鏈具有不同的抗原特異性。
在某些實施方式中，「scFv二聚體」是雙價雙功能抗體或雙價單鏈抗體(BsFv)，含有二聚化的兩個VH-VL(由多肽銜接物連接)基團，其中一個基團的VH與另一個基團的VL協作形成兩個結合位點，這兩個結合位點可靶向結合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些實施方式中，「scFv二聚體」是雙特異性雙功能抗體，含有相互連接的VL1-VH2(由多肽銜接物連接)和VH1-VL2(由多肽銜接物連接)，其中VH1和VL1協作，VH2和VL2協作，且每個協作的配對具有不同的抗原特異性。
本申請中使用的術語「人源化」當用於抗體或抗原結合片段時，是指包括來源於非人動物的CDR、來源於人的FR區，以及來源於人的恆定區(當適用時)的抗體或抗原結合片段。由於人源化的抗體或抗原結合片段具有降低的免疫原性，其在某些實施方式中可用作人的治療劑。在一些實施方式中，所述非人動物是哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。在一些實施方式中，所述人源化抗體或抗原結合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列組成。在一些實施方式中，所述來源於人的FR區可以包括與其來自的人源抗體相同的胺基酸序列，或其可以包括一些胺基酸改變，例如，不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸改變。在一些實施方式中，該胺基酸改變可以僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區或同時存在於兩個鏈中。在一些優選實施方式中，所述人源化抗體包括人源FR1-3和人源JH和Jκ。
本申請中使用的術語「嵌合」是指具有來源於一種物種的重鏈和/或輕鏈的一部分，和所述重鏈和/或輕鏈其餘部分來源於不同物種的抗體或抗原結合片段。在一個示例性的例子中，嵌合抗體可以包括來源於人的恆定區和來源於非人動物例如小鼠的可變區。
本申請中使用的「PD-L1」是指程序性細胞死亡配體1(PD-L1,參見例如Freeman et al.(2000)J.Exp.Med.192:1027)。代表性的人源PD-L1的胺基酸序列為NCBI登記號:NP_054862.1，且代表性的人源PD-L1的核酸序列為NCBI登記號:NM_014143.3。PD-L1表達於胎盤，脾，淋巴結，胸腺，心臟，胎兒肝臟，並且還發現存在於許多腫瘤或癌細 胞上。PD-L1與在活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞上表達的受體PD-1或B7-1結合。PD-L1與其受體的結合可引發信號轉導來抑制TCR介導的對細胞因子生產的激活和T細胞增殖。因此，PD-L1在特定事件中，例如在懷孕、自身免疫性疾病、組織移植中對抑制免疫系統起著主要作用，並且其被認為允許腫瘤或癌細胞規避免疫檢查點並逃避免疫應答。
本申請中使用的「抗-PD-L1抗體」是指能夠以足以提供診斷和/或治療用途的親和性與PD-L1(例如人或猴PD-L1)特異性結合的抗體。
本申請中的「特異性結合」或「特異性的結合」是指，指兩分子間的非隨機結合反應，如抗體和抗原間的反應。在某些實施方式中，本申請的抗體或其抗原結合片段與人PD-L1特異性結合，並且其結合親和力(KD)≤10-6M(如：≤5x10-7M，≤2x10-7M，≤10-7M，≤5x10-8M，≤2x10-8M，≤10-8M，≤5x10-9M，≤2x10-9M，≤10-9M，≤10-10M)。本申請中的KD是指解離速度與結合速度的比值(koff/kon)，可通過表面等離子共振的方法測定，例如使用如Biacore的儀器。
本申請中的「阻斷結合」或「競爭性同樣的表位」的能力是指抗體或其抗原結合片段將兩個分子間結合(例如人PD-L1和抗-PD-L1抗體)的相互作用抑制到任何可檢測的程度的能力。在某些實施方式中，阻斷兩個分子間結合的抗體或抗原結合片段可將兩個分子間結合的相互作用抑制至少50％。在某些實施方式中，這樣的抑制作用可以大於60％，大於70％，大於80％，或大於90％。
本申請中使用的「表位」是指抗原分子中與抗體結合的那部分胺基酸或原子基團。如果兩種抗體表現出對抗原的競爭性結合，則可能結合抗原上的相同表位。例如，如果本申請提供的抗體或其抗原結合片段阻斷示例抗體，例如2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8與人PD-L1的結合，那麼所述抗體或其抗原結合片段可以被認為與那些示例的抗體結合相同的表位。
本申請所述「2.74.15」是指鼠科單克隆抗體，其包括分別由SEQ ID NO：1、2和3組成的3個重鏈CDR，以及分別由4、5和6組成的3個輕鏈CDR。
本申請中使用的「2.74.15.hAb4」是指具有如SEQ ID NO:7所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO:9所示的輕鏈可變區和人源IgG4同種型恆定區的人源化抗體。
本申請中使用的「2.74.15.hAb5」是指具有如SEQ ID NO:11所示的重鏈可變區、如 SEQ ID NO:13所示的輕鏈可變區和人源IgG4同種型恆定區的人源化抗體。
本申請中使用的「2.74.15.hAb6」是指具有如SEQ ID NO:11所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO:16所示的輕鏈可變區和人源IgG4同種型恆定區的人源化抗體。
本申請中使用的「2.74.15.hAb7」是指具有如SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO:13所示的輕鏈可變區和人源IgG4同種型恆定區的人源化抗體。
本申請中使用的「2.74.15.hAb8」是指具有如SEQ ID NO:18所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO:22所示的輕鏈可變區和人源IgG4同種型恆定區的人源化抗體。
在本申請中當「保守替代」用於胺基酸序列時，是指將一個胺基酸殘基用另一個具有相似理化性質的側鏈的胺基酸殘基替代。例如，可以在疏水側鏈胺基酸殘基間(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、中性親水側鏈殘基間(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)、酸性側鏈殘基間(例如Asp、Glu)、鹼性側鏈胺基酸間(例如His、Lys和Arg)或方向側鏈殘基間(例如Trp、Tyr和Phe)進行保守替代。本領域已知保守替代通常不會引起蛋白構象結構的顯著變化，因此能夠保留蛋白質的生物活性。
當「百分比序列同一性」用於胺基酸序列(或核酸序列)時，是指在進行序列比對，並且必要時引入間隔使相同胺基酸(或核酸)數目達到最多後，在候選序列中，與參比序列相同的胺基酸(或核酸)殘基佔所述候選序列的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。所述胺基酸殘基的保守替代可以認為或可以不認為是相同殘基。可以通過本領域公開的工具，例如BLASTN,BLASTp(美國國家生物技術信息中心網站(NCBI)，也可參見，Altschul S.F.等、J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(歐洲生物信息研究所網站，可參見，Higgins D.G.等，Methods in Enzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，對序列進行比對以確定胺基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本領域技術人員可以使用所述工具的默認參數或根據比對的需要適當調整參數，例如通過挑選合適的算法。
本申請中使用的「T細胞」包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、T輔助1型T細胞、T輔助2型T細胞、T輔助17型T細胞和抑制性T細胞。
本申請中使用的「效應功能」是指抗體的Fc區與其效應器例如C1複合物和Fc受體結合的生物活性。示例性的效應功能包括抗體與C1複合物上的C1q相互作用誘導的 補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體的Fc區與效應細胞上的Fc受體結合誘導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)以及吞噬。
本申請中的「癌症」或「癌狀態」是指任何由腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移所介導，並引發實體瘤和非實體瘤如白血病的醫學狀態。本發明中的「腫瘤」是指腫瘤和/或惡性細胞的實體物質。
對某種狀態的「治療」或「療法」包括預防或減輕某種狀態，降低某種狀態興起或發展的速度，減少發展出某種狀態的風險，預防或延遲與某種狀態相關的症狀發展，減少或終止與某種狀態相關的症狀，產生某種狀態的完全或部分的逆轉，治癒某種狀態，或以上的組合。對於癌症來說，「治療」或「療法」可以指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞生長，繁殖，或轉移，或以上的某些組合。對於腫瘤來說，「治療」或「療法」包括清除全部或部分的腫瘤，抑制或減緩腫瘤生長和轉移，預防或延緩腫瘤的發展，或以上的某些組合。
「被分離」的物質已經經人工由自然狀態改變。如果自然界中出現某種「被分離」的物質或成分，那麼其已經被改變或脫離其原始狀態，或二者均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在的多核苷酸或多肽是未被分離的，但如果這些多核苷酸或多肽與之在天然狀態下共存的物質足夠分離並以足夠純的狀態存在，則可以認為是「被分離」。在某些實施方式中，抗體和抗原結合片段的純度為至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其由電泳方法(如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)，或色譜法(如離子交換色譜或反相HPLC)確定。
本發明中「載體」是指，可將編碼某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中並使該蛋白獲得表達的一種運載工具。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內得以表達。舉例來說，載體包括：質粒、噬菌粒、柯斯質粒、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生的人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體，以及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。載體可含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還可包括協助其進入細胞的成分，包括但不限於，病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。
本發明中「宿主細胞」是指導入外源多核苷酸和/或載體的細胞。
本發明中的「與PD-L1相關或有關聯的疾病」是指，任何由於PD-L1(如：人PD-L1)表達或活性升高或降低而導致、加劇或其他相關的狀態。
本發明中的「治療有效量」或「有效劑量」是指，某種藥物有效治療與人PD-L1相關疾病或狀態的劑量或濃度。例如，對於本發明中公開的抗體或其抗原結合片段的用途來說，治療有效量是在該劑量或濃度下，該抗體或抗原結合物可以清除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長、抑制介導癌狀態的細胞的生長或繁殖、抑制腫瘤細胞轉移、減輕任何與腫瘤或癌狀態相關的症狀或標記，預防或延緩腫瘤或癌狀態的發展，或以上的某些組合。
「藥用可接受的」是指所指的載劑、溶媒、稀釋劑、輔料和/或鹽，總的來說在化學上和/或在物理上與製劑中的其他配料相兼容，並在生理上與接受者相兼容。
抗-PD-L1抗體
在一個方面，本發明提供了抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段。PD-1，也稱為B7-1，是已知的由活化T細胞表達的關鍵免疫檢查點受體，其調節免疫抑制作用。PD-1配體1(PD-L1)是表達在多種腫瘤細胞、基質細胞或兩者上的40kDa的跨膜蛋白，其與PD-1結合。已知PD-1和PD-L1間的相互作用能夠提高T細胞應答由此介導抗癌活性。
在某些實施方式中，本申請提供了示例性的鼠科單克隆抗體2.74.15，其CDR序列如表1中所示。
表1
在某些實施方式中，本申請提供了示例性的人源化抗體2.74.15，包括：2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8，其重鏈或輕鏈可變區氨基 酸序列和編碼核酸序列如下所示。
2.74.15.hAb4-VH(SEQ ID NO:7為胺基酸SEQ ID NO:8為核酸)：
V區段：IGHV4-59*01
D區段：IGHD3-16*01
J區段：IGHJ1*01
2.74.15.hAb4-VL(SEQ ID NO:9為胺基酸SEQ ID NO:10為核酸)：
V區段：IGKV1-27*01
J區段：IGKJ2*01
2.74.15hAb5-VH(SEQ ID NO:11為胺基酸SEQ ID NO:12為核酸)：
V區段：IGHV4-59*06
D區段：IGHD1-26*01
J區段：IGHJ1*01
2.74.15hAb5-VL(SEQ ID NO:13為胺基酸SEQ ID NO:14為核酸)：
V區段：IGKV1-9*01
J區段：IGKJ2*01
2.74.15hAb6-VH(SEQ ID NO:11為胺基酸SEQ ID NO:15為核酸)：
V區段：IGHV4-59*06
D區段：IGHD1-26*01
J區段：IGHJ1*01
2.74.15hAb6-VL(SEQ ID NO:16為胺基酸SEQ ID NO:17為核酸)：
V區段：IGKV1-27*01
J區段：IGKJ2*01
2.74.15hAb7-VH(SEQ ID NO:18為胺基酸SEQ ID NO:19為核酸)：
V區段：IGHV4-59*01
D區段：IGHD3-16*01
J區段：IGHJ1*01
2.74.15hAb7-VL(SEQ ID NO:13為胺基酸SEQ ID NO:20為核酸)：
V區段：IGKV1-9*01
J區段：IGKJ2*01
2.74.15hAb8-VH(SEQ ID NO:18為胺基酸SEQ ID NO:21為核酸)：
V區段：IGHV4-59*01
D區段：IGHD3-16*01
J區段：IGHJ1*01
2.74.15hAb8-VL(SEQ ID NO:22為胺基酸SEQ ID NO:23為核酸)：
V區段：IGKV1-27*01
J區段：IGKJ2*01
在一些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括重鏈CDR序列，所述序列選自：SEQ ID NOs:1、2和3。在一些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括輕鏈CDR序列，所述序列選自：SEQ ID NOs:4、5和6。
在一些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括重鏈可變區，其中所述重鏈可變區包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。
在一些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括輕鏈可變區，其中所述輕鏈可變區包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6。
在一些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括其包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的重鏈可變區；和如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6的輕鏈可變區。
本領域技術人員應理解可以將表1中提供的CDR序列進行修飾以包含一個或更多胺基酸的取代，由此得到提高的生物學活性例如提高的與人PD-L1的結合親和性。例如，可以利用噬菌體展示技術生產並表達抗體變體庫(例如Fab或FcFv變體)，隨後篩選與人PD-L1有親和性的抗體。另一個例子中，可以用計算機軟體模擬所述抗體與人PD-L1的結合併鑑別抗體上形成結合界面的胺基酸殘基。可以避免這些殘基的替代以防止結合親和性降低，或可以靶向這些殘基進行替代以形成更強的結合。在某些實施方式中，CDR序列中的至少一個(或全部)取代是保守替代。
在某些實施方式中，所述抗體和抗原結合片段包括一個或多個CDR序列，這些序列具有與表1中所列的序列至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列一致性，並且同時保留了與其親本抗體相似或甚至高於其的與人PD-L1的結合親和性，所述親本抗體具有基本相同的序列，但其相應的CDR序列與表1所列的序列具有100％序列一致性。
在某些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段是人源化的。所述人源化抗體與其人源化前的親本抗體相比在人體中具有降低的免疫原性，但保留了親本抗體的結合親和性。某些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括非人源CDR序列、人源框架區和任選地人源恆定區。某些實施方式中，在所述人源框架區中用CDR序列源自的非人源抗體(例如小鼠框架區)的一個或多個胺基酸殘基取代，例如以提高或保留結合親和性。
在一些實施方式中，所述人源化抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括重鏈可變區，其中所述重鏈可變區選自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18，和與之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的同源序列；和/或輕鏈可變區，其中所述輕鏈可變區選自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22，和與之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的同源序列。這些人源化抗體保留了與人PD-L1的結合親和性，優選地與示例性抗體：2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8的水平相似。
在一些實施方式中，所述人源化抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段包括a)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:7；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:9；b)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:11；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:13；c)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:11；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:16；d)重鏈可變區，其包括SEQ IDNO:18；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:13；以及e)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:18；和輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:22。
本申請還考慮了與本申請抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段競爭相同表位的抗體和其抗原結合片段。在某些實施方式中，所述抗體以低於10-6M、低於10-7M、低於10-7.5M、低於10-8M、低於10-8.5M或低於10-9M或低於10-10M的IC50值(即半數抑制濃度)阻斷2.74.15，2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7或
2.74.15.hAb8與人或猴PD-L1的結合。IC50值通過競爭性測試例如ELISA測定，放射性配體競爭結合測定法，和FACS分析確定。
在一些實施方式中，本申請所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段能夠以≤10-6M(e.g.,≤5x10-7M,≤2x10-7M,≤10-7M,≤5x10-8M,≤2x10-8M,≤10-8M,≤5x10-9M, ≤2x10-9M,≤10-9M,10-10M)的結合親和性(Kd)與人PD-L1特異性結合，其通過等離子共振結合法測量。結合親和性可以用KD值表示，其通過當抗原和抗原結合分子的結合達到平衡時的解離速率與結合速率的比值(koff/kon)計算得到。所述抗原結合親和性(例如KD)可以通過本領域已知的適宜方法適宜地確定，所述方法包括使用儀器如如Biacore的等離子共振結合法(參加例如Murphy,M.et al,Current protocols in protein science,Chapter 19,unit 19.14,2006)。
在某些實施方式中，本申請所述抗體和其抗原結合片段與人PD-L1以0.02nM-100nM(例如0.02nM-50nM、0.02nM-30nM、0.02nM-20nM或0.02nM-10nM、0.02nM-1nM或0.02nM-0.1nM)的EC50(即半數結合濃度)結合。所述抗體與人PD-L1的結合可以通過本領域已知的方法如夾心法如ELISA，Western印跡，FACS或其他結合試驗測定。在示例性的例子中，將待測抗體(即一抗)與固定化的人PD-L1或表達人PD-L1的細胞結合，隨後洗掉未結合抗體，引入標記的二抗，其能夠與一抗結合因此能夠檢測出結合的一抗。當使用固定化的PD-L1時可在酶標儀板上進行所述檢測，或當使用表達人PD-L1的細胞時可使用FACS分析進行所述檢測。
在某些實施方式中，本申請所述抗體和其抗原結合片段以0.2nM-100nM(例如0.2nM-50nM、0.2nM-30nM、0.2nM-20nM或0.2nM-10nM)的IC50抑制人PD-L1與其受體的結合，其通過競爭性測試測得。
在某些實施方式中，本申請所述抗體和其抗原結合片段抑制人PD-L1與其受體的結合，並由此提供了包括例如誘導活化的T細胞產生細胞因子(如CD4+T細胞和CD8+T細胞)、誘導活化的T細胞的增殖(如CD4+T細胞和CD8+T細胞)和逆轉調節性Treg的抑制性功能的生物學活性。示例性的細胞因子包括IL-2和IFNγ。術語「IL-2」是指白細胞介素2，其是細胞因子信號傳導分子，在免疫系統中調節的白血細胞(例如白細胞)的活性的。術語「幹擾素γ(IFNγ)」是由天然殺傷(NK)細胞，NK T細胞，CD4+和CD8+T細胞產生的細胞因子，其是巨噬細胞的重要的活化劑和主要組織相容性複合物誘導體(MHC)分子表達的誘發劑。細胞因子的產生可以通過本領域已知的方法確定，如ELISA。這些方法也可以用來檢測T細胞增殖，包括[3H]胸苷摻入測定。
所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段是人PD-L1特異性的。在某些實施方式 中，所述抗體和其抗原結合片段不與PD-L2結合(如人PD-L2)。例如，與PD-L2的結合親和性比人PD-L1的結合親和性的15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％還要低。
在某些實施方式中，所述抗體和其抗原結合片段以不高於10nM，例如，不高於1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM或0.01nM的EC50(通過ELISA測定)與猴PD-L1結合。
在某些實施方式中，所述抗體和其抗原結合片段不與鼠PD-L1結合，但與猴PD-L1以與人PD-L1相似的結合親和性結合。例如，示例性抗體2.74.15，2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7或2.74.15.hAb8與鼠PD-L1的結合用常用結合測定如ELISA或FACS分析無法檢出，而ELISA或FACS檢測出這些抗體與猴PD-L1以與人PD-L1相似的親和性或EC50值結合。
在一些實施方式中，所述的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段具有降低的或耗竭的效應功能。在一些實施方式中，所述的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段具有IgG4同種型的恆定區，其具有降低的或耗竭的效應功能。例如ADCC和CDC等效應功能能夠導致對表達PD-L1的細胞的細胞毒性。許多細胞包括健康或正常的細胞能夠表達PD-L1。為了避免對這些健康或正常的可能的不需要的毒性，本發明所述的抗體和其抗原結合片段的某些實施方式具有降低的或甚至耗竭的效應功能。已知有許多測試用來估測ADCC或CDC活性，例如Fc受體結合試驗、補體C1q結合實驗和細胞裂解法，本領域技術人員能夠容易選擇。不希望受到理論的束縛，但據信具有降低的或耗竭的效應功能如ADCC和CDC的抗體不會引起PD-L1表達細胞(例如那些健康或正常的細胞)的細胞毒性或將之降低到最小程度，因此避免了不需要的副作用。而與此同時，表達PD-L1的腫瘤細胞會與抗-PD-L1抗體結合，因此無法逃過免疫檢查點，由此其可被識別出並被免疫系統消除。
本申請所述的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段可以是單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、標記抗體、二價抗體或抗獨特型抗體。重組抗體是在體外使用重組方法而非動物製備的抗體。雙特異性抗體或雙價抗體是具有兩種不同的單克隆抗體的片段的人工抗體，其能結合兩種不同的抗原。「二價」的抗體和其抗原結合片段包括兩個抗原結合位點。兩個抗 原結合位點可以結合相同抗原，或者可以各自結合到不同的抗原，在這種情況下，抗體或抗原結合片段為「雙特異性」。
在一些實施方式中，本申請所述的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段是駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds雙功能抗體(ds diabody)、納米抗體、域抗體或雙價域抗體。
在一些實施方式中，本申請所述的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段進一步包括免疫球蛋白恆定區。在一些實施方式中，免疫球蛋白恆定區包括重鏈和/或輕鏈恆定區。所述重鏈恆定區包括CH1、CH1-CH2或CH1-CH3區。在一些實施方式中，免疫球蛋白恆定區可以進一步包括一個或多個修飾以獲得所需的性質。例如，可以將所述恆定區修飾以降低的或耗竭一種或多種效應功能以增強FcRn受體結合或引入一個或多個半胱氨酸。
在某些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體及其抗原結合片段進一步包含綴合物。可以設想，本發明中的抗體或其抗原結合片段可與多種綴合物連接(見例如"Conjugate Vaccines"、Contributions to Microbiology and Immunology、J.M.Cruse and R.E.Lewis、Jr.(eds.)、Carger Press、New York、(1989))。這些綴合物可以通過共價結合、親和結合、嵌入、同等結合(coordinate binding)、絡合、結合、混合或加入等其他方式與所述抗體或抗原結合物連接。在某些實施方式中，本發明公開的抗體和抗原結合片段可以通過工程的方法使其含有表位結合部分以外的特定位點，這些位點可用來結合一種或多種綴合物。例如，這樣的位點可包含一種或多種反應性胺基酸殘基，例如半胱氨酸殘基和組氨酸殘基，用於協助與結合物的共價連接。在某些實施方式中，抗體可間接連於綴合物，或通過另一個綴合物相連。例如，所述抗體或其抗原結合片段可結合生物素，然後間接結合第二個綴合物，其與親和素相連。所述綴合物可以是可檢測的標記、藥代動力學修飾部分、純化部分或細胞毒性部分。可檢測的標記的例子可以包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、丹醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-底物標記物(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如、123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi、and 32P、 其他鑭系元素、發光標記)、發色團部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或金以進行檢測。在某些實施方式中，所述綴合物可以是藥代動力學修飾部分如PEG，其幫助延長抗體的半衰期。其他適宜的聚合物包括例如羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些實施方式中，所述綴合物可以是純化部分例如磁珠。「細胞毒性部分」可以是對細胞有害的或可能損壞或殺死細胞的任何試劑。細胞毒性部分的示例包括，但不限於，紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米託蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C和順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(以前的道諾黴素)和阿黴素)、抗生素(例如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素和氨茴黴素(AMC))以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼和長春鹼)。
多核苷酸和重組方法
本申請提供了編碼抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段的分離的多核苷酸。在某些實施方式中，所述分離的多核苷酸包括一個或多個編碼如表1中的CDR的序列，例如那些在編碼可變區的多核苷酸序列中提供的序列。
在一些實施方式中，所述分離的多核苷酸編碼重鏈可變區並包括選自下組的序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21，以及與之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列一致性的同源序列。在一些實施方式中，所述分離的多核苷酸編碼輕鏈可變區並包括選自下組的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23，以及與之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列一致性的同源序列。在某些實施方式中，所述一致性的百分比是源自遺傳密碼的簡併性，而編碼的蛋白序列保持不變。
使用本領域公知的重組技術，可以將包括編碼所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段(例如包括表1所示的序列)的多核苷酸的載體引入宿主細胞用於克隆(擴增DNA)或基因表達。在另一實施方式中，所述抗體可通過本領域公知的同源重組的方法製得。編碼所述單克隆抗體的DNA可以通過常規的方法分離和測序(如可以使用寡核苷酸探針，該探針可特異性與編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的基因結合)。多種載體可供選擇。載體組分通常包括，但不限於，以下的一種或多種：信號序列、複製起始點、一種或多種標記基因、增強序列、啟動子(例如：SV40,CMV,EF-1α)和轉錄終止序列。
在一些實施方式中，所述載體系統包括哺乳動物、細菌、酵母系統等，並將包括質粒例如但不限於pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO,pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2等其他可從實驗室獲得或市售的載體。適宜的載體可以包括質粒或病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
可以將包括編碼所述抗體和其抗原結合片段的多核苷酸的載體引入宿主細胞用於克隆或基因表達。本發明中適用於克隆或表達所述載體中的DNA的宿主細胞為原核細胞、酵母或上述高級真核細胞。適用於本發明用途的原核細胞包括真細菌如，革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，例如，腸桿菌科，如，大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷白氏桿菌屬，變形桿菌屬，沙門氏菌屬，如，鼠傷寒沙門(氏)桿菌，沙雷氏菌屬，如，粘質沙雷氏菌，以及志賀氏菌屬，及桿菌屬如，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，假單胞菌如，綠膿桿菌和鏈黴菌。
除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也可作宿主細胞克隆或表達編碼抗PD-L1抗體的載體。釀酒酵母，或麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬、種和株都比較常用且在本發明中適用，如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬宿主如，乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(ATCC 24,178)、克魯雄酵母(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(EP 183,070)；假絲酵母；裡氏木黴(EP 244,234)；鏈孢黴；西方許旺酵母， 如：西方許旺酵母；和絲狀真菌，如：脈孢菌、青黴菌、彎頸黴和麴黴菌，如：鉤巢麴黴和黑麴黴。
本發明中提供的適用於表達糖基化抗體或其抗原結合片段的宿主細胞由多細胞生物衍生得到。無脊椎細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已發現多種杆狀病毒株(baculoviral strains)及其變體以及對應的許可性昆蟲宿主細胞(permissive insect host cells)，來自於諸如以下的宿主：草地夜蛾(毛蟲)、埃及斑蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)及家蠶。多種用於轉染的病毒株為公眾可得，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒和家蠶核型多角體病毒的Bm-5變種，這些病毒都可在本發明中使用，特別是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、西紅柿和菸草的植物細胞培養也可用作宿主。
但是，最感興趣的是脊椎細胞，且脊椎細胞的培養(組織培養)已經成為常規操作。可用的哺乳動物宿主細胞實例有，SV40轉化的猴腎細胞CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎腎細胞系(293或懸浮培養的293細胞亞克隆，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼地鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睪丸支持細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系(Hep G2)。在某些優選的實施方式中，所述宿主細胞是293F細胞。
用上述的可產生抗PD-L1抗體的表達或克隆載體轉化宿主細胞，並將其在常規的營養培養基中培養，所述營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列的基因。
本發明中用於產生所述抗體或其抗原結合片段的宿主細胞可在多種培養基中培養。市售的培養基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用於培養所述宿主細胞。另外，任何在Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255 (1980),美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利申請Re.30,985中說明的培養基都可以用作所述宿主細胞的培養基。這些培養基都可添加必要的激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂和磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大黴素)、微量元素(定義為終濃度通常在微摩爾範圍無機化合物)，和葡萄糖或與之等同的能量源。所述培養基還可含有本領域公知的適當濃度的任何其他必要的添加劑。所述培養基的條件，如溫度、pH值等類似條件，為選擇用於表達的宿主細胞此前所使用的條件，為普通技術人員所熟知。
在使用重組技術時，所述抗體可在胞內、壁膜空間生成，或直接分泌到培養基中。如果所述抗體在胞內生成，首先除去宿主細胞或裂解片斷的顆粒殘骸，例如，可通過離心或超聲的方法。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了將分泌到大腸桿菌壁膜空間的抗體分離的方法。簡要地說，在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺醯氟(PMSF)存在的條件下化開細胞糊(cell paste)約30分鐘以上。離心除去細胞碎片。如所述抗體分泌到培養基中，則通常首先使用市售的蛋白濃度過濾器，如Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit，濃縮該表達系統的上清液。在任何前述的步驟中都可加入蛋白酶抑制劑如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然汙染物的生長。
從所述細胞中製得的抗體可採用純化方法進行純化，例如羥磷灰石色譜、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換色譜柱、硫酸銨沉澱、鹽析以及親和色譜，其中親合色譜為優選的純化技術。所述抗體的種類以及所述抗體中存在任何免疫球蛋白的Fc結構域決定了蛋白A作為親和配體是否適合。蛋白A可用於純化基於人γ1，γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G適用於所有鼠源異構體和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:15671575(1986))。瓊脂糖是最常用的親和配體附著基質，但也可選用其他基質。機械力穩定的基質如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯與用瓊脂糖相比可實現更快的流速和更短的處理時間。如該抗體含有CH3結構域，則可用Bakerbond ABX.TM樹脂進行純化(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)。也可根據需要獲得的抗體確定其他蛋白純化的技術，如離子交換柱中的分餾、乙醇沉澱、反相HPLC、矽膠色譜、基於陰離子或陽離子交換樹脂的肝素瓊脂糖凝膠色譜(如聚天冬氨酸柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沉澱。
在任意初步純化步驟之後，可用低pH疏水相互作用色譜的方法處理含有感興趣的抗體和雜質的混合物，用pH約2.5-4.5的洗脫緩衝液，優選地在低鹽濃度下進行(例如，從約0到0.25M鹽濃度)。
試劑盒
本申請提供了包括所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段的試劑盒。在一些實施方式中，所述試劑盒用於檢測在生物樣品中的PD-L1的存在情況或水平。所述生物樣品可以包括細胞或組織。
在一些實施方式中，所述試劑盒包括與可檢測標記綴合的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段。在一些實施方式中，所述試劑盒包括未標記的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段，並進一步包括能夠與未標記的抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段結合標記的二抗。所述試劑盒可以進一步包括使用說明和在試劑盒中將每個組件分隔開的包裝。
在一些實施方式中，所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段與底物或儀器連接用於夾心測定如ELISA或免疫色譜測定。適用的底物或儀器可以是例如微孔板和試紙。
藥物組合物和治療方法
本申請進一步提供了包括所述抗-PD-L1抗體和其抗原結合片段的藥物組合物和一個或多個藥學上可接受的載體。
用在本申請公開的藥物組合物中的藥用可接受載劑可包括，例如，藥用可接受的液體、凝膠或固體載劑、水相介質、非水相介質、抗微生物物質、等滲物質、緩衝液、抗氧劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、輔料或無毒輔助物質，其他本領域公知的組分或以上的多種組合。
適用的組分可包括，例如，抗氧劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑例如糖和環糊精。適用的抗氧劑可包括，例如，甲硫氨酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羥基甲苯和/或沒食子酸丙酯。如本發明所公開，在一種含有本發明公開的抗體或其抗原結合片段的組合物中包括一種或多種抗氧劑如甲硫氨酸，可將降低所述抗體或其抗原結合片段的氧化。對氧化作用的減少可防止或減少結合親和力的降低，從而提高抗體穩定性並延長保質期。因此，在某些實施方式中，本發明提供的組合物中含有一種或多種所述的抗體或 其抗原結合片段以及一種或多種抗氧劑例如甲硫氨酸。本發明進一步提供了多種方法，通過將本發明中提供的抗體或其抗原結合片段與一種或多種抗氧劑混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗體或其抗原結合片段氧化、延長其保質期和/或提高其活性。
進一步的說，藥用可接受的載劑可包括，例如，水相介質如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介質例如：植物來源的不揮發性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、細菌抑制或真菌抑制濃度下的抗菌物質、等滲劑如：氯化鈉或葡萄糖、緩衝液如：磷酸鹽或枸櫞酸酸鹽緩衝液，抗氧化劑如：硫酸氫鈉，局部麻醉劑如：鹽酸普魯卡因，助懸劑和分散劑如：羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化劑如：聚山梨醇酯80(吐溫-80)、螯合試劑如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。作為載劑的抗菌劑可加入多次劑量容器中的藥物組合物中，其包括酚類或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨和氯苯乙銨。適用的輔料可包括，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油或乙醇。適用的無毒輔助物質可包括，例如，乳化劑、pH值緩衝劑、穩定劑、增溶劑，或者醋酸鈉、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者環糊精之類的物質。
所述藥物組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放製劑或粉末。口服製劑可以包括標準載體如藥物級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施方式中，所述藥物組合物被製劑成可注射的組合物。可注射的藥物組合物可以任何常規的形式製備，例如，液體溶劑、懸浮劑、乳化劑或適用於產生液體溶劑、懸浮劑或乳化劑的固體形式。注射製劑可包括現用的無菌和/或無熱原溶液、使用前現與溶劑結合的無菌乾燥的可溶物，如凍乾粉，包括皮下片、注射即用的無菌懸浮劑、使用前現與介質結合的無菌乾燥不溶產品，和無菌和/或無熱原的乳劑。溶劑可以為水相或非水相。
在某些實施方式中，單位劑量的注射製劑包裝在一個安瓿、一支管或一支帶有針的針筒中。本領域習知，所有注射給藥的製劑應為無菌無熱原。
在某些實施方式中，通過將本申請公開的抗體或其抗原結合片段溶解於某適當的溶劑中可製備無菌凍幹的粉末。所述溶劑可含有一種可提高粉或由粉末製得的重組溶液的穩定性，或改善粉末或重組溶液的其他藥理組分。適用的輔料包括，但不限於，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用的物質。溶劑可含有緩衝液，如枸櫞酸緩衝液、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液或其他本技術熟練人員公知的緩衝液，在一種實施方式中，緩衝液的pH為中性。在本領域公知的標準條件下進行對所述溶解進行隨後的過濾除菌，然後凍幹製得理想的製劑。在一種實施方式中，將所得的溶劑分裝至小管中凍幹。每支小管可容納單次劑量或多次劑量的所述抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段或其組合物。每支小管中的裝入量可略微高於每次劑量所需或多次劑量所需(例如10％過量)，從而保證取樣精確和給藥精確。凍乾粉可在適當的條件下儲存，如在約4℃到室溫範圍。
用注射用水將凍乾粉重溶得到用於注射給藥的製劑。在一種實施方式中，可將凍乾粉加至無菌無熱原水或其他適用的液體載劑中重溶。精確的量由選擇的療法決定，可根據經驗值決定。
還提供了治療方法，包括將治療有效量的本申請所述的抗體或其抗原結合片段施用給需要其的受試者，由此治療或預防與PD-L1相關的狀況或病症。在另一方面，還提供了治療會從上調的免疫響應獲益的受試者的狀況的方法，包括對所述需要其的受試者施用治療有效量的本申請所述的抗體或其抗原結合片段。
本申請中提供的抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量依賴於本領域公知的多種因素，例如體重、年齡、過往病史、現用治療、對象的健康狀況和交叉感染的潛力、過敏、超敏和副作用，以及給藥途徑和腫瘤發展的程度。本領域熟練人員(例如醫生或獸醫)可根據這些或其它條件或要求按比例降低或升高劑量。
在某些實施方式中，本發明提供的抗體或其抗原結合片段可在治療有效劑量約0.01mg/kg到約100mg/kg之間給藥(例如，約0.01mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg或約100mg/kg)。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段以約50mg/kg或更少的劑量給藥，在某些實施方式中，給藥劑量為10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1 mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某特定劑量可在多個間隔給藥，例如每天一次、每天兩次或更多、每月兩次或更多、每周一次、每兩周一次、每三周一次、每月一次或每兩月或更多月一次。在某些實施方式中，給藥劑量可隨治療進程變化。例如，在某些實施方式中，初始給藥劑量可比後續給藥劑量高。在某些實施方式中，給藥劑量在治療進程中根據給藥對象的反應進行調整。
給藥方案可通過調整達到最優反應(如治療反應)。例如，可進行單劑量給藥或在一段時間分多個分隔的劑量給藥。
本發明中公開的抗體和抗原結合片段可通過本領域公知的給藥方式給藥，例如注射給藥(如，皮下注射、腹腔注射、靜脈注射，包括靜脈滴注，肌肉注射或皮內注射)或非注射給藥(如，口服給藥、鼻腔給藥、舌下給藥、直腸給藥或外用給藥)。
與PD-L1相關的狀況和病症可以是免疫相關的疾病或病症。這樣的狀況和病症包括腫瘤和癌症、例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳癌、胰臟癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、間皮瘤、黑色素瘤、頭頸部癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈樣肉芽腫(mycoses fungoids)、默克爾細胞癌和其它惡性血液病、如經典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞的富B細胞淋巴瘤、EBV陽性和陰性PTLD和EBV相關瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、漿母細胞性淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌和HHV8相關原發性滲出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；自體免疫疾病、如系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性糖尿病、慢性病毒感染如B型肝炎，C型肝炎，皰疹病毒，Epstein-Barr病毒，愛滋病毒，巨細胞病毒，單純皰疹病毒I型，單純皰疹病毒2型，人乳頭狀瘤病毒，腺病毒的病毒感染，卡波西西肉瘤相關的皰疹病毒流行病，薄環病毒(Torquetenovirus)，JC病毒或BK病毒等。
使用方法
本申請進一步提供了使用所述抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段的方法。
在一些實施方式中，本申請提供了在生物樣品中檢測PD-L1的存在情況或水平的方法，包括將所述生物樣品與本申請所述的抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段接觸，並在所述樣品中確定PD-L1的存在情況或水平。含有PD-L1的樣品可以來源於受試者的細胞或組織或體液。在某些實施方式中，含有PD-L1的樣品來源於腫瘤或癌細胞或組 織例如循環腫瘤細胞、腫瘤塊、或疑似含有腫瘤細胞的組織。在某些實施方式中，含有PD-L1的樣品是浸潤腫瘤的免疫細胞，例如腫瘤內的免疫細胞、腫瘤周圍的免疫細胞或其它腫瘤基質細胞如成纖維細胞。所述浸潤腫瘤的細胞可以是T細胞(例如CD4+T細胞或CD8+T細胞)、B細胞或其它骨髓譜系細胞，例如，巨噬細胞、天然殺傷細胞、樹突細胞、單核細胞等。樣品中PD-L1的存在情況或水平可以通過例如檢測抗體與PD-L1結合來確定，使用的方法可以是例如免疫組織化學(IHC)、ELISA、流式細胞儀或本領域中已知的任何其它適當的方法。
在目標生物組織中PD-L1的存在情況和水平可以指示所述生物樣品來源的個體是否可能對PD-L1拮抗劑響應。因此，本發明進一步提供了鑑別患有可能對PD-L1拮抗劑響應的病症或狀況的個體的方法，其包括：用本申請所述的所述抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段在來自所述個體的待測生物樣品中確定PD-L1的存在情況或水平，其中在所述待測生物樣品中PD-L1的存在或水平上調表示響應的可能性。在一些實施方式中，所述待測樣品來源於癌細胞或組織，或進入腫瘤的免疫細胞。本申請使用的術語「上調」是指與使用相同抗體檢測的參照樣品中PD-L1蛋白水平相比，使用本申請所述的抗體或其抗原結合片段在待測樣品中檢測的PD-L1蛋白水平的總的增加不少於10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。所述參照樣品可以是從健康或無疾病的受試者中獲得的對照樣品，或從待測樣品來源的個體中獲得的健康或無疾病的樣品。例如，所述參照樣品可以是在待測樣品(如腫瘤)附近或相鄰的無疾病樣品。在一些實施方式中，所述方法進一步包括對經鑑定有可能對PD-L1拮抗劑響應的病症或狀況的個體施用治療有效量的抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段。
本發明公開的抗體和抗原結合片段可單獨給藥或與一種或多種其他治療手段或物質聯合給藥。例如，本發明公開的抗體和抗原結合片段可與化療、放療、癌症治療手術(如腫瘤切除術)、一種或多種抗嘔吐藥或其他化療導致的併發症的療法、或任何其他用於癌症的治療物質或任何由PD-L1介導的病症的治療物質進行聯用。在某些這樣的實施方式中，本發明公開的抗體和抗原結合片段與一種或多種治療物質聯用時，可與所述的一種或多種治療物質同時給藥，在某些這樣的實施方式中，所述的抗體和抗原結合片段可作為同一個藥物組合物的一部分同時給藥。但是，與其他治療物質「聯用」的抗體和抗原結合物不需要同時給藥或與該治療物質在同一組合物中給藥。本發明中「聯用」 的含義還包括在另一個治療物質之前或之後給藥的抗體和抗原結合物也被認為是與該治療物質「聯用」，即使所述抗體或其抗原結合片段與第二種物質通過不同給藥方式給藥。在可能的情況下，與本發明公開的抗體或其抗原結合片段聯用的其他治療物質可參照該其他治療物質的產品說明書的方法用藥，或參照外科醫生的案頭參考書2003(Physicians'Desk Reference，57th Ed；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或參照其他本領域公知的方法。
在某些實施方式中，所述治療物質能夠誘導或增強針對癌症的免疫反應。例如，腫瘤疫苗可以用於誘導對某些腫瘤或癌症的免疫應答。細胞因子治療可以用於提高將腫瘤抗原向免疫系統的遞呈。細胞因子治療的示例包括但不限於幹擾素如幹擾素α、β和γ，集落刺激因子如巨噬細胞CSF、粒細胞巨噬細胞CSF和粒細胞-CSF，白介素如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12，腫瘤壞死因子如TNF-α和TNF-β。還可以使用滅活免疫抑制目標的試劑，如TGF-β抑制劑、IL-10抑制劑和Fas配體抑制劑。另一組試劑包括激活針對腫瘤或癌細胞的免疫響應的那些試劑，例如，提高T細胞激活(如T細胞共刺激分子激動劑如CTLA-4、ICOS和OX-40)的那些，以及提高樹突細胞功能和抗原遞呈的那些。
本申請進一步提供了在用PD-L1拮抗劑治療的受試者中監測治療反應或疾病進展的方法，包括用本申請所述抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段在來自所述個體的待測生物樣品中確定PD-L1的存在情況或水平。在某些實施方式中，所述方法進一步包括將待測生物樣品中的PD-L1水平與此前從同一個體上獲得的可比樣品中的PD-L1水平進行比較，其中在測試生物樣品中減少或減慢或停止的PD-L1的增加表明積極的治療反應或受控的疾病進展。所述可比樣品可以與待測樣品是同一類型的樣品，但其是在治療前或在治療初期階段從相同個體中獲得的。
以下實施例旨在更好地說明本發明，且不應理解為限制本發明的範圍。所有下述的特定組合物、材料和方法，其整體或部分，都在本發明的範圍內。這些特定的組合物、材料和方法不是為了限制本發明，而只是為說明特定的實施方式在本發明的範圍內。本領域熟練技術人員可不添加創造性及不偏離本發明範圍而開發出等同的組合物、材料和方法。應理解，在對本發明的方法作出的多種改動可以仍然包括在本發明範圍內。發明人意在將這樣的變動包括在本發明的範圍內。
實施例1：抗體雜交瘤的生成
1.1免疫：～8周齡的雌性Balb/c小鼠經由足墊注射在10μg TiterMax中的人PD-L1ECD蛋白致敏，隨後每3天用在磷酸鋁凝膠佐劑中的PD-L1ECD蛋白經足墊激發直至適合融合。每兩周通過ELISA或FACS檢測抗-PD-L1抗體血清滴度。
1.2細胞融合：在融合前3天，動物經腹腔注射接受了10g的PBS中人PD-L1ECD蛋白的最後的激發。在融合當天，收穫淋巴結細胞並製備得到單細胞懸液。將獲得的淋巴細胞與骨髓瘤細胞(P3)以1:1的比例混合。將細胞混合物洗滌並在ECF溶液中以2.0x 106cells/mL的密度重懸。使用BTX 2000電融合儀進行細胞融合。
1.3第一次和第二次雜交瘤上清液篩選：於37℃培養7-14天後，將一部分雜交瘤上清液通過Mirrorball分析檢測。簡要地，將雜交瘤上清液用1XPBS稀釋5倍。表達PD-L1的CHO-K1細胞(1.25x 105細胞/mL)與二級螢光標記的抗體(400ng/mL)和DraQ5(1:5000)混合。在384孔板的每個孔中加入20μL的細胞混合物和20μL的稀釋的雜交瘤上清液樣品並在室溫下避光孵育至少2小時直至準備在高靈敏度微孔板細胞儀上進行分析。通過使用表達PD-L1的CHO-K1細胞經FACS驗證陽性細胞。用雜交瘤上清液樣品對細胞染色，隨後用與FITC連接的山羊抗-小鼠IgG Fc進行二抗結合。用相應的母本細胞系作為陰性對照。使用BD Biosciences的FACSCanto II and FlowJo版軟體對結合的細胞進行分析。
1.4亞克隆：使用被驗證為PD-L1結合陽性的雜交瘤細胞系進行亞克隆。簡要地，對於每株雜交瘤細胞系，將細胞計數並在克隆培養基中稀釋成每孔5個或1個細胞。在96孔板中以200μL/孔進行鋪板。將板置於37℃、5％CO2孵育直至後續分析。
1.5同型測試：用50μL/孔的山羊抗-小鼠IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgA和IgM抗體以1μg/mL分別包被ELISA板。在封閉後，將50μL的雜交瘤上清液樣品加入每孔，室溫下孵育2小時。使用山羊抗-小鼠kappa輕鏈-HRP作為檢測抗體。使用TMB底物孵育10min顯色，用2M HCl終止反應。在ELISA酶標儀上450nm處讀板。
1.6基於細胞的結合實驗：為檢驗先導抗體與目標的結合活性，將表達人PD-L1的CHO-K1或mDC用先導抗體結合，隨後用與FITC連接的山羊抗-人IgG Fc結合的二抗結合。使用對應的母本細胞系作為陰性對照。使用BD Biosciences的FACSCanto II and FlowJo版軟體對結合的細胞進行分析。
用來自鼠科雜交瘤細胞的針對人PD-L1的抗體結合轉染了全長人PD-L1的CHO細胞，隨後用與FITC連接的山羊抗-大鼠IgG Fc結合的二抗結合併用FACS分析。如圖1所示，抗體27.3；74.15和17.42以約1nM的EC50特異性地與CHO細胞上表達的PD-L1結合。
實施例2：人源化和純化
人源化：根據與PD-L1結合的高親和性和特異性選擇兩種來自雜交瘤的小鼠抗-人PD-L1抗體(分別命名為2.27.3和2.74.15)進行人源化，用於提高T細胞增殖和增加MLR中的細胞因子IFNγ和IL-2的分泌。所述人源化使用稱為CDR移植的技術進行。根據Kabat系統和IMGT系統定義FR和CDR區。將序列同源結果和結構相似比對相結合，使用最接近的人源FR 1-3基因取代小鼠FR 1-3基因，使用最接近的人源JH和Jκ基因取代小鼠FR4基因。在驗證模板序列和優化密碼子後，將重鏈可變區和輕鏈可變區擴增並克隆進表達載體，進而表達人源化抗體。將獲得的2.74.15的人源化抗體命名為2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8。還製備了2.27.3的人源化抗體。
抗體純化：使用含有人源化抗體的DNA載體轉染293F細胞，用於抗體表達和生產。在293F細胞培養上清液中的抗體使用蛋白A親和層析柱純化。
實施例3：人源化抗體的表徵
選擇2.74.15的人源化抗體進行進一步表徵。根據實施例1中的1.6章節的步驟，將人源化抗體2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8用FACS分析其與轉染了全長人PD-L1的CHO細胞的結合。
圖2顯示了使用針對人PD-L1的人源化抗體對轉染了PD-L1的CHO細胞進行染色，且FACS分析顯示人源化PD-L1抗體以約1nM的EC50特異性地與PD-L1結合。圖3顯示了由在GM-CSF和IL4中培養7天的單細胞培養物產生了人樹突細胞，其被人源化PD-L1抗體(即2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)染色。FACS分析顯示人源化抗體特異性地與在DC上表達的天然PD-L1結合。
3.1FACS測定的競爭性測試：為了檢驗人源化抗體是否能夠阻斷PD-L1與 PD-1的結合，將表達人PD-L1的CHO-K1細胞在4℃下與不同濃度的人源化抗體孵育1小時。將未結合的抗體洗脫，然後將小鼠Fc-標記的人PD-1加入細胞中。使用FITC連接的山羊抗-小鼠IgG檢測人PD-1與表達PD-L1的細胞的結合，隨後使用BD Biosciences的FACSCanto II and FlowJo版軟體進行分析。
將表達人PD-L1的CHO細胞與不同濃度的人源化抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)或對照抗體孵育，隨後將小鼠Fc-標記的人PD-1加入細胞中。使用FITC連接的山羊抗-小鼠IgG檢測人PD-1與表達PD-L1的細胞的結合，隨後通過FACS分析。如圖4所示，所有待測的人源化的PD-L1抗體阻斷了PD-1與轉化的CHO細胞上表達的PD-L1的結合。
3.2表面等離子體共振(SPR)測定的親和性測試：通過SPR法使用ProteOnXPR36(Bio-Rad)對抗體(2.74、2.74.15.cAb(2.74.15的嵌合抗體)、2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)與PD-L1的親和性和結合動力學進行表徵。將蛋白A蛋白(Sigma)通過胺偶聯固定於GLM傳感晶片上(Bio-Rad)。使純化的抗體流過傳感器晶片並被蛋白A捕獲。將晶片旋轉90°並用電泳緩衝液洗滌(1XPBS/0.01％Tween20,Bio-Rad)直至基線穩定。使5個濃度的人PD-L1和電泳緩衝液以流速100μL/min流經所述抗體流動單元，先為結合相流動240s，隨後解離相600s。在每次運行後用pH 1.7的H3PO4再生所述晶片。使用ProteOn軟體將結合和解離曲線擬合至1:1的Langmiur結合模型。
如圖7所示，通過使用表面等離子體共振檢測的人源化PD-L1抗體對重組人PD-L1的親和性為從1.55E-10到1.18E-11mol/L。
3.3FACS測定的親和性測試：通過使用表達人PD-L1的CHO-K1細胞，經FACS分析，進行與細胞表面PD-L1的抗體結合親和性測定。待測抗體用洗脫緩衝液以1:2系列稀釋(1XPBS/1％BSA)並在4℃下孵育1小時。加入二抗山羊抗-人IgGFc FITC(3.0摩爾FITC每摩爾IgG，(Jackson Immunoresearch Lab))並在4℃下避光孵育1小時。隨後洗滌一次細胞並在1XPBS/1％BSA中重懸，使用流式細胞術(BD)分析。基於quantitative beads QuantumTM MESF Kit(Bangs Laboratories,Inc.)，螢光強度將被轉換為與分子/細胞相關。使用Graphpad Prism5計算KD。
3.4體外功能測定：為了估測人源化抗體調節T細胞響應(包括細胞因子生產 和細胞增殖)的能力，使用抗體2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8以及對照抗體進行了以下三個實驗。
3.4.1同種異體MLR：使用人單核細胞富集試劑盒，根據說明從健康供體中分離單核細胞。將細胞培養5-7天以誘導成樹突細胞(DC)。在使用18至24小時前，將1μg/mL LPS加入細胞培養物中誘導DC成熟。
為了檢測所述人源化抗-PD-L1抗體對MLR中的IL-2的生產的作用，使用人CD4+T細胞富集試劑盒，根據說明書分離人CD4+T細胞，隨後在有或沒有人源化抗-PD-L1抗體或對照抗體的情況下，使用成熟或不成熟的同種異體的DC進行刺激。在第3天用ELISA測定培養上清液中的IL-2水平。如圖8所示，所有待測的抗-PD-L1抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)以劑量依賴的方式增加了IL-2的分泌。
為了檢測所述人源化抗-PD-L1抗體對MLR中的IFNγ的生產的作用，使用人CD4+T細胞富集試劑盒根據說明書分離人CD4+T細胞，隨後在有或沒有人源化抗-PD-L1抗體或對照抗體的情況下，使用成熟或不成熟的同種異體的DC進行刺激。在第5天用ELISA測定培養上清液中的IFNγ水平。如圖9所示，所有待測的抗-PD-L1抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)以劑量依賴的方式增加了IFNγ的分泌。
為了檢測所述人源化抗-PD-L1抗體對MLR中的T細胞增殖的作用，使用人CD4+T細胞富集試劑盒根據說明書分離人CD4+T細胞，隨後在有或沒有人源化抗-PD-L1抗體或對照抗體的情況下，使用成熟或不成熟的同種異體的DC進行刺激。通過[3H]胸苷摻入測定T細胞增殖。如圖10所示，所有待測的抗-PD-L1抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)均能增加濃度依賴的T細胞增殖。
3.4.2自體抗原特異性免疫應答：從相同的CMV+供體中分離CD4+T細胞和單核細胞。在CMV pp65肽和低劑量IL2(20U/ml)存在下培養CD4+T細胞。同時依照前述方法通過培養單核細胞生產DC。5天後，用pp65肽脈衝式加入DC，隨後在人源化抗體或對照抗體存在或不存在條件下，將DC加入至CD4+T細胞。在第3天用ELISA測定培養上清液中的IL-2和IFNγ水平。CMVpp65特異性CD4+T細胞 的增殖通過[3H]胸苷摻入測定。
如圖11所示，通過人源化PD-L1抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)提高了在特異性T細胞響應中IFNγ的產生。圖12顯示了人源化PD-L1抗體增加了使用CMV pp65肽負載的自體DC濃度依賴的CMV+-CD4+T細胞增殖。
3.4.3Treg抑制試驗：調節性T細胞(Treg)是T細胞的亞群，是關鍵免疫調節子在維持自身耐受中起到重要作用。CD4+CD25+Treg與腫瘤相關，這是由於在多發性癌症患者中發現Treg數量增加，並與較差的預後相關。為了直接估測人PD-L1人源化抗體在抑制Treg抑制功能中的作用，在人源化抗體或對照抗體存在或不存在條件下，比較Treg的功能。簡言之，CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞通過MACS分離。在不同濃度的人源化抗體或對照抗體存在或不存在條件下，比較Treg的功能。簡言之，CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞通過MACS分離，用同種異體成熟DC共培養CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞(Treg:Teff比例為1:1)。將不含抗體或同型抗體作為陰性對照。用前述方法測量細胞因子的產生和T細胞增殖。
圖13顯示了經MACS分離的CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞。在不同濃度的人源化抗體或對照抗體存在或不存在條件下，用同種異體DC共培養CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞(Treg:Teff比例為1:1)。結果表明，PD-L1的抗體廢除了Treg的抑制功能，並恢復了反應性T細胞的增殖和IFNγ的分泌。
3.5ADCC/CDC測試：由於人PD-L1表達於多種細胞類型，在健康和腫瘤細胞中為了將對健康PD-L1+細胞的不需要的毒性減小到最低，驗證了選擇的抗-PD-L1人源化抗體沒有ADCC和CDC功能。
3.5.1ADCC：將靶細胞(mDC)和不同濃度的人源化抗體在96孔板中預孵育30min，隨後以效應器/靶標的比例50:1加入PBMC(效應器)。將所述板在37℃、5％CO2孵育器中孵育6小時。通過細胞毒性檢測試劑盒(羅氏)測定靶細胞的裂解。使用Molecular Devices SpectraMax M5e微孔板檢測儀測定光學密度。赫賽汀(羅氏)和人乳腺癌細胞系BT474(HER2陽性)作為陽性對照。
圖14顯示，使用的IL-2-激活的PBMC作為天然殺傷(NK)細胞的來源並將 表達高水平的細胞表面的PD-L1的mDC作為靶細胞，人源化PD-L1抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)不介導ADCC。
3.5.2CDC：將靶細胞(mDC)、稀釋的人血清補體(Quidel-A112)和不同濃度的人源化抗體在96孔板中混合。將所述板在37℃、5％CO2孵育器中孵育4小時。使用CellTiter glo(Promega-G7573)測定靶細胞裂解。利妥昔單抗(羅氏)和人B細胞淋巴瘤細胞系Raji(CD20陽性)作為陽性對照。
圖15顯示了靶細胞(mDC)、稀釋的人血清補體(Quidel-A112)和不同濃度的人源化PD-L1抗體混合孵育4小時。使用CellTiter glo(Promega-G7573)測定靶細胞裂解。數據顯示人源化PD-L1抗體不介導CDC。
3.6通過FACS確定的分類(Binning)測試：該實驗主要是為了找出這些抗體是否結合相同、重合的、或完全不同的表位。為了檢查人源化抗體與對照抗體是否結合相同的表位，將表達人PD-L1的CHO-K1細胞與不同濃度的人源化抗體在4℃孵育1小時。洗脫未結合抗體，向細胞中加入生物素標記的對照抗體。使用PE連接的鏈黴素檢測生物素標記的對照抗體與PD-L1表達細胞的結合，隨後使用BD Biosciences的FACSCanto II and FlowJo版軟體進行分析。
3.7跨物種結合測定：抗體對食蟹猴和鼠科PD-L1的交叉反應通過ELISA測定。將人、食蟹猴和小鼠的PD-L1分別包被在ELISA平板上。封閉後，將人源化抗體加入板中並在室溫下孵育至少2小時。用山羊抗-人IgG Fc-HRP檢測抗體與包被的抗原的結合。使用TMB底物孵育10min顯色，用2M HCl終止反應。使用Molecular Device M5e酶標儀上450nm處讀板。
如圖6所示，ELISA實驗結果表明待測的人源化PD-L1與食蟹猴PD-L1以劑量依賴的形式結合。然而，待測抗體(2.74.15.hAb4、2.74.15.hAb5、2.74.15.hAb6、2.74.15.hAb7和2.74.15.hAb8)都不與鼠科PD-L1結合(數據未顯示)。此外，也測試了2.27.3的人源化抗體，但結果表明這些人源化抗體丟失了與猴PD-L1的結合親和力(數據未顯示)。
3.8FACS跨家族結合測定：為檢測人源化抗體的跨家族結合活性，用人源化抗體結合表達PD-L2的細胞系，隨後用與FITC連接的山羊抗-人IgG Fc進行二抗 結合。PD-L1表達細胞作為陽性對照。相應的母細胞系作為陰性對照。使用BD Biosciences的FACSCanto II and FlowJo版軟體對結合的細胞進行分析。
使用人源化的PD-L1抗體對轉染了PD-L1或PD-L2的CHO細胞進行染色，並用FACS分析。如圖5所示，人源化的PD-L1抗體特異性結合PD-L1，但不與PD-1配體家族的PD-L2結合。
雖然本公開已經具體示出並參考具體實施方式(其中一些是優選的實施方式)進行了描述，但本領域的技術人員應理解如本申請所示可以在不脫離本發明的精神和範圍內，可以進行各種形式上和細節上的改變。