一種α1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒的製作方法

2023-06-20 02:16:46 1

一種α1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種α1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，屬於臨床體外檢測試劑【技術領域】。本發明試劑盒包括試劑R1、試劑R2、校準品。通過在試劑R1中加入一定量的二氧化矽包覆的磁性納米顆粒，在試劑R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Proclin-300，有效的提高了試劑盒的分析靈敏度和穩定性，其線性範圍也較好，試劑的準確度高，有利於在市場中進一步的推廣使用。
【專利說明】-種a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及臨床體外檢測試劑【技術領域】，特別涉及一種a 1-抗胰蛋白酶免疫比 濁法檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] a 1-抗胰蛋白酶(簡稱a I-AT或AAT)是一種糖蛋白。含糖10%?20%，主要由肝臟 合成。它是血清中最主要的蛋白酶抑制劑，對凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用；也是 一種急性時相反應蛋白，在炎症性疾患時，a 1-抗胰蛋白酶可透過毛細血管進入組織液，在 炎症局部往往濃度很高，對急性炎性疾病有一定限制作用。a 1-抗胰蛋白酶為呼吸系統的 非特異性可溶因子，與呼吸道抵抗力關係密切，它可抑制多種酶的活性，包括細菌的酶，以 及中性白細胞溶酶體分泌的蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶和凝血酶。a 1-抗 胰蛋白酶的缺乏與慢性阻塞性肺病的形成關係密切，因為它的缺乏，不能及時控制感染和 炎症產生的多種蛋白酶，而造成肺組織破壞。
[0003] 與a 1-抗胰蛋白酶缺乏直接相關的疾病主要是肺氣腫和肝臟硬化。目前a 1-抗 胰蛋白酶主要用於因遺傳性a 1-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺氣腫患者的終身替補治療和肺 部炎症性疾病的防止，如慢性阻塞性肺氣腫、肺囊性纖維化、急性肺損傷等。
[0004] a 1-抗胰蛋白酶的檢測方法有血清胰蛋白酶抑制容量試驗、單項免疫擴散法、免 疫比濁法。血清胰蛋白酶抑制容量試驗操作過程複雜，易受血清中非抗胰蛋白酶的幹擾，結 果不夠穩定，不宜用於開發臨床檢測試劑盒。而單向免疫擴散法操作簡單，靈敏度尚可，但 實驗分析需要1-2天，並且沉澱環的直徑很難精確測量，因此結果的特異性和精密度不高。
[0005] a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒是一種無需預處理樣本，技術和設備要求 不高，而精密度和特異性更高的分析方法。由於該方法不需要昂貴的設備，可以實現自動 化，且可測定大量標本，因此受到臨床廣泛推廣。但是普通的a 1-抗胰蛋白酶檢測試劑分 析靈敏度不高，準確性和穩定性也不好，不利於臨床分析檢測的推廣應用。


【發明內容】

[0006] 針對於常規的a 1-抗胰蛋白酶檢測試劑盒存在的問題，本發明提供了一種 a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，穩定性和線性範圍比常規的檢測試劑盒要好，分 析靈敏度高，有利於試劑在臨床上的推廣應用。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的： 一種a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，其特徵在於，它包含試劑RU試劑R2和 校準品，其中試劑Rl組成為：50mmol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩衝液、0. lmmol/L的氯化鈉、40g/ L聚乙二醇400、0. 1%-2%二氧化矽包覆的磁性納米顆粒；試劑R2組成為：6ml/L羊抗人 a 1-胰蛋白酶抗體、0. lmmol/L的氯化鈉、20-40g/L牛血清白蛋白BSA。
[0008] 所述二氧化娃包覆的磁性納米顆粒為Fe304/Si0 2複合納米粒子，粒徑為20_50nm。
[0009] 所述試劑Rl和試劑R2在使用時的比例為Rl :R2=200 :80。
[0010] 本發明所使用的二氧化矽包覆的磁性納米顆粒是採用以下方法製備的： 採用多元醇法製備Fe3O4納米粒子。取一定的乙醯丙酮鐵和三甘醇加入到回流加熱反 應裝置中，在磁力攪拌和Ar氣保護的條件下，將裝置緩慢加熱至沸騰，並保持回流一段時 間。冷卻後向反應溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三鐵納米粒子產生絮凝，磁性分離 黑色產物，清洗數次，分散到乙醇中，即得到穩定的Fe 3O4納米粒子乙醇膠體溶液。之後將所 得Fe3O4納米粒子採用Stober水解法製得SiO 2包覆的Fe3O4納米粒子。所得Fe304/Si0 2復 合納米粒子的粒徑為20_50nm。
[0011] 本發明所使用的校準品為寧波普瑞柏生物技術有限公司生產的a I-AT校準品。
[0012] 本發明的試劑盒在具有雙試劑功能的自動生化分析儀上進行，其具體使用方法如 下： 加入生理鹽水、樣本或校準品8 yl，之後再加入Rl試劑200 ill預孵育5min後讀取吸 光度A1，之後再加入80iil的試劑R2反應5min後，讀取吸光度A2,並計算AA。
[0013] 本發明的有益效果： 本發明提供的分析靈敏度高的a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，通過在試劑 Rl中加入二氧化矽包覆的磁性納米顆粒，使該磁性納米顆粒在靜電吸附的作用下與羊抗人 a 1-胰蛋白酶抗體結合，從而使抗體在磁性納米顆粒上形成凝集，大大的提高了試劑的分 析靈敏度。同時在試劑R2中加入牛血清白蛋白，解決了抗體在稀溶液中不穩定這一難題， 在試驗中它能使抗體穩定，且相對地中性，但不會影響抗體的性質，而Proclin-300是高效 的防腐劑，對各種細菌、黴菌、酵母及藻類有很強的抑制作用，從而解決了 BSA長時間保存 易發黴的缺點，因此BSA與ProcI in-300的共同作用有效地增強了試劑盒的穩定性，有利於 該試劑在市場中進一步的推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1實施例2準確度驗證實驗檢測結果與對照組檢測結果相關性； 圖2實施例3準確度驗證實驗檢測結果與對照組檢測結果相關性； 圖3實施例4準確度驗證實驗檢測結果與對照組檢測結果相關性。

【具體實施方式】
[0015] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例來進一步詳細的說明。
[0016] 實施例1 一種市面上常規的a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、 校準品。
[0017] 其中，試劑Rl組成為： pH 7. 2磷酸鹽緩衝液 50 mmol/L 氯化鈉 0. I mmol/L 聚乙二醇400 40g/L 試劑R2組成為： 羊抗人a 1-胰蛋白酶抗體 6ml/L 氯化鈉 0. I mmol/L 本實施例描述的a 1-抗胰蛋白酶檢測試劑盒，在使用時，其測定方法是採用具有雙試 劑功能的東芝120自動分析儀，操作如下： 加入生理鹽水、樣本或校準品8 yl，之後再加入Rl試劑200 ill預孵育5min後讀取吸 光度A1，之後再加入80iil的試劑R2反應5min後，讀取吸光度A2,並計算AA。
[0018] 本實施例所使用的校準品為寧波普瑞柏生物技術有限公司生產的a I-AT校準 品。
[0019] 實施例2 一種a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0020] 其中，試劑Rl組成為： pH 7. 2磷酸鹽緩衝液 50 mmol/L 氯化鈉 0. I mmol/L 聚乙二醇400 40g/L 二氧化矽包覆的磁性納米顆粒 0. 1% 試劑R2組成為： 羊抗人a 1-胰蛋白酶抗體 6ml/L 氯化鈉 0. I mmol/L 牛血清白蛋白（BSA) 20g/L Prod in-300 lml/L 具體測定方法同實施例1。
[0021] 實施例3 一種a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0022] 其中，試劑Rl組成為： pH 7. 2磷酸鹽緩衝液 50 mmol/L 氯化鈉 0. I mmol/L 聚乙二醇400 40g/L 二氧化矽包覆的磁性納米顆粒 1% 試劑R2組成為： 羊抗人a 1-胰蛋白酶抗體 6ml/L 氯化鈉 0. I mmol/L 牛血清白蛋白（BSA) 30g/L Prod in-300 lml/L 具體測定方法同實施例1。
[0023] 實施例4 一種a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0024] 其中，試劑Rl組成為： pH 7. 2磷酸鹽緩衝液 50 mmol/L 氯化鈉 0. I mmol/L 聚乙二醇400 40g/L 二氧化矽包覆的磁性納米顆粒 2% 試劑R2組成為： 羊抗人a 1-胰蛋白酶抗體 6ml/L 氯化鈉 0. I mmol/L 牛血清白蛋白（BSA) 40g/L Prod in-300 lml/L 具體測定方法同實施例1。
[0025] 對上述實施例1-4中製得的試劑盒進行實驗驗證。
[0026] 準確度驗證實驗： 將實施例2、3、4的試劑盒作為實驗組，市場上獲得認可的一種準確度優異的a 1-抗胰 蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒(上海某公司生產）作為對照組進行對比實驗，檢測的結果如 圖1-圖3。
[0027] 通過檢測數據可知，實施例2、3、4檢測試劑盒與對照組檢測試劑盒的檢測結果相 關性分別為0. 9960、0. 9968、0. 9961，均大於要求的0. 990,相關性比較好，表明本發明的試 劑盒與市場獲得認可的具有優異準確度的a 1-抗胰蛋白酶檢測試劑盒有較好的一致性， 證明本發明試劑盒添加的其他各種成分對其準確性不會造成影響，試劑盒依然保持較好的 準確度。
[0028] 線性相關性驗證實驗： 找到a 1-抗胰蛋白酶高值樣本為640 mg/dL，用生理鹽水進行系列稀釋，配製6個不同 濃度的樣本，依次為 640 mg/dL、512 mg/dL、384 mg/dL、256 mg/dL、128 mg/dL、40 mg/dL 濃 度的樣本，每個濃度水平各樣本分別測定三次，分別取其平均值。分別利用實施例1、2、3、4 的試劑進行檢測。檢測結果如表1所示： 表1實施例1-4線性相關性驗證實驗數據結果

【權利要求】
1. 一種a 1-抗胰蛋白酶免疫比濁法檢測試劑盒，其特徵在於，它包含試劑R1、試劑R2 和校準品，其中試劑R1組成為：50mmol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩衝液、0. lmmol/L的氯化鈉、 40g/L聚乙二醇400、0. 1%-2%二氧化矽包覆的磁性納米顆粒；試劑R2組成為：6ml/L羊抗 人a 1-胰蛋白酶抗體、0. lmmol/L的氯化鈉、20-40g/L牛血清白蛋白BSA。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述二氧化矽包覆的磁性納米顆粒為 Fe304/Si02複合納米粒子,粒徑為20_50nm。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑R1和試劑R2在使用時的比例 為 R1 :R2=200 :80。
【文檔編號】G01N33/68GK104374924SQ201410765329
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年12月15日 優先權日:2014年12月15日
【發明者】甘宜梧, 董雯, 譚柏清, 李靜, 包興豔, 朱玉娥, 肖慧 申請人:山東博科生物產業有限公司