一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-04 13:05:01 1

一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體及其製備方法和應用，該金鈀雙金屬衛星結構組裝體包括納米金顆粒內核、通過共價鍵與所述納米金顆粒內核連接的巰基DNA、以及與所述巰基DNA的巰基絡合連接的納米鈀粒，所述納米金顆粒內核位於所述納米鈀粒形成的外殼之內。其製備方法包括將連接有巰基DNA的納米金顆粒與鈀離子接觸，通過所述鈀離子與所述巰基DNA的巰基絡合，再經還原而形成納米鈀粒，從而得到所述金鈀雙金屬衛星結構組裝體。本發明的金鈀雙金屬衛星結構組裝體可用於目標生化物質的催化活性的檢測和/或光學傳感、化學傳感、生物傳感等方面。
【專利說明】一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米材料【技術領域】，尤其涉及一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]局域表面等離子共振(LocalizedSurface Plasmon Resonance, LSPR)是當入射光子頻率與金屬納米粒子中自由電子的集體振蕩頻率發生共振時產生的一種物理光學現象。以LSPR原理進行的傳感技術在近年來己有報導。貴金屬納米粒子的LSPR的形狀和位置對納米粒子的形狀、大小、組成、介電性質以及局域介質環境非常敏感，因此可以作為基於光學信號的化學傳感器和生物傳感器。基於LSPR光譜的納米級傳感器是將貴金屬表面附近折射率的微小變化轉換成一個可測量的波長移動響應。根據測得的消光光譜或散射光譜中最大吸收峰位對其周圍納米尺度範圍內環境變化的敏感性可以用來發展高空間解析度的光學傳感器。LSPR納米傳感器具有高靈敏度、高選擇性、實時檢測和無標記操作等優異的特點。納米金粒子具有獨特的LSPR光學特性，對周圍介質十分敏感，在分子識別、生物分析化學中具有重要而廣泛的應用價值，因而很有希望成為納米光子學和檢測(傳感)領域中得到重要應用的一種納米材料。
[0003]伴隨著燃料電池技術的快速發展，易燃性氣體，例如氫氣的檢測是至關重要的安全問題。氫氣的濃度大於4%就可能引發爆炸。相比於需要電子設備的傳感器，利用光學傳感器用來檢測氫氣由於其本質的安全性，不會產生任何火花，所以更為理想。鈀是一種具有較高催化活性的金屬，能夠吸附大量的氫氣，基於鈀的納米材料引起了人們的廣泛關注。然而，鈀納米粒子的LSPR在整個可見光譜範圍內具有非常寬的譜帶。這成為直接利用鈀納米粒子進行光學檢測氫氣的重要障礙。由於納米金粒子具有獨特的LSPR光學特性，對周圍介質十分敏感，因此，可以利用納米金的LSPR特性實現間接檢測氫氣的目的。近年來，利用納米金粒子獨特的LSPR特性實現間接光學檢測氫氣的研究已有報導(NanoLett.10, 3529-3538 (2010))，該研究將鈀納米粒子組裝到金圓盤上，在鈀納米粒子與金圓盤之間用二氧化矽絕緣體進行阻隔，形成納米金圓盤-鈀納米粒子的組裝體。然而，這種方法的缺點是由於鈀納米粒子以及金圓盤的粒徑分布都比較廣，檢測到的只是較寬泛的非均一的平均特徵，並且由於二氧化矽的絕緣性質，會妨礙金圓盤的LSPR信號的檢測。
[0004]隨著LSPR技術在不同領域應用研究的深入開展，形成了一些新的熱點。利用單個金屬納米粒子或納米粒子陣列LSPR的探測傳感技術，可以有效提高LSPR傳感器的靈敏度、選擇性、空間解析度和可集成性，成為探測傳感領域研究和應用的一個重要方向。

【發明內容】

[0005]針對現有技術的不足，本發明的目的之一在於提供一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體，其納米鈀粒的尺寸均一，可以考察單一組裝體的響應信號。
[0006]本發明的目的之二在於提供上述金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備方法，該方法可精確調控納米金顆粒與納米鈀粒的距離。
[0007]本發明的目的之三在於提供上述金鈀雙金屬衛星結構組裝體在目標生化物質的催化活性的檢測和/或光學傳感、化學傳感、生物傳感等方面的應用。
[0008]本發明的技術方案如下:
[0009]在第一方面，本發明提供一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體，其包括納米金顆粒內核、通過共價鍵與所述納米金顆粒內核連接的巰基DNA、以及與所述巰基DNA的巰基絡合連接的納米鈕粒，所述納米金顆粒內核位於所述納米鈕粒形成的外殼之內。
[0010]在本發明的組裝體中，所謂「納米鈀粒形成的外殼」是指納米鈀粒圍繞納米金顆粒內核形成的一層殼狀結構。根據本發明的內容能夠理解，這裡的「外殼」並不是指一個整體的、嚴密的、沒有縫隙的殼狀結構，而事實上，每個納米鈀粒是相對獨立的，只是這些納米鈀粒圍繞納米金顆粒內核排列起來就像外殼一樣。
[0011]在本發明的組裝體中，巰基DNA起到納米金顆粒與納米鈕粒的連接媒介的作用，通過巰基DNA將作為內核的納米金顆粒與位於納米金顆粒外面的納米IE粒連接在一起，形成金鈀雙金屬衛星結構組裝體，由於本發明的巰基DNA分別通過共價鍵與納米金顆粒內核連接、通過絡合與納米鈀粒連接，因此，本發明的金鈀雙金屬衛星結構組裝體結構穩定。
[0012]在本發明的組裝體中，所謂「巰基DNA」是指被巰基修飾了的DNA，修飾位點可以是在DNA的任何位置，但為了更好的發揮納米金顆粒與納米鈀粒的連接媒介的作用，優選在DNA的靠近端部的位置修飾，最優選在DNA的最末端的鹼基上修飾。
[0013]在本發明的組裝體中，疏基DNA —端的疏基能夠與納米金顆粒發生共價鍵連接，同時另一端的巰基能夠與鈕離子發生絡合連接，而與納米鈕粒連接在一起。
[0014]在本發明的組裝體中，巰基DNA可以是單鏈的DNA (稱為「單鏈巰基DNA」)或者雙鏈的DNA (稱為「雙鏈巰基DNA」)，只要在兩端分別修飾上巰基，並且兩端的巰基分別發揮與納米金顆粒共價鍵連接、與納米鈀粒絡合連接的功能即可。
[0015]在本發明的組裝體中，當巰基DNA是單鏈的DNA時，在具體實施中例如可以是:將單鏈DNA的5』端和3』端分別修飾上巰基和二硫鍵，使5』端的巰基與納米金顆粒共價鍵連接後，通過還原劑將3』端的二硫鍵還原為巰基，然後使該3』端的巰基與納米鈀粒絡合連接得到本發明的組裝體。本發明優選採用雙鏈的DNA，本發明的雙鏈巰基DNA是分別修飾好的兩條單鏈巰基DNA通過鹼基互補配對原則發生退火雜交得到的雙鏈巰基DNA，這兩條單鏈巰基DNA均在5』端或均在3』端修飾有巰基。本發明的單鏈巰基DNA可以是直接將巰基修飾在單鏈DNA的一端得到的，也可以是先在單鏈DNA的一端修飾二硫鍵(稱為「單鏈二硫鍵DNA」)，使用前再用還原劑將二硫鍵還原成巰基得到的單鏈巰基DNA，本發明優選後者，是因為巰基易被氧化，不利於長期保藏，而二硫鍵修飾的DNA不存在被氧化的問題，便於長期保藏。本發明的雙鏈巰基DNA可以是沒有單鏈部分的雙鏈巰基DNA，也可以在兩端分別有若干個鹼基的單鏈部分，優選有I?12個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)鹼基的單鏈部分，更優選有2?3個鹼基的單鏈部分。本發明中，對DNA的序列和長度不作任何限定，任何具有鹼基互補配對的DNA序列均可作為本發明的單鏈DNA，任何長度的DNA均可用於本發明。
[0016]在本發明的組裝體中，對所述納米鈀粒的粒徑不作特別限定，但為了更好的應用效果，本發明所述納米鈕粒的粒徑為3?9nm (例如3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm或9nm),優選3~5nm或7~9nm。
[0017]在本發明的組裝體中，對所述納米鈀粒與所述納米金顆粒內核之間的距離不作特別限定，但為了更好的應用效果，本發明所述納米鈀粒與所述納米金顆粒內核之間的距離為 I ~8nm (例如 lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm 或 8nm),優選 I ~5nm,更優選 I ~2nm。
[0018]在本發明的組裝體中，對所述納米金顆粒的形狀不作特別限定，但為了更好的應用效果，本發明所述納米金顆粒的形狀選自棒狀、球形、錐形、三角形、圓盤形、星形和帶狀中的一種或多種；本發明特別優選所述納米金顆粒為納米金棒。
[0019]在本發明的組裝體中，對所述納米金棒的長徑比不作特別限定，本發明所述納米金棒可以是任意長徑比的納米金棒。但是，優選長徑比為1.5~10 (例如2、3、4、5、6、7、8、9或10)的納米金棒，更優選長徑比為2~5的納米金棒，特別優選長徑比為2~3的納米金棒。
[0020]在第二方面，本發明提供一種如第一方面所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備方法，所述方法包括將連接有巰基DNA的納米金顆粒與鈀離子接觸，通過所述鈀離子與所述巰基DNA的巰基絡合，再經還原而形成納米鈀粒，從而得到所述金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
[0021]本發明一個優選技術方案如下:
[0022](I)將兩條具有喊基互補配對關係的單鏈二硫鍵DNA通過還原劑分別還原為兩條單鏈巰基DNA ；
[0023](2)使其中一條單鏈巰基DNA與納米金顆粒反應,生成帶有單鏈DNA的納米金顆粒,其中所述單鏈DNA與納米金顆粒通過巰基與金之間形成的共價鍵連接；
[0024](3)使所述帶有單鏈DNA的納米金顆粒與另一條單鏈巰基DNA發生退火雜交,生成帶有雙鏈巰基DNA的納米金顆粒，其中所述雙鏈巰基DNA的自由端帶有巰基；
[0025](4)將所述帶有雙鏈巰基DNA的納米金顆粒與含有鈀離子的溶液反應，使鈀離子與所述雙鏈疏基DNA的自由端的疏基發生絡合反應；
[0026](5)使用還原劑還原步驟(4)得到的絡合產物，形成納米鈀粒，從而得到所述金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
[0027]在上述優選技術方案中，所謂「兩條」用以指兩種具有序列互補關係的DNA序列，不應當理解成兩個DNA分子，因為本發明的反應並非單分子反應。「一條」和「另一條」(單鏈巰基DNA)的具體用量(例如摩爾數等)不作特別限定，具體實施中可以根據需要確定合適的摩爾數。在具體實施中，步驟(2)中修飾納米金顆粒用的單鏈巰基DNA比步驟(3)中退火雜交用的另一條單鏈巰基DNA的用量可以高一些(比如2倍、3倍或4倍等)。這是因為:一方面，需要大量的巰基DNA才能使納米金顆粒修飾完全；另一方面，大量的巰基DNA使修飾的納米金顆粒比較穩定，不容易聚集。納米金顆粒修飾完全之後，加入一半量或者更少的互補巰基DNA進行退火雜交即可，因為無論是修飾納米金顆粒的巰基DNA，還是互補巰基DNA的量相比於納米金顆粒來說都是過量的。
[0028]在上述優選技術方案中，所謂「單鏈二硫鍵DNA」是指在單鏈DNA的3』端或5』端進行了二硫鍵(-S-S-)修飾的單鏈DNA。需要注意的是，兩條單鏈二硫鍵DNA要麼均在3』端要麼均在5』端進行二硫鍵修飾。
[0029]在上述優選技術方案中，步驟(3)的雙鏈巰基DNA的一端通過巰基與金之間形成的共價鍵連接在納米金顆粒上，相對應的另一端稱為「自由端」，其帶有巰基，預備與鈀離子絡合。
[0030]在上述優選技術方案中，所述步驟(I)的還原劑選自三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP)、疏基乙醇(2_ 疏基乙醇，2-Mercaptoethanol)和二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)中的一種或多種，優選三(2-羧乙基)膦。並且，本發明並不局限於上述還原劑，只要具有將二硫鍵還原為巰基功能的任何還原劑均可使用。
[0031]優選地，所述步驟(I)還原的時間為4?12h，例如4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、llh或 12h。
[0032]優選地，所述步驟(I)還原後，去除多餘的還原劑得到純化的單鏈巰基DNA。例如，多餘的TCEP用G25吸附柱(可以從GE公司購得)，在3000?3500rpm下，離心2?3min進行去除。
[0033]優選地，所述單鏈二硫鍵DNA的3 』端或5 』端、優選3 』端修飾有二硫鍵。
[0034]優選地，所述步驟(2)的納米金顆粒的形狀選自棒狀、球形、錐形、三角形、圓盤形、星形和帶狀中的一種或多種，更優選地，所述納米金顆粒為納米金棒。
[0035]優選地，所述步驟(2)具體為:在反應緩衝液中，將步驟(I)所得的一條單鏈巰基DNA與納米金棒混合均勻，在15?30°C下反應，生成帶有單鏈DNA的納米金棒，其中所述單鏈DNA與納米金棒通過巰基與金之間形成的共價鍵連接。本發明對反應緩衝液不作特別限定，只要能夠提供適合反應的液體環境即可。例如可以是Tris硼酸鹽緩衝液(TBE)、Tris-EDTA緩衝液(TE)、Tris乙酸鹽緩衝液(TAE)、Tris磷酸鹽緩衝液(TPE)、磷酸鹽緩衝液(PBS)等。上述反應緩衝液都是本領域常用的反應緩衝液，可以任意選擇，只要能夠實現本發明為反應提供緩衝液環境的功能即可。本發明優選TBE，特別優選在IXTBE中，加入
0.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和500mM氯化鈉(NaCl)的溶液，其pH可以為3?6，例如3、4、5或6等。IXTBE緩衝溶液的配製可以是將2.16g Tris鹼、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA (pH8.0)溶於200mL超純水中得到。
[0036]優選地，所述步驟(2)反應溫度可以是16°C、18°C、20°C、22°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C或30°C等。與大部分化學反應一樣，本發明化學反應的溫度主要對反應速率有影響，因此溫度並不是決定本發明是否能夠實現的關鍵因素，本發明允許較寬的溫度範圍，上述列舉的只是一部分可行的溫度值，並非窮舉。與溫度相關的因素是反應時間，本領域的技術人員能夠理解，在選用溫度較高的情況下，反應速率會較快，這種情況下可以縮短反應時間即可實現本發明的目的；相反地，如果選用的溫度較低，化學反應速率會較慢，這種情況下可以延長反應時間實現本發明的目的。
[0037]優選地，所述步驟(2)反應時間為8?24h，例如10h、12h、14h、16h、18、20h或22h
等。本發明的反應時間並不局限於這些。
[0038]優選地，所述步驟(2)反應後，離心、提純生成的帶有單鏈DNA的納米金棒。例如，在7000?8500rpm下，離心10?25min進行提純，取沉澱，溶於200?400 μ L的內含I X TBE和IOOmM NaCl的溶液中。
[0039]納米金棒是本發明實施例部分選用的納米金顆粒，僅是本發明的優選。納米金顆粒的形狀還可以是棒狀、球形、錐形、三角形、圓盤形、星形和帶狀中的一種或多種，因為任何形狀的納米金顆粒的化學性質並沒有本質區別，均可以通過與巰基形成共價鍵而連接。[0040]優選地，所述步驟(3)退火雜交為從45°C到25°C緩慢退火12?36h。退火時間例如可以是 14h、16h、18h、20h、22h、24h、25h、27h、28h、30h、32h、33h、34h 或 35h 等。「緩慢退火」可以是指退火一定溫度後持續一段時間繼續退火，比如溫度降低0.1°C後，持續6min，重複上述程序；又比如溫度降低0.5°C後，持續30min，重複上述程序；也可以將樣品加熱到45°C之後拿到室溫，使之緩慢降溫，等等。此外，退火溫度範圍選用45°C到25°C也僅是本發明的優選，其它可選擇的溫度範圍還有很多，例如46°C到26°C、47°C到27°C、43°C到23°C、44°C到24°C等，只要在所選擇的溫度範圍能能夠實現兩條單鏈DNA退火雜交形成雙鏈DNA的功能即可。同樣，退火雜交時間的選擇也不局限於上述列舉的時間，可以適當延長或縮短退火雜交的時間，只要在所選擇的時間內能夠實現兩條單鏈DNA退火雜交形成雙鏈DNA的功能即可。
[0041]優選地，所述步驟(3)退火雜交後，離心、提純生成的帶有雙鏈巰基DNA的納米金棒。例如，於7000?8500rpm下，離心10?25min進行提純，取沉澱，即為生成的帶有雙鏈巰基DNA的納米金顆粒，溶於超純水中備用。
[0042]優選地，所述步驟(4)具體為:將步驟(3)生成的帶有雙鏈巰基DNA的納米金棒與鈀鹽溶液反應，使鈀離子與巰基發生絡合反應。
[0043]優選地，所述鈀鹽溶液為醋酸鈀(Pd(CH3C00)2)、氯化鈀(PdCl2)和硫酸鈀(PdSO4)溶液中的一種或多種的混合，優選醋酸鈀溶液。本發明並不局限於此，各種能夠提供鈀離子的鈀鹽都能用於本發明，因為本發明關鍵在於鈀離子，而不在於提供鈀離子的鹽是何種鹽。
[0044]優選地，雖然本發明對上述選用的各種鈀鹽的濃度不作任何限定，但是作為優選，所述醋酸鈀溶液的濃度為2.5?10mM，例如3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或IOmM等。
[0045]優選地，所述步驟(4 )反應在搖床震蕩下，孵育4?12h，例如4h、5h、6h、7h、8h、9h、IOhUlh或12h等。本發明孵育時間不局限於上述列舉的時間，可以適當縮短或者延長；並且，搖床震蕩也僅是其中一種最常見的振蕩方式，可以根據具體實驗條件選用各種類似的方式，只要能夠實現相應的功能即可。
[0046]優選地，所述步驟(4)反應後，離心、提純生成的絡合產物。例如，可以是將上述混合溶液於3000?5000rpm下,離心3?5min進行提純,取沉澱,溶於40?60 μ L超純水中。
[0047]優選地，重複所述離心、提純的步驟2?3次。
[0048]優選地，所述步驟(5)的還原劑選自硼氫化鈉(NaBH4)、二甲胺硼烷(Dimethylamine-Borane, DMAB)、朽1 樣酸(2-輕基丙燒-1, 2, 3-三羧酸，2-hydroxypropane-
1,2, 3-tricarboxylate)、朽1檬酸鈉、抗壞血酸(維生素C, Vitamin C)和抗壞血酸鈉中的一種或多種，優選硼氫化鈉，當然本發明並非局限於此。所述步驟(5)中還原劑的作用是將鈀離子還原為鈀，因此任何能夠實現該功能的還原劑均可選用。
[0049]在第三方面，發明提供一種如第一方面所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體在目標生化物質的催化活性的檢測和/或光學傳感、化學傳感、生物傳感等方面的應用，優選在單一組裝體的響應信號的檢測中的應用。
[0050]所述光學傳感、化學傳感、生物傳感等方面的應用例如可以是應用於光學傳感器、化學傳感器、生物傳感器中。所述化學傳感器例如氫氣化學傳感器，所述生物傳感器例如酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織或核酸等生物活性物質的生物傳感器。
[0051]本發明還提供一種如第一方面所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體在氫氣檢測中的應用，優選利用光學傳感器進行氫氣檢測中的應用。
[0052]本發明的有益效果為:本發明的顯著特徵是實現了納米金顆粒與納米鈀粒衛星結構的組裝。合成的納米鈀粒的尺寸較均一。本發明通過調控納米金顆粒表面修飾的巰基DNA的長度能夠精確控制納米鈀粒與納米金顆粒之間的距離，從而可以實現納米金顆粒的LSPR效應的量化。本發明的方法反應條件溫和，常溫操作即可，操作過程簡單，反應重複性好，純化產率高。合成的納米金顆粒與納米鈀粒的組裝體可以做到無需標記、無汙染、實時、高靈敏度的檢測，並可以應用於目標生化物質的催化活性的檢測和/或光學傳感、化學傳感、生物傳感等方面。相比於文獻已有報導的組裝體，這種方法的優勢在於:
[0053](I)可以精確調控納米金顆粒與納米鈀粒的大小以及二者之間的距離，從而有助於理解樣品大小和距離對於吸附氫氣性能的影響。
[0054](2)可以考察單一組裝體的響應信號，從而避免了基於測量整體而可能發生的任何非均一的誇大和統計效應。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1是實施例1製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的透射電鏡照片。
[0056]圖2是實施例2製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的透射電鏡照片。
[0057]圖3是實施例3製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的透射電鏡照片。
【具體實施方式】
[0058]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，以下實施例僅為本發明的優選實施例，以便於更好地理解本發明，因而不應視為限定本發明的範圍。對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換或改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑廠商購買得到的；所用透射電鏡為日立H7700型(日本)。
[0059]實施例1
[0060]( I)納米金棒的修飾:
[0061]Ca)取30 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:1所示的3』端修飾二硫鍵的DNAl和20 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:2所示的3』端修飾二硫鍵的DNA2，分別加入 3 μ L 和 2 μ L 濃度為 200mM 的三(2_ 羧乙基)勝(tris (2-carboxyethyl)phosphine),TCEP)溶液，進行還原12h。多餘的TCEP用G25吸附柱，在3000rpm下，離心2min進行去除，即可以得到經還原提純後的疏基DNAl和疏基DNA2 ；
[0062]其中，3』端修飾二硫鍵的DNA均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，經HPLC純化。還原得到的疏基DNAl和疏基DNA2均含18個喊基,並且均為3』端修飾疏基,其序列分別為:
[0063]巰基DNAl:5』 -TTATAACTATTCCTAAAA-3，(SEQ ID NO: I)；
[0064]巰基DNA2:5』 -TAGGAATAGTTATAAAAA-3』 (SEQ ID NO:2)。
[0065](b)配製4mL內含IXTBE (I X TBE緩衝溶液的配製為2.16g Tris鹼、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA (pH8.0)溶於200mL超純水中)、0.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和500mM氯化鈉(NaCl)的溶液，用鹽酸(HCl)調節pH為3 ;然後，將還原提純後的巰基DNAl加入到上述溶液中，混合均勻。取20 μ L濃度為30ηΜ的納米金棒(長度為34nm左右，長徑比約為3)加入到上述混合溶液中，混合均勻後，放置於29°C水浴中12h，使巰基DNAl修飾到納米金棒上。
[0066](c)將修飾好巰基DNAl的納米金棒於8500rpm下,離心20min進行提純,取沉澱，溶於400 μ L內含IXTBE和IOOmM NaCl的溶液中。
[0067](d)取20 μ L經還原提純後的巰基DNA2加入到上述修飾好巰基DNAl的納米金棒溶液中(內含IXTBE和IOOmM NaCl )，混合均勻後，放置於PCR儀中，從45°C到25°C緩慢退火36h。然後，將混合物於SOOOrpm下，離心20min進行提純，取沉澱，即為修飾好的納米金棒，溶於超純水中備用。
[0068](2)金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備:
[0069](a)取10 μ L新鮮配製的5mM的Pd(CH3COO)2溶液，加入到20 μ L濃度為InM的修
飾好的納米金棒溶液中，搖床震蕩孵育4h。
[0070](b)將上述混合溶液於3000rpm下,離心5min進行提純,取沉澱,溶於40 μ L超純水中；重複步驟(b) 2次。
[0071](C)向上述溶液中加入10 μ L新鮮配製的濃度為5mM的NaBH4溶液進行還原，即可以得到金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
[0072]圖1是本實施例製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的透射電鏡照片。從圖中可以看出，納米金棒長度約為34nm，寬約為llnm，長徑比約為3，其上面的納米鈀粒大小約為3?4nm，粒徑分布均勻，納米鈀粒與納米金棒之間的距離約為lnm。通過本實施例製備出良好的金鈀雙金屬衛星結構組裝體，並且製備的組裝體的分散性好，可以實現單一組裝體的響應信號的測量，避免了基於測量整體而可能發生的任何非均一的誇大和統計效應。
[0073]實施例2
[0074]( I)納米金棒的修飾:
[0075]Ca)取50 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:1所示的3』端修飾二硫鍵的DNAl和30 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:2所示的3』端修飾二硫鍵的DNA2，分別加入 5 μ L 和 3 μ L 濃度為 200mM 的三(2_ 羧乙基)勝(tris (2-carboxyethyl)phosphine),TCEP)溶液，進行還原8h。多餘的TCEP用G25吸附柱，在3500rpm下，離心2min進行去除，即可以得到經還原提純後的疏基DNAl和疏基DNA2 ；
[0076]其中，3』端修飾二硫鍵的DNA與實施例1相同，均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，經HPLC純化。還原得到的巰基DNAl和巰基DNA2均含18個鹼基，並且均為3』端修飾巰基，其序列分別為:
[0077]巰基DNAl:5，-TTATAACTATTCCTAAAA-3』 (SEQ ID NO:I)；
[0078]巰基DNA2:5』 -TAGGAATAGTTATAAAAA-3』 (SEQ ID NO:2)。
[0079](b)配製6mL內含IXTBE (I X TBE緩衝溶液的配製為2.16g Tris鹼、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA (pH8.0)溶於200mL超純水中)、0.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和500mM氯化鈉(NaCl)的溶液，用鹽酸(HCl)調節pH為6 ;然後，將還原提純後的巰基DNAl加入到上述溶液中，混合均勻。取10 μ L濃度為50ηΜ的納米金棒(長度為92nm左右，長徑比約為
2.3)加入到上述混合溶液中，混合均勻後，放置於29°C水浴中8h，使巰基DNAl修飾到納米金棒上。
[0080](c)將修飾好巰基DNAl的納米金棒於7000rpm下,離心25min進行提純,取沉澱，溶於200 μ L內含IXTBE和IOOmM NaCl的溶液中。
[0081](d)取30 μ L經還原提純後的巰基DNA2加入到上述修飾好巰基DNAl的納米金棒溶液中(內含IXTBE和IOOmM NaCl )，混合均勻後，放置於PCR儀中，從45°C到25°C緩慢退火12h。然後，將混合物於8500rpm下，離心IOmin進行提純，取沉澱，即為修飾好的納米金棒，溶於超純水中備用。
[0082](2)金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備:
[0083](a)取10 μ L新鮮配製的IOmM的Pd(CH3COO)2溶液，加入到40 μ L濃度為5ηΜ的
修飾好的納米金棒溶液中，搖床震蕩孵育12h。
[0084](b)將上述混合溶液於3500rpm下,離心3min進行提純,取沉澱,溶於60 μ L超純水中；重複步驟(b) 3次。
[0085](C)向上述溶液中加入5 μ L新鮮配製的濃度為IOmM的NaBH4溶液進行還原，即可以得到金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
[0086]圖2是本實施例製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的透射電鏡照片。從圖中可以看出，納米金棒長度約為92nm，寬約為40nm，長徑比約為2.3，其上面的納米鈀粒大小約為3nm，粒徑分布均勻，納米鈀粒與納米金棒之間的距離約為lnm。本發明的方法中，納米金棒的長度和長徑比均不受限制，因此，可以通過本方法調控納米金棒的大小來調節LSPR響應。
[0087]實施例3
[0088]( I)納米金棒的修飾:
[0089]Ca)取10 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:3所示的3』端修飾二硫鍵的DNAl和5 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:4所示的3』端修飾二硫鍵的DNA2，分別加入 I P L 濃度為 200mM 的三(2-羧乙基)勝(tris (2-carboxyethyl) phosphine), TCEP)溶液，進行還原4h。多餘的TCEP用G25吸附柱,在3000rpm下,離心3min進行去除，即可以得到經還原提純後的疏基DNAl和疏基DNA2 ；
[0090]其中，3』端修飾二硫鍵的DNA均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，經HPLC純化。還原得到的巰基DNAl和巰基DNA2均含27個鹼基，並且均為3』端修飾巰基，其序列分別為:
[0091]巰基DNAl:5，-TTATAACTATTCCTATGCGTCTGAAAA-3，(SEQ ID NO:3)；
[0092]巰基DNA2:5』 -TAGGAATAGTTATAATGCGTCTGAAAA-3』 (SEQ ID NO:4)。
[0093](b)配製4mL內含IXTBE (I X TBE緩衝溶液的配製為2.16g Tris鹼、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA (pH8.0溶於200mL超純水中)、0.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和500mM氯化鈉(NaCl)的溶液，用鹽酸(HCl)調節pH為5 ;然後，將還原提純後的巰基DNAl加入到上述溶液中，混合均勻。取5 μ L濃度為IOOnM的納米金棒(長度為34nm左右，長徑比約為3)加入到上述混合溶液中，混合均勻後，放置於29°C水浴中12h，使巰基DNAl修飾到納米金棒上。
[0094](c)將修飾好巰基DNAl的納米金棒於8500rpm下,離心IOmin進行提純,取沉澱，溶於400 μ L內含IXTBE和IOOmM NaCl的溶液中。[0095](d)取5 μ L經還原提純後的巰基DNA2加入到上述修飾好巰基DNAl的納米金棒溶液中(內含IXTBE和IOOmM NaCl )，混合均勻後，放置於PCR儀中，從45°C到25°C緩慢退火24h。然後，將混合物於7000rpm下，離心25min進行提純，取沉澱，即為修飾好的納米金棒，溶於超純水中備用。
[0096](2)金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備:
[0097](a)取20 μ L新鮮配製2.5mM的Pd(CH3COO)2溶液，加入到40 μ L濃度為3ηΜ的修
飾好的納米金棒溶液中，搖床震蕩孵育8h。
[0098](b)將上述混合溶液於5000rpm下,離心3min進行提純,取沉澱,溶於40 μ L超純水中；重複步驟(b) 2次。
[0099](c)向上述溶液中加入5 μ L新鮮配製的濃度為5mM的NaBH4溶液進行還原，即可以得到金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
[0100]圖3是本實施例製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的透射電鏡照片。從圖中可以看出，納米金棒長度約為34nm，寬約為Ilnm，長徑比約為3，其上面的納米鈀粒大小約為4?5nm,納米鈕粒與納米金棒之間的距離約為1.8?2nm。本發明中，納米IE粒與納米金棒之間的距離可以通過調控修飾的巰基DNA的長度來精確調控，從而有助於理解樣品大小和距離對於吸附氫氣性能的影響。
[0101]實施例4
[0102](I)納米金棒的修飾:
[0103](a)取10 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:5所示的5』端修飾二硫鍵的DNAl和5 μ L濃度為100 μ M的序列為SEQ ID NO:6所示的5』端修飾二硫鍵的DNA2，分別加入I μ L濃度為200mM的巰基乙醇(2-巰基乙醇,2-Mercaptoethanol)溶液,進行還原4h。多餘的巰基乙醇用G25吸附柱，在3000rpm下，離心3min進行去除，即可以得到經還原提純後的巰基DNAl和巰基DNA2 ；
[0104]其中，5』端修飾二硫鍵的DNA均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，經HPLC純化。還原得到的巰基DNAl和巰基DNA2均含63個鹼基，並且均為5』端修飾巰基，其序列分別為:
[0105]巰基DNA 1:
[0106]5，-AAAATGCGTCTGTTATAACTATTCCTATACGTTTCAGACATTCCAACTTCATCATCTCATCAA-3，(SEQ ID NO:5)；
[0107]巰基DNA2:
[0108]5，-AAAATGCGTCTGTTGATGAGATGATGAAGTTGGAATGTCTGAAACGTATAGGAATAGTTATAA-3，(SEQ ID NO:6)。
[0109](b)配製4mL內含IXTBE (I X TBE緩衝溶液的配製為2.16g Tris鹼、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA (pH8.0溶於200mL超純水中)、0.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和500mM氯化鈉(NaCl)的溶液，用鹽酸(HCl)調節pH為4 ;然後，將還原提純後的巰基DNAl加入到上述溶液中，混合均勻。取5 μ L濃度為IOOnM的納米金棒(長度為34nm左右，長徑比約為3)加入到上述混合溶液中，混合均勻後，放置於16°C水浴中24h，使巰基DNAl修飾到納米金棒上。
[0110](C)將修飾好巰基DNAl的納米金棒於7000rpm下,離心25min進行提純,取沉澱，溶於400 μ L內含IXTBE和IOOmM NaCl的溶液中。
[0111](d)取5 μ L經還原提純後的巰基DNA2加入到上述修飾好巰基DNAl的納米金棒溶液中(內含IXTBE和IOOmM NaCl )，混合均勻後，放置於PCR儀中，從45°C到25°C緩慢退火24h。然後，將混合物於7000rpm下，離心25min進行提純，取沉澱，即為修飾好的納米金棒，溶於超純水中備用。
[0112](2)金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備:
[0113](a)取20 μ L新鮮配製2.5mM的PdCl2溶液，加入到40 μ L濃度為3ηΜ的修飾好的
納米金棒溶液中，搖床震蕩孵育8h。
[0114](b)將上述混合溶液於5000rpm下,離心3min進行提純,取沉澱,溶於40 μ L超純水中；重複步驟(b) 2次。
[0115](c)向上述溶液中加入5 μ L新鮮配製的濃度為5mM的二甲胺硼烷(Dimethylamine-Borane, DMAB)溶液進行還原，即可以得到金IE雙金屬衛星結構組裝體。
[0116]製備的金鈀雙金屬衛星結構組裝體中，納米金棒長度約為34nm，寬約為llnm，長徑比約為3，其上面的納米鈀粒大小約為7?9nm，納米鈀粒與納米金棒之間的距離約為
3.6 ?3.8nm。
[0117] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特徵以及詳細方法，但本發明並不局限於上述詳細特徵以及詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特徵以及詳細方法才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
【權利要求】
1.一種金鈀雙金屬衛星結構組裝體，其特徵在於，其包括納米金顆粒內核、通過共價鍵與所述納米金顆粒內核連接的巰基DNA、以及與所述巰基DNA的巰基絡合連接的納米鈕粒，所述納米金顆粒內核位於所述納米鈕粒形成的外殼之內。
2.根據權利要求1所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體，其特徵在於，所述納米鈀粒的粒徑為3~9nm,優選3~5nm或7~9nm ； 優選地，所述納米鈕粒與所述納米金顆粒內核之間的距離為I~8nm,優選I~5nm,更優選I~2nm。
3.根據權利要求1或2所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體，其特徵在於，所述巰基DNA的兩端分別修飾有巰基，其中一端的巰基與所述納米金顆粒共價鍵連接，另一端的巰基與所述納米鈀粒的鈀離子絡合連接； 優選地，所述巰基DNA為雙鏈巰基DNA，其中每條鏈均在3』端或均在5』端修飾有巰基，優選3』端修飾有巰基； 優選地，所述雙鏈巰基DNA是兩條單鏈巰基DNA通過鹼基互補配對原則發生退火雜交得到的； 優選地，所述單鏈巰基DNA是單鏈二硫鍵DNA的二硫鍵發生還原得到的； 優選地，所述雙鏈巰基DNA的兩端分別有若干個鹼基的單鏈部分，優選有I~12個鹼基的單鏈部分，更優選有2~3個鹼基的單鏈部分。
4.根據權利要求1~3任一項所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體，其特徵在於，所述納米金顆粒的形狀選自棒狀、球形、錐形、三角形、圓盤形、星形和帶狀中的一種或多種； 優選地，所述納米金顆粒為納米金棒； 優選地，所述納米金棒為任意長徑比的納米金棒，優選長徑比為1.5~10的納米金棒，更優選長徑比為2~5的納米金棒，特別優選長徑比為2~3的納米金棒。
5.一種如權利要求1~4任一項所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體的製備方法，其特徵在於，所述方法包括將連接有巰基DNA的納米金顆粒與鈀離子接觸，通過所述鈀離子與所述巰基DNA的巰基絡合，再經還原而形成納米鈀粒，從而得到所述金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: (1)將兩條具有鹼基互補配對關係的單鏈二硫鍵DNA通過還原劑分別還原為兩條單鏈巰基DNA ； (2)使其中一條單鏈巰基DNA與納米金顆粒反應，生成帶有單鏈DNA的納米金顆粒，其中所述單鏈DNA與納米金顆粒通過巰基與金之間形成的共價鍵連接； (3)使所述帶有單鏈DNA的納米金顆粒與另一條單鏈巰基DNA發生退火雜交,生成帶有雙鏈巰基DNA的納米金顆粒，其中所述雙鏈巰基DNA的自由端帶有巰基； (4)將所述帶有雙鏈巰基DNA的納米金顆粒與含有鈀離子的溶液反應，使鈀離子與所述雙鏈疏基DNA的自由端的疏基發生絡合反應； (5)使用還原劑還原步驟(4)得到的絡合產物，形成納米鈀粒，從而得到所述金鈀雙金屬衛星結構組裝體。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟(I)的還原劑選自三(2-羧乙基)膦、巰基乙醇和二硫蘇糖醇中的一種或多種，優選三(2-羧乙基)膦；優選地，所述步驟(I)還原的時間為4~12h ; 優選地，所述步驟(I)還原後，去除多餘的還原劑得到純化的單鏈巰基DNA ； 優選地，所述單鏈二硫鍵DNA的3』端或5』端、優選3』端修飾有二硫鍵； 優選地，所述步驟(2)的納米金顆粒的形狀選自棒狀、球形、錐形、三角形、圓盤形、星形和帶狀中的一種或多種，更優選地，所述納米金顆粒為納米金棒； 優選地，所述步驟(2)具體為:在反應緩衝液中，將步驟(I)所得的一條單鏈巰基DNA與納米金棒混合均勻，在15~30°C下反應，生成帶有單鏈DNA的納米金棒，其中所述單鏈DNA與納米金棒通過巰基與金之間形成的共價鍵連接； 優選地，所述步驟(2)反應時間為8~24h ; 優選地，所述步驟(2)反應後，離心、提純生成的帶有單鏈DNA的納米金棒； 優選地，所述步驟(3)退火雜交為從45°C到25°C緩慢退火12~36h ； 優選地，所述步驟(3)退火雜交後，離心、提純生成的帶有雙鏈巰基DNA的納米金棒。
8.根據權利要求6或7所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟(4)具體為:將步驟(3)生成的帶有雙鏈巰基DNA的納米金棒與鈀鹽溶液反應，使鈀離子與巰基發生絡合反應； 優選地，所述鈀鹽溶液為醋酸鈀、氯化鈀和硫酸鈀溶液中的一種或多種的混合，優選醋酸鈕溶液； 優選地，所述醋酸鈀溶液.的濃度為2.5~IOmM ; 優選地，所述步驟(4)反應在搖床震蕩下，孵育4~12h ; 優選地，所述步驟(4)反應後，離心、提純生成的絡合產物； 優選地，重複所述離心、提純的步驟2~3次； 優選地，所述步驟(5)的還原劑選自硼氫化鈉、二甲胺硼烷、檸檬酸、檸檬酸鈉、抗壞血酸和抗壞血酸鈉中的一種或多種，優選硼氫化鈉。
9.一種如權利要求1~4任一項所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體在目標生化物質的催化活性的檢測和/或光學傳感、化學傳感、生物傳感方面的應用，優選在單一組裝體的響應信號的檢測中的應用。
10.一種如權利要求1~4任一項所述的金鈀雙金屬衛星結構組裝體在氫氣檢測中的應用，優選利用光學傳感器進行氫氣檢測中的應用。
【文檔編號】B01J20/28GK103464108SQ201310412978
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】丁寶全, 李娜, 湛鵬飛, 石黨委, 申西波, 劉清, 宋晨, 王金業 申請人:國家納米科學中心