遺傳修飾的噬菌體及其用途
2023-06-04 13:27:31 1
遺傳修飾的噬菌體及其用途
【專利摘要】本發明涉及遺傳修飾的噬菌體及其在生產目的生物分子的方法中的用途。
【專利說明】遺傳修飾的噬菌體及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及在生物學系統中生產目的生物分子的領域。具體而言，本發明涉及遺傳修飾的噬菌體，及其為避免對培養基肉湯和/或細菌裂解物的噬菌體汙染的用途。
【背景技術】
[0002]細菌細胞是用於生產生物分子尤其是靶蛋白質的首選系統。除了其它優點之外，細菌系統容易使用並且可以在有限的培養體積中快速生產大量的蛋白質。
[0003]最廣泛且經常使用的細菌系統之一是噬菌體T7表達系統。該細菌系統描述於US4, 952，496中。在該系統中，編碼靶蛋白的基因被置於T7啟動子控制下，並被轉化進入到包含整合的λ DE3溶原噬菌體的細菌宿主中，常常是大腸桿菌(E.coli)中。XDE3溶原噬菌體攜帶著編碼處於lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶的基因。當在包含IPTG的培養基中培養時，T7RNA聚合酶的表達被誘導，並且使得靶蛋白表達。
[0004]由於T7RNA聚合酶基因(T7基因I)被整合到Int基因序列內，λ DE3噬菌體在其進入到溶菌期的能力方面具有缺陷。然而，在一些蛋白質的生產過程中並且在任何其它噬菌體缺乏下觀察到細菌裂解，表明DE3噬菌體可以恢復其裂解特性。細菌裂解以及更甚者培養基肉湯中感染性噬菌體的存在很 成問題，因為(i)它使得所生產的靶蛋白在一些應用中諸如例如藥物應用中的使用大打折扣，(?)為了去除任何微量噬菌體的去汙染過程需要生產線的關閉和培養批次的完全更新，以及(iii)其極大降低重組蛋白的產率。
[0005]使用曬菌體的備選方法也有所描述:
[0006]W003/050240描述了用於在宿主細胞中生產靶蛋白的表達系統，包含使用同源重組所整合的編碼T7RNA聚合酶的基因。然而，由於T7RNA聚合酶基因的大小，以及由於同源重組不易於在所有大腸桿菌菌株中進行的事實(如Phue等，Biotechnology andBioengineering，101，831-836，2008 中所提及)，W003/050240 的系統難以實施。因此，攜帶T7RNA聚合酶整合的轉化細胞的數量仍然非常低或者得不到這些細胞。此外，使用同源重組時必需使用選擇標記，以篩選包含T7RNA聚合酶基因整合的細菌。該標記對於另外的篩選步驟不是可用的並且對於菌株的最終使用是不希望有的。例如，常常使用的選擇標記是抗生素抗性基因，但是推薦在生物藥物生產中避免使用這些基因。因此，為了從該菌株中去除抗生素抗性基因需要額外的步驟，並且這不一定能夠實現。
[0007]W02008/139153描述了另一表達系統，其中宿主細胞以包含T7RNA聚合酶表達盒的質粒轉化。然而，由於使用質粒，宿主細胞必須維持在選擇條件下以確保它們仍然包含質粒。此外，質粒會頻繁進行重組，這有損表達系統。
[0008]因此，需要生產目的生物分子的新方法，其中，當使用噬菌體時，培養物在生長或者蛋白質生產過程中不被感染性噬菌體汙染或者不被無意裂解。
[0009]因此本發明提供遺傳修飾的噬菌體，其在培養過程中不會恢復其裂解特性，由此使得目的生物分子的生產中無噬菌體汙染。
【發明內容】
[0010]本發明的一個目標是遺傳修飾的噬菌體，其中
[0011]-表達系統被插入，
[0012]-S和/或R基因被滅活。
[0013]在本發明的一個實施方案中，Int和/或Xis基因被滅活。
[0014]本發明的另一個目標是遺傳修飾的噬菌體，其中
[0015]-表達系統被插入，
[0016]_S、R和/或Q基因被滅活，和
[0017]-1nt和/或Xis基因被滅活。
[0018]在本發明的另一個實施方案中，Rz基因被滅活。
[0019]在本發明的另一個實施方案中，表達系統被插入並且Int基因、Xis基因以及R、S和Rz基因被滅活。
[0020]在本發明的另一個實施方案中，表達系統被插入並且Int基因、Xis基因以及Q、R、S和Rz基因被滅活。
[0021]在本發明的另一個實 施方案中，表達系統是T7表達系統。
[0022]在本發明的另一個實施方案中，噬菌體是λ噬菌體、434噬菌體、phi80噬菌體、phi81噬菌體、HK97噬菌體、P21噬菌體。
[0023]在本發明的另一個實施方案中，如上所述的遺傳修飾的噬菌體具有SEQ ID NO: 10的序列。在本發明的另一個實施方案中，如上所述的遺傳修飾的噬菌體是噬菌體PlI至P53中之一。
[0024]本發明的另一個目標是包含如上所述的遺傳修飾的噬菌體和輔助噬菌體的試劑盒。
[0025]本發明的另一個目標是包含如上所述的遺傳修飾的噬菌體的宿主細胞。
[0026]在本發明的一個實施方案中，宿主細胞是腸桿菌(enterobacteria),優選大腸桿菌(E.Coli)，更優選 BL21。
[0027]在本發明的另一個實施方案中，如上所述的宿主細胞還包含基因tonA、galK、araB、araA、1n、ompT、rcsA、hsdR、mrr、endA 和 recA 中的至少一個基因的滅活。
[0028]在本發明的另一個實施方案中，如上所述的宿主細胞包含ccdb基因的插入。
[0029]本發明的另一個目標是包含如上所述的宿主細胞和含ccdA基因的質粒的試劑盒。
[0030]本發明的另一個目標是用於製備如上所述的宿主細胞的方法，包括以如上所述的遺傳修飾的噬菌體感染宿主細胞。
[0031]本發明的另一個目標是用於生產目的生物分子的方法，包括
[0032]-培養包含根據權利要求1至7任一項的遺傳修飾的噬菌體和目的生物分子的核酸序列的宿主細胞，
[0033]-收集所述目的生物分子。
【具體實施方式】
[0034]本發明涉及遺傳修飾的噬菌體，其中噬菌體恢復其裂解特性的能力被限制。[0035]發明人致力於對噬菌體的遺傳修飾。令人意外的是，發明人證明，不可能使被整合噬菌體的所有病毒序列缺失，因為在該情況下被感染細菌的生存力嚴重受損。具體而言，發明人證明，包含ral基因和N基因編碼序列的DNA片段的缺失會導致宿主細胞死亡(見實施例)。該結果是令人意外的，因為並不知道ral和N基因參與到溶原狀態中#基因僅僅被描述為是裂解生長所必需的。相反，在溶原狀態中，噬菌體的阻抑物，被稱為Cl或C2，阻斷N和ral的表達。
[0036]因此，本發明涉及遺傳修飾的噬菌體，其中
[0037]-表達系統被插入，和
[0038]-至少Int、Xis、R、S、Q和Rz基因中之一被滅活。
[0039]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S基因被滅活。
[0040]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且R基因被滅活。
[0041]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且Q基因被滅活。
[0042]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Int基因被滅活。
[0043]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且Xis基因被滅活。
[0044]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S和Int基因被滅活。
[0045]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S和Xis基因被滅活。
[0046]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S和R基因被滅活。
[0047]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S和Rz基因被滅活。
[0048]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S和Q基因被滅活。
[0049]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且R和Rz基因被滅活。
[0050]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且R和Int基因被滅活。
[0051]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R和Xis基因被滅活。
[0052]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且R和Q基因被滅活。
[0053]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且Q和Rz基因被滅活。
[0054]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且Q和Int基因被滅活。
[0055]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且Q和Xis基因被滅活。
[0056]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Int和Xis基因被滅活。
[0057]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Int和Rz基因被滅活。
[0058]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Int和R基因被滅活。
[0059]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Xis和Rz基因被滅活。
[0060]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Xis和R基因被滅活。
[0061]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S、R和Rz基因被滅活。
[0062]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S、R和Q基因被滅活。
[0063]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S、Q和Rz基因被滅活。
[0064]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S、Q和Int基因被滅活。
[0065]在一個實施方案中，遺傳修飾的嗷菌體包含表達系統並且S、Q和Xis基因被滅活。[0066]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Int和Xis基因被滅活。
[0067]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Int和Rz基因被滅活。
[0068]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Xis和Rz基因被滅活。
[0069]在一個實施方案中，遺傳修飾的卩遼菌體包含表達系統並且R、Q和Rz基因被滅活。
[0070]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Xis和Q基因被滅活。[0071 ]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Int和Q基因被滅活。
[0072]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、Int和Rz基因被滅活。
[0073]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、Int和Xis基因被滅
活。
[0074]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、Xis和Rz基因被滅活。
[0075]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Int、Xis和Rz基因被滅活。
[0076]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Int、Xis和R基因被滅活。
[0077]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Int、R和Rz基因被滅活。
[0078]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、R、Xis和Rz基因被滅活。
[0079]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Rz、Xis和Int基因被滅活。
[0080]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、R、Rz和S基因被滅活。
[0081]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、R、Rz和Int基因被滅活。
[0082]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、R、S和Int基因被滅活。
[0083]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、Rz、S和Int基因被滅活。
[0084]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、R、Rz和Xis基因被滅活。
[0085]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、R、S和Xis基因被滅活。
[0086]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、Rz、S和Xis基因被滅活。[0087]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、R、Int和Xis基因被滅活。
[0088]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、Rz、Int和Xis基因被滅活。
[0089]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且Q、S、Int和Xis基因被滅活。
[0090]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、R、Rz, Xis和Int基因被滅活。
[0091]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、R、Q、Rz和Xis基因被滅活。 [0092]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、R、Q、Rz和Int基因被滅活。
[0093]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、R、Q、Xis和Int基因被滅活。
[0094]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、Q、Rz, Xis和Int基因被滅活。
[0095]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且R、Q、Rz、Xis和Int基因被滅活。
[0096]在一個實施方案中，遺傳修飾的噬菌體包含表達系統並且S、R、Q、Rz、Xis和Int基因被滅活。
[0097]可以用於本發明的曬菌體實例包括，但不限於，λ曬菌體、λ樣(lambda-1 ike)和λ形(Iambdoid)噬菌體。λ噬菌體也稱作大腸桿菌噬菌體λ，它是感染大腸桿菌的病毒。λ是溫和噬菌體。λ樣噬菌體組成一個特徵為具有非收縮性長尾的噬菌體和古細菌病毒家族。λ形噬菌體是λ噬菌體的天然親緣物。它們當中大多數在大腸桿菌上生長，但是極少數來源於其它的宿主細胞，諸如，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。這些曬菌體具有與λ相同的基因順序。
[0098]可以在本發明中使用的λ樣和λ形噬菌體的實例包括，但不限於，大腸桿菌噬菌體 434、phi80、phi81、HK97、P21 和 P22。
[0099]在一個實施方案中，噬菌體是λ (腸桿菌噬菌體λ，登錄號NC_001416)。λ噬菌體的基因組組織示於下表1中。
[0100]
【權利要求】
1.遺傳修飾的噬菌體，其中 -表達系統被插入， -S、R和/或Q基因被滅活，和 -1nt和/或Xis基因被滅活。
2.根據權利要求1的遺傳修飾的噬菌體，其中Rz基因被滅活。
3.根據權利要求1至2任意一項的遺傳修飾的噬菌體，其中 -表達系統被插入， -1nt基因、Xis基因以及R、S和Rz基因被滅活。
4.根據權利要求1至2任意一項的遺傳修飾的噬菌體，其中 -表達系統被插入， -1nt基因、Xis基因以及Q、R、S和Rz基因被滅活。
5.根據權利要求1至4任意一項的遺傳修飾的曬菌體,其中所述表達系統是T7表達系統。
6.根據權利要求1至5任意一項的遺傳修飾的曬菌體,其中所述曬菌體是λ曬菌體、434噬菌體、phi80噬菌體、phi81噬菌體、HK97噬菌體、P21噬菌體。
7.根據權利要求1至6任意一項的遺傳修飾的噬菌體，其中所述噬菌體是噬菌體Pll至P53中之一。
8.包含根據權利要求1至7任意一項的遺傳修飾的噬菌體和輔助噬菌體的試劑盒。
9.包含根據權利要求1至7任意一項的遺傳修飾的噬菌體的宿主細胞。
10.根據權利要求9的宿主細胞,其中所述宿主細胞是腸桿菌(enterobacteria),優選大腸桿菌(E.Co I i )，更優選BL21。
11.根據權利要求9至10任意一項的宿主細胞,還包含基因tonA、galK、araB、araA、1n、ompT、rcsA、hsdR、mrr、endA 和 recA 中至少一個基因的滅活。
12.根據權利要求9至11任意一項的宿主細胞，包含ccdb基因的插入。
13.包含根據權利要求12的宿主細胞和含ccdA基因的質粒的試劑盒。
14.用於製備根據權利要求9至12中任意一項的宿主細胞的方法，包括以根據權利要求I至7中任意一項的遺傳修飾的噬菌體感染宿主細胞。
15.用於生產目的生物分子的方法，包括 -培養包含根據權利要求1至7中任意一項的遺傳修飾的噬菌體和目的生物分子的核酸序列的宿主細胞， -收集所述目的生物分子。
【文檔編號】C12N7/00GK103797113SQ201280042917
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2011年7月7日
【發明者】C·斯派爾 申請人:德爾菲遺傳學公司