一種基於ssr標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法

2023-06-19 08:54:16 2

一種基於ssr標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法
【專利摘要】本發明提出的是一種水稻指紋圖譜的構建方法。具體的方法包括提取水稻基因組DNA，篩選多態性好的SSR螢光引物，對水稻品種的DNA進行PCR擴增，利用毛細管凝膠電泳檢測PCR產物，通過數據分析獲得0-1矩陣圖，並將0-1矩陣圖轉化為指紋模式圖譜。本發明應用SSR的多態性與毛細管凝膠電泳技術高解析度的特性，不僅可以分辨出條帶大小相差1bp的多態性條帶，且易於自動化，操作簡單，結果穩定可靠，易於大規模、多批次的數據整合與分析，適用於大量水稻品種指紋圖譜的構建。
【專利說明】—種基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物信息【技術領域】，具體涉及的是一種基於SSR螢光標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法。
【背景技術】
[0002]水稻是我國主要糧食作物之一，也是我國植物新品種保護條例涵蓋的第一批保護作物之一。水稻種苗的真實性是衡量種苗質量的重要指標，直接影響水稻的產量、品質和經濟效益。當前我國水稻種子和種苗存在純度低、品質混雜、以次充好的現象，各級農作物品種審定機構和種子種苗生產部門對水稻品種偽劣鑑定日益重視，但是，水稻種子資源形態特徵較為相似，特別是雜交種子表面上很難區分。傳統的形態鑑定法依賴於表型差異，而形態性狀受到氣候、環境、營養狀態和生物期等多種因素的影響，使得形態鑑定法的工作量加大，鑑定周期長。構建水稻指紋圖譜，是現階段控制水稻內在質量的有效手段。
[0003]DNA分子標記能反映生物個體或種群基因組中某種差異特徵的DNA片段，可以從根本上揭示植物內在的基因差異，近年來已經廣泛應用到作物品種鑑定和種質資源分類等研究領域。其中SSR (Simple sequence repeat)標記由於具有多態性高、數量豐富、遺傳上呈共顯性、結果穩定可靠、實驗操作簡單、引物序列易交流等優點，在水稻指紋圖譜構建中表現出更為突出的應用價值。
[0004]傳統的SSR-PCR擴增產物主要通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯凝膠電泳等生物技術來進行多態性分析的，這些方法雖然比較成熟但卻非自動化，耗時、耗力，且不能準確讀出擴增片段大小，難以統一處理不同批次的反應數據，在大規模、多批收集和分析數據時，仍具有相當大的難度。毛細管電泳(Capillay Electrophoresis, CE)是20世紀80年代後期在全球範圍內迅速崛起的一種分離分析技術，該技術利用與遺傳系統相匹配的電腦軟體完成對數據的統一處理，操作簡便，實現了分子標記研究與高效、自動化技術的結合，並且能準確讀出擴增等位基因片段的大小，減少了人為誤差，使得鑑定結果更為精確，更適用於水稻指紋圖譜的建立。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種高通量、容易實現自動化、結果準確可靠的水稻品種的鑑定方法，解決水稻純度和真偽的鑑定難題，也可以對商品大米進行品種鑑定，保護品種所有人的合法智慧財產權。
[0006]本發明所提供的水稻品種的鑑定方法，包括以下步驟:
(I)提取高質量水稻基因組DNA ; (2)用篩選的SSR螢光引物進行PCR擴增；(3)將所得擴增產物進行毛細管凝膠電泳檢測；(4)得出所擴得條帶大小；(5)通過數據統計分析獲得0-1矩陣圖；(6)根據0-1矩陣圖繪製指紋模式圖譜的膠板圖。
[0007] 作為本發明的進一步限定，所述水稻基因組DNA的提取方法為:(1)剪取0.02~0.04 cm2的水稻新鮮嫩葉裝入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取緩衝液，加入0.2 μ I的100mg/ml蛋白酶K和1μ I的10 mg/ml核糖核酸酶,用PCR板矽膠蓋封蓋好後於漩渦振蕩儀上混勻；(2)在PCR擴增儀中設置以下反應程序並保存:首先設置溫度為37°C，時間為30 min ;接著設置溫度為68°C，時間為20 min ;然後設置溫度為37°C，時間為30 min ;最後設置溫度為4°C，時間為; (3)將步驟(1)得到的PCR板放入設置好的PCR儀中進行反應；(4)反應結束後立刻將PCR板轉置於冰面上進行冰浴10 min ; (5)將PCR板放入冷凍離心機中，在4°C下3000 rpm離心10 min，取上清液即得DNA溶液，置於_20°C保存備用。
[0008]作為本發明的進一步限定，所述SSR螢光引物為適用於水稻指紋圖譜構建的5對核心引物，其中正向引物5』端以「CY5 」磷螢光染料標記，合成螢光引物，並避光保存，所述的5對核心引物信息如下:
引物名稱:RM206，引物序列:正向:5』 -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3』，反向:5』 -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3』，鹼基重複:CT ；
引物名稱:RM71，引物序列:正向:5』 -CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3』，反向:5』 -GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3』，鹼基重複:(ATT) IOT (ATT) 4 ；
引物名稱:觀85，引物序列:正向:5』 -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3』，反向:5』 -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3』，鹼基重複:(TGG) 5 (TCT) 12，；
引物名稱:RM311，引物序列:正向:5』 -TGGTAGTATAGGTACTAAACAT-3』，反向:5』 -TCCTATACACATACAAACATAC-3』，鹼基重複= (GT)3(GTAT)8(GT)5 ；
引物名稱:RM297，引物序列:正向:5』-TCTTTGGAGGCGAGCTGAG-3』，反向:5』 -CGAAGGGTACATCTGCTTAG-3』，鹼基重複:(GA)13。
[0009]作為本發明的進一步限定，所述PCR擴增的擴增程序為:首先94°C預變性5 min ；隨後的30個循環為:94°C變性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸30 sec ;最後72°C下延伸 10 min。
[0010]作為本發明的進一步限定，所述毛細管電泳檢測方法為:首先打開BECKMANCOULTER CEQ 8000遺傳分析系統儀毛細管通道蓋，卸下毛細管陣列，清洗毛細管檢測窗口，安裝毛細管和凝膠，將毛細管溫度調整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重複3次模式進行初級管路衝洗，執行毛細管充膠，重複3次，執行光路聚集，監控儀器基線，使系統背景值低於6000RFU ;然後輸入樣品名，選擇電泳分離方法和數據分析方法，保存樣本信息；最後使用去離子水衝洗水 槽三次，加入去離子水至標線,擦乾水槽外表面,裝入水槽,放入樣本板和緩衝液板，開始運行樣本，PCR產物與Genescan-400分子量標準品的螢光信號均由基因分析儀自動保存。
[0011]作為本發明的進一步限定，所述系統背景值應低於6000RFU，清洗檢測窗口後，執行光學校正和監控基線，如果背景值仍在6000RFU之上，需重複清洗程序，直至背景值低於6000RFU ；
作為本發明的進一步限定，所述程序中使用的水必須是滅菌去離子水；所用的去離子水電導率一般為18.2MQ/CM ；
作為本發明的進一步限定，所述樣板中為Gemescan-400 (分子量內標_400)，上樣緩衝液甲醯胺(SLS)和稀釋後的PCR擴增產物的混合液，將上樣板在渦旋震蕩器上震蕩30s或者用槍頭混勻10次，且不能出現氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品；在緩衝液板與上樣板對應的孔內加入3/4體積的分離緩衝液。
[0012]作為本發明的進一步限定，所述數據分析方法為:用GeneMapper-V3.0軟體對BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，通過人工分析與軟體統計得出不同參試材料的SSR標記的擴增片段，利用軟體將SSR標記片段與Genescan-400分子量標準品比較，得到SSR標記片段長度大小。在所有SSR標記片段上，參試材料中若擴增出記為「1」，無擴增出記為「0」，並對數據進行二維數據統計分析。
[0013]本發明篩選出了 5對多態性豐富、帶型清晰、穩定性好、重複性高的SSR核心引物。
[0014]本發明應用毛細管凝膠電泳技術對SSR-PCR擴增產物進行檢測，該技術利用與遺傳分析系統相匹配的電腦軟體完成對數據的統一處理，操作簡便，實現了分子標記研究與高效、自動化技術的結合，將PCR產物和標準分子量樣品(內標)在同一泳道中進行電泳，精確分析擴增產物的片段長度，避免了人為誤差，使實驗結果更加準確。
[0015]除此之外，按照本發明所述方法還可以將本發明所選水稻品種之外的其他水稻品種或者將現有所知的所有水稻品種構建標準水稻品種的SSR指紋圖譜，如此便可鑑定更多的待測水稻品種。
[0016]由以上技術方案可知，本發明應用SSR分子標記技術從遺傳本質上對水稻品種進行準確鑑定，解決了長期以來水稻品種鑑定困難的問題，且具有高通量，簡單、易操作，結果準確可靠，為我國水稻品種的準確鑑定、育種利用和新品種權保護提供了重要依據，為我國水稻品種標準指紋庫的構建奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1、圖2、圖3分別為引物RM297、RM206、RM311對22個水稻品種的擴增指紋模式圖譜，圖譜中黑色區域代表每個樣品的指紋，由圖可以看出篩選出的SSR引物能夠將22個水稻品質特異的區分開。
【具體實施方式】
[0018]實施例:水稻品種SSR指紋圖譜的構建 實驗材料為選取的22種常用水稻品種。
[0019]1、基因組DNA的提取
(1)用75%的酒精擦洗過的剪刀剪取0.02、.04 cm2的葉片裝入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取緩衝液，加入0.2 μ I的100 mg/ml蛋白酶K和I μ I的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板矽膠蓋封蓋好後於漩渦振蕩儀上混勻10 sec ；
(2)在PCR擴增儀中設置以下反應程序並保存:首先設置溫度為37°C，時間為30min ；接著設置溫度為68°C，時間為20 min ;然後設置溫度為37°C，時間為30 min ;最後設置溫度為4°C，時間為無窮； (3)將步驟(1)得到的PCR板放入設置好的PCR儀中進行反應；
(4)反應結束後立刻將PCR板轉置於冰面上進行冰浴10min ；
(5)將PCR板放入冷凍離心機中，在4°C下3000rpm離心10 min，取上清液即得DNA溶液，置於_20°C保存備用；2.PCR擴增
PCR 反應體系(10 μ I):1 μ I 25 ng/μ I DNA 模板、I μ I IOXBuffer (含 20 mMMg2+)>0.2 μ I 10 mM dNTP、0.4 μ I 10 mol/L SSR 引物、0.I μ I DNA pfu 酶(5 U/μ I),加ddH20至20 μ I (試劑購自生工生物工程股份有限公司)。
[0020]PCR擴增程序:首先94°C預變性5 min ;隨後的30個循環為:94°C變性30 sec,55°C退火 30 sec，72°C延伸 30 sec ;最後 72°C下延伸 10 min。
[0021] 3.毛細管凝膠電泳檢測
(1)打開BECKMANCOULTER CEQ 8000 (美國，BECKMAN公司生產)遺傳分析系統儀毛細管通道蓋，卸下毛細管陣列，清洗毛細管檢測窗口 ；
(2)安裝毛細管和凝膠，將毛細管溫度調整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重複3次模式進行初級管路衝洗，執行毛細管充膠，重複3次，執行光路聚集，監控儀器基線，使系統背景值低於6000RFU，如果背景值仍在6000RFU之上，需重複清洗程序；
(3)將所得到的PCR產物稀釋100倍，在96孔上樣板的各孔中分別加入20μL SLS(上樣緩衝液，甲醯胺)、0.2 μL Genescan-400分子量標準品和I μL稀釋後的PCR產物，在渦旋震蕩器上震蕩30 sec混勻，且不能出現氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品，即得上樣板。
[0022](4)在緩衝液板與上樣板對應的孔內加入3/4體積的分離緩衝液；
(5)在基因分析儀Setup程序中輸入樣品名，設定電泳分離程序為90°C變性2 min；進樣電壓2 kV，時間30 sec ;分離電壓7.5 kV，時間40 min，保存樣本信息；
(6)使用去離子水衝洗水槽三次，加入去離子水至標線，擦乾水槽外表面，裝入水槽，放入配製好的樣本板和緩衝液板,開始運行樣本，PCR產物與Genescan-400分子量標準品的螢光信號均由基因分析儀自動保存；
4.數據分析
用GeneMapper-V3.0軟體對BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，通過人工分析與軟體統計得出各供試材料的SSR標記的擴增片段，軟體系統將根據擴增片段目標峰的位置與同一泳道中的Genescan-400分子量標準品進行比較，得到SSR標記片段長度大小。在所有SSR標記片段上，參試材料中若擴增出記為「1」，無擴增出記為「0」，建立各個SSR引物在22份水稻材料中擴增片段的0-1矩陣圖，根據0-1矩陣圖繪製指紋模式圖譜的膠板圖。圖1、圖2、圖3分別為引物RM297、RM206、RM311對22份水稻材料的擴增指紋模式圖，黑色區域代表每個樣品的指紋。由圖中可以看出，每個樣品的指紋都是唯一的，說明所選引物都能很好的區分每個供試品種，可用於水稻指紋圖譜的構建。
[0023]按照本實施例方法構建指紋圖譜，共重複3次，每次結果均一致。說明SSR螢光標記和毛細管電泳技術相結合，檢測結果穩定可靠，適用於水稻指紋圖譜的構建。
【權利要求】
1.一種基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，包括以下步驟:(I)提取水稻基因組DNA ; (2)用篩選的SSR螢光引物進行PCR擴增；(3)將所得擴增產物進行毛細管凝膠電泳檢測；(4)得出所擴得條帶大小；(5)通過數據統計分析獲得0-1矩陣圖；(6)根據0-1矩陣圖繪製指紋模式圖譜的膠板圖。
2.根據權利要求1所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，所述提取水稻基因組DNA的方法為:(I)剪取0.02、.04 cm2的水稻新鮮嫩葉裝入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取緩衝液，加入0.2 μ I的100 mg/ml蛋白酶K和I μ I的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板矽膠蓋封蓋好後於漩渦振蕩儀上混勻；(2)在PCR擴增儀中設置以下反應程序並保存:首先設置溫度為37 °C，時間為30 min;接著設置溫度為68 °C,時間為20 min ;然後設置溫度為37 °C,時間為30 min ;最後設置溫度為4°C，時間為無窮；(3)將步驟(1)得到的PCR板放入設置好的PCR儀中進行反應；(4)反應結束後立刻將PCR板轉置於冰面上進行冰浴10 min ; (5)將PCR板放入冷凍離心機中，在4℃下3000 rpm離心10 min，取上清液即得DNA溶液，置於-20 °C保存備用。
3.根據權利要求1所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，所述SSR螢光引物為適用於水稻指紋圖譜構建的5對核心引物，其中正向引物5』端以「CY5」磷螢光染料標記，合成螢光引物，並避光保存，所述的5對核心引物信息如下: 引物名稱:RM206，引物序列:正向:5』 -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3』，反向:5』 -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3』，鹼基重複:CT ； 引物名稱:RM71，引物序列:正向:5』 -CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3』，反向:5』 -GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3』，鹼基重複:(ATT) IOT (ATT) 4 ； 引物名稱:觀85，引物序列:正向:5』 -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3』，反向:5』 -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3』，鹼基重複:(TGG) 5 (TCT) 12，； 引物名稱:RM311，引物序列:正向:5』 -TGGTAGTATAGGTACTAAACAT-3』，反向:5』 -TCCTATACACATACAAACATAC-3』，鹼基重複= (GT)3(GTAT)8(GT)5 ； 引物名稱:RM297，引物序列:正向:5』-TCTTTGGAGGCGAGCTGAG-3』，反向:5』 -CGAAGGGTACATCTGCTTAG-3』，鹼基重複:(GA)13。
4.根據權利要求1所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，所述PCR擴增的擴增程序為:首先94 °C預變性5 min;隨後的30個循環為:94 °C變性 30 sec, 55 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 30 sec ;最後 72 °C下延伸 10 min。
5.根據權利要求1所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，所述毛細管凝膠電泳檢測方法為:首先打開遺傳分析系統儀毛細管通道蓋，卸下毛細管陣列，清洗毛細管檢測窗口，安裝毛細管和凝膠，將毛細管溫度調整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重複3次模式進行初級管路衝洗，執行毛細管充膠，重複3次，執行光路聚集，監控儀器基線，使系統背景值低於6000RFU ;然後輸入樣品名，選擇電泳分離方法和數據分析方法,保存樣本信息；最後使用去離子水衝洗水槽三次,加入去離子水至標線,擦乾水槽外表面，裝入水槽，放入樣本板和緩衝液板，開始運行樣本，PCR產物與Genescan-400分子量標準品的螢光信號均由基因分析儀自動保存。
6.根據權利要求5所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，所述毛細管電泳檢測方法的系統背景值應低於6000RFU，清洗檢測窗口後，執行光學校正和監控基線，如果背景值仍在6000RFU之上，需重複清洗程序，直至背景值低於6000RFU。
7.根據權利要求5所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，程序中使用的水必須是滅菌去離子水。
8.根據權利要求5所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，樣品板中為Gemescan-400，上樣緩衝液甲醯胺和稀釋後的PCR擴增產物的混合液，將上樣板在渦旋震蕩器上震蕩30 sec或者用槍頭混勻10次，且不能出現氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品；在緩衝液板與上樣板對應的孔內加入3/4體積的分離緩衝液。
9.根據權利要求1所述的基於SSR標記和毛細管電泳技術的水稻指紋圖譜構建方法，其特徵在於，所述的數據分析方法為:用GeneMapper-V3.0軟體對BECKMAN COULTER CEQ8000遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，通過人工分析與軟體統計得出不同參試材料的SSR標記的擴增片段，利用軟體將SSR標記片段與Genescan-400分子量標準品比較，得到 SSR標記片段長度大小，在所 有SSR標記片段上，參試材料中若擴增出記為「 1」，無擴增出記為「0」，並對數據進行二維數據統計分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911442SQ201410094041
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】梁俊, 陳遠孟, 劉守廷, 覃紅萍, 甘國勇, 莫璋紅, 宋雪萍, 蔣天成, 趙晶, 蘇小玲, 劉廣林, 陳傳華, 唐梅, 張宗瓊, 羅群昌, 梁益珍, 李碧紅 申請人:南寧益譜檢測技術有限公司, 廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所, 廣西壯族自治區分析測試研究中心, 南寧泰格瑞農業科技有限公司