流式細胞術脈衝的區分和應用的製作方法
2023-06-19 09:37:41 8
專利名稱：流式細胞術脈衝的區分和應用的製作方法
技術領域：
本發明大體上涉及流式細胞術，具體涉及用於分析流式細胞儀所產生的脈衝的方法和設備。
背景技術：
流式細胞儀系統被用來檢測和計數微生物，並被用在整個生命科學——包括臨床診斷和免疫學、蛋白質和核酸檢測、血液學、和腫瘤學——的多種應用中。市售的儀器，從複雜的可以被配置為用於多種測量的實驗室系統到性能較為有限的低成本臺式系統都有。在當前的生物技術市場上，流式細胞儀的價格通常隨其測量精度和其能夠執行的不同測量的數目而升高。
流式細胞儀通常被用來識別和計數流體樣本中具有特殊特性的微粒。如本說明書中所用，術語「微粒」指，例如，乳膠球、細菌、病毒、DNA片段、細胞、分子、或全血的成分。當被適當波長的光照射時，微粒可以直接散射激發光或發出螢光。在許多情形下，通過將探針分子(probe molecular)附著到整個微粒或附著到這些微粒內的顯微結構上，將螢光發射屬性優化以用於具體測量。
在典型的流式細胞儀中，含有微粒的樣本流體流經聚焦光源照射微粒的激發體積處。在流經激發體積時，微粒將光散射到光束外並發出螢光。在許多情形下，通過將探針分子結合到微粒或結合到微粒內的結構上，增強螢光發射過程。通常，通過收集和分析微粒在經過激發體積時發出和散射的光脈衝，來識別和計數微粒。
根據激發體積內及周圍的流體的組成，流式細胞儀可以被分為兩大類。在鞘流式儀器(sheath flow instrument)中，激發體積區域內的流體具有兩種組分含有微粒的樣本流體和不含微粒的鞘流體，其中鞘流體圍繞樣本流體並將其限制在流動軸附近的區域內。在毛細流式細胞儀(capillary flow cytometer)中，含有微粒的樣本流體充滿整個流動體積，而不存在鞘流體。
用於分析流式細胞儀所產生的脈衝的技術已經廣為人知，並且，例如，在美國專利No.4,021,117和No.3,938,038中有描述，這兩個文獻的公開內容通過引用全部納入本說明書。
發明內容
本發明提供了一種分析來自流式細胞儀的脈衝的方法。在所述流式細胞儀中，流體中的微粒經過電磁輻射的激發體積，並與該電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號。在該方法中，生成時間-依賴脈衝，其指示一個或多個經過電磁輻射的激發體積的微粒的特性。通過用高於預定值的起點和終點選擇該脈衝的一部分，確定測量窗口。計算該脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數。
在一個實施方案中，使用該脈衝的一階導數，計算經過激發體積的微粒的速率。繼而，使用算出的微粒速率，修正該脈衝的測量值。
在另一個實施方案中，確定一階導數在測量窗口內接近零值的次數(n)。繼而，使用已確定的一階導數接近零的次數(n)，區分脈衝。
在又一個實施方案中，本發明提供了一種分析來自流式細胞儀的脈衝的方法，在所述流式細胞儀中，流體中的微粒經過部分由兩個或更多電磁輻射束限定的兩個或更多個激發體積，並與該兩個或更多電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號。該方法包括生成經過毛細管中的第一激發體積的第一微粒的第一時間-依賴脈衝；計算第一時間-依賴脈衝在測量窗口上的第一一階導數；使用第一時間-依賴脈衝的第一一階導數計算第一微粒的第一速率；生成經過毛細管中的第二激發體積的第二微粒的第二時間-依賴脈衝；計算第二時間-依賴脈衝在測量窗口上的第二一階導數；使用第二時間-依賴脈衝的第二一階導數計算第二微粒的第二速率；通過比較算出的第一和第二速率，將第一和第二時間-依賴脈衝相關聯。
在一個方面，本發明提供了一種用於分析微粒的設備。該設備包含毛細管；光源；將電磁輻射從光源引導到毛細管以在毛細管中形成激發體積的光學系統；用於使流體中的微粒經過激發體積的裝置，在所述激發體積中，微粒與電磁輻射相互作用以散射光和/或發出螢光；用於檢測脈衝形式的螢光的裝置；用於計算該螢光脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數的裝置。
通過閱讀後文中與以下附圖和所附權利要求相結合的詳述，將更好地理解本發明的這些及多種其他特徵和優點，在附圖中 圖1A是圖示了鞘流式細胞儀中的流動室的示意圖； 圖1B是圖示了毛細流式細胞儀中的流動室的示意圖； 圖2是圖示了流式細胞儀中的穩定的層流狀況的示意圖； 圖3是圖示了鞘流式細胞儀系統的示意圖； 圖4A是表示了第一微粒在第二微粒進入之前離開激發體積時產生的單峰脈衝的繪圖； 圖4B是表示了第一和第二微粒的一部分同時被照射時產生的雙峰脈衝的繪圖； 圖4C是表示了第一和第二微粒的大部分同時被照射時產生的雙峰脈衝的繪圖； 圖5是圖示了脈衝形狀和微粒尺寸之間關係的繪圖； 圖6是圖示了脈衝形狀和微粒速率之間關係的繪圖； 圖7是可以被用來實施本發明的方法的電子系統的框圖； 圖8是圖示了單個微粒珠被照射時的時間-依賴信號及其一階導數的繪圖； 圖9是圖示了兩微粒珠同時被照射時的時間-依賴信號及該時間-依賴信號的一階導數的繪圖； 圖10是圖示兩微粒經過具有兩個激發體積的毛細流動室的示意圖； 圖11A是被碘化丙啶(PI)染色的哺乳動物細胞以125μl/sec的平均體積流率經過毛細細胞儀而生成的未修正的面積數據的繪圖； 圖11B是被碘化丙啶(PI)染色的哺乳動物細胞以125μl/sec的平均體積流率經過毛細細胞儀而生成的未修正的寬度數據的繪圖； 圖12A是圖11A的數據在根據本發明的一個實施方案的實時速率修正之後的修正數據的繪圖； 圖12B是圖11B的數據在根據本發明的一個實施方案的實時速率修正之後的修正數據的繪圖。
具體實施例方式 下面參考附圖描述本發明的多種實施方案。應注意，某些附圖是示意性的，並且附圖僅意在幫助描述本發明的具體實施方案。它們不意在作為本發明的完備描述，或作為對本發明範圍的限制。
圖1A-1B示意性地圖示了可以用於實施本發明的方法的兩種細胞儀系統的代表性流動室。在圖1A所示的鞘流動室10中，鞘流體經由加壓入口12進入室10，而含有微粒的樣本流體經由加壓噴嘴14(核心注射器)注入室10。在該室內壁和核心注射器14之間，形成有鞘流體體積16。在噴嘴尖端18和激發體積19之間的區域，室10的直徑逐漸減小，以增大鞘流體的速率並減小樣本流體的直徑。舉例說，激發體積19附近的樣本流體的直徑在5至50微米之間，而鞘流體的直徑等於該室的直徑。舉例說，在該室含有激發體積的部位，該流動室的直徑在50至75微米之間。
在圖1B所示的毛細流動室20中，毛細管22提供了充滿樣本流體的基本恆定的橫截面。激發區24中的樣本流體的橫截面尺寸顯著大於鞘流動系統10中的樣本流體激發區19的橫截面尺寸，從而前者的流動速率相對較小。舉例說，毛細流式細胞儀中的正方形流動室20的內邊緣尺寸是100微米。在操作中，經由激發體積24，樣本流體從樣本貯藏器26中被抽出。
鞘流動室毛細流動室明顯更為複雜和昂貴。鞘流動室具有幾個與測量精度有關的優點。一個優點是，樣本流體中的微粒以近似恆定的速率流經激發體積。在這兩種細胞儀系統中，流動速率都被調節，以在含有激發體積的室的區域中創造平滑的層流，並使徑向速率依賴關係近似於拋物線。在鞘流動室中，樣本流體被限制在圍繞室軸的狹窄區域，這樣就有效地使微粒速率的改變最小化。相反，在毛細流動室中，在室壁附近行進的微粒的速率遠小於在室中央附近行進的微粒的速率，如圖2所示。舉例說，在距正方形毛細細胞儀流動室的軸100微米的可測距離處行進的微粒的速率是在該軸附近行進的微粒的速率的33％。
鞘流動室使用小的、位於中央的激發體積。用具有固定輸出能量的雷射激發源，鞘流動室中的光強度顯著大於其中激發體積充滿整個室的毛細流式儀器中的光強度。此外，在鞘流動室中，室壁的散射和反射作用是微小的，並且其大小恆定。在毛細儀器中，壁效應可以是顯著的，並且其大小隨發射微粒相對於室軸的位置而變化。
由Hoboken市Wiley公司的H.M.Shapiro發表於2004年的「Practical Flow Cytometry」、授予Chupp的美國專利No.4,662,742、授予Recktenwald等人的美國專利No.4,745,285、和美國專利申請公開No.2002/0028434 A1中，描述了流式細胞儀，這些文獻的公開內容通過引用全部納入本說明書。
圖3是可以被用來實施本發明的鞘流式細胞儀30的示意性表示。在這個系統中，激發束由光源32生成，光源32諸如雷射；雷射驅動頻率非線性轉換器，諸如倍頻器、三倍頻器或四倍頻器；光學參數振蕩器；發光二極體(LED)；超輻射發光二極體；或弧光燈。
激發光學系統34將激發束36聚焦在流動室10中，以限定激發體積38。激發光學系統34在圖3中被示為一簡單的透鏡，但也可以包括一個或多個組件，諸如衍射光學器件、反射光學器件和折射光學器件。一個可選的在激發波長具有高透射度的帶通濾波器40可以被放置在激發光源32和激發體積38之間，以阻擋激發源32發出的、處於與激發波長不同波長的光。
被聚焦的激發光經由幾個物理過程與流經激發體積38的微粒相互作用，這幾個物理過程包括螢光激發、吸收、小角度散射、和大角度散射。通過測量微粒被激發束照射時生成的光脈衝的波長、振幅、持續時間和形狀，微粒可以被識別和計數。
被散射的激發光通常具有由散射微粒的尺寸和形狀確定的角度分布，並且所述被散射的激發光集中在相對於激發束傳播軸呈大角度(＞45度)和呈小角度(＜10度)的角度處。螢光通常以全立體角發出，併集中在相對於激發束傳播方向呈大角度的角度處。
通過研究暗背景上的螢光和散射光脈衝，可以獲得最大信噪比。在大角度散射和螢光測量中，通過在相對於激發束傳播方向呈大角度的角度處集中光並使用光圈來阻擋非微粒光源，背景光水平被最小化。在前向散射測量中，通常通過阻擋激發束來最小化背景光水平。
返回圖3，大角度集中光學系統42將螢光和散射光聚集成錐體，該錐體的軸與激發束傳播軸正交。散射光經過二向色分光鏡44A、44B，並被透鏡或聚焦光學系統48聚焦在大角度散射檢測器46的工作元件上。第一波長的螢光被第一二向色分光鏡44A反射到第一螢光檢測器50A，與第一波長不同的第二波長的螢光被第二二向色分光鏡44B反射到第二螢光檢測器50B。透鏡或聚焦光學系統53A和53B被用來將第一和第二波長的螢光分別聚焦到螢光檢測器50A和50B。一個或多個光學帶通濾波器52A、52B、52C可以被放置在激發體積38和檢測器46、50A、50B之間，以限制到達檢測器的波長。
螢光一般由探針分子——諸如有機染色分子——發出，探針分子在特定微粒被引入到流內之前附著到特定微粒或特定微粒的具體結構上。探針分子通常是激發光的強力吸收劑，有效地將所吸收的光能轉化為螢光輻射。螢光波長相對於激發光波長的紅移(斯託克斯頻移)使得可以用常規透射濾波器或光柵將螢光從激發光中分離出來。螢光光子通常在吸收來自激發束的光子後的幾納秒內被發射出來。與典型的流式細胞儀中微粒流經激發體積所需的時間相比，這個時延是短的。
在特定應用中，具有不同發射和/或激發譜的探針分子可以被結合到不同類型的樣本微粒或單一類型樣本微粒內的不同結構上。通過測量不同波長的螢光脈衝的振幅，可對單個微粒和/或由不同微粒或結構產生的區分信號同時測量。
處於相對於激發束傳播軸呈小角度的散射光可以被前向散射成像系統54集中。光束阻擋器56可以被放置在激發體積38和前向散射成像系統54之間，以防止未散射的激發束到達前向散射成像系統54。繞過光束阻擋器56邊沿的散射光被集中並聚焦在前向散射檢測器58的工作元件上。帶通濾波器60可以被插在激發體積38和前向散射檢測器58之間，以透射激發波長下的光並阻擋處於其他波長的光。
散射激發光可以被用來區分不同的微粒類型。在相對於激發束傳播軸呈小角度散射的光的量近似隨微粒尺寸而改變，而大角度散射隨微粒粒度而改變。通過測量小角度與大角度散射的比值，可以區分特定微粒種類。
由被照射的微粒生成的光脈衝根據發射角和波長被分離。根據發射角進行分離的實現方式是，通過將一些具有明確的集中孔徑的透鏡放置在相對於激發束傳播方向呈不同角度的角度處。波長分離可以通過使脈衝穿過一系列介電帶通和/或邊沿濾波器來實現。
在集中和分色之後，通過光電倍增管或光電二極體，光脈衝被轉化為模擬電脈衝。數據獲取系統將該模擬信號轉化為用於隨後被數位訊號處理器或計算機分析的數字數據。
到達檢測器的光脈衝的形狀和振幅由微粒的光學屬性、微粒速率和微粒相對於集中光學系統的位置確定。微粒的光學屬性除了由附著到這些微粒的任何探針的吸收和發射特性確定外，還由微粒的尺寸、形狀、和透明度確定。對於螢光輻射具有高量子產率的強力吸收探針通常生成最大振幅的脈衝。
在操作中，當微粒被激發束照射時，至少有一個檢測器接收光脈衝。微粒和激發束之間的每個相互作用被公知為一個「事件」。在理想情形下，可以從在事件期間生成的檢測器脈衝明確地識別微粒。在特定樣本中，例如，可通過測量小角度和大角度散射信號的相對量來計數和區分單核細胞、粒細胞和淋巴細胞。在其他樣本中，通過測量在微粒經過激發體積時發出的螢光脈衝的形狀，可以確定細胞核中的DNA的量。
除了流動室和關聯的流控技術，毛細流式細胞儀在性質上與鞘流式儀器相似。樣本流體在激發體積中被聚焦光源照射，樣本微粒發出和散射的光脈衝被小角度和大角度光學系統——其根據波長分離光脈衝並將它們引導到檢測器——集中。因為毛細細胞儀流動室固有的簡單性，它們比鞘流式儀器更容易建造和校準。然而，毛細流式儀器中的激發體積的較大橫截面限制了它們的測量準確度。
在鞘和毛細流式細胞儀中，都可以通過將檢測器脈衝的形狀與預定標準比較來計數微粒。在某些情形下，微粒可以在脈衝高度超過門限值時被計數。在其他情形下，脈衝高度和寬度或面積的繪圖可以被用來識別和計數不同的微粒類型。在微粒識別過程中可能導致誤差的因素包括相對於平滑層流的偏移、微粒速率的空間差異、光學集中效率的空間差異、多個微粒的同時照射、或該樣本的聚合體的形成。這些誤差的量通常隨激發體積的尺寸而增大，並且在鞘流式儀器中可以被最小化。
對於許多測量，毛細系統提供了足夠的測量準確度，並提供了相對於鞘流式系統優越的以下幾點 1.降低的複雜度和成本。鞘流動室是複雜、昂貴且難以嚴格校準的。毛細流動室是較簡單、較廉價且不易被誤校準的。
2.樣本流體經由毛細管被泵抽出，由此促進了對樣本流體中微粒濃度的直接測量。在鞘流式細胞儀中，樣本流體和鞘流體在壓力下被注入流管，通常通過將含有濃度已知的微粒的樣本流體引入該系統來間接測量微粒濃度。
3.無需使用鞘流體和關聯的流控技術。對於特定的普通測量——其中測量準確度的降低是可接受的，毛細流式儀器的較簡單的流控技術顯著節省了成本。
根據Shapiro的(「Practical Flow Cytometry」，第4版，Wiley，Hoboken，2003)「細胞儀的測量精度的常規特徵是將來自『近乎相同的微粒』的螢光或光散射強度測量值的分布進行累加，並計算差異係數(CV)，其被表達為百分數，是該測量的標準差除以算數均值或平均值所得商的100倍」。較小的CV伴隨著提高的準確度。
在典型的測量中，當來自檢測器的脈衝的振幅超過預定門限值時，計數增加。相同微粒產生的脈衝振幅的差異導致了測量的計數誤差和不想要的CV增大。現有技術毛細細胞儀的CV通常超過鞘流式儀器的CV，因為毛細細胞儀具有較大的激發體積以及來自微粒的光輻射較為遠離毛細管軸。
在細胞術中，單一、孤立的樣本微粒的照射生成單個峰的檢測器脈衝，其一般被稱為「單峰脈衝」。兩個分離的微粒的同時照射生成具有兩個峰的檢測器脈衝，其通常被稱為「雙峰脈衝」。在高微粒濃度下和在橫截面直徑顯著大於微粒橫截面的樣本流中，兩個微粒同時被照射的可能性是實際存在的。
圖4A-4B是樣本微粒濃度增大時出現的脈衝形狀改變的示意性表示。在低濃度，幾乎所有事件都對應於單一微粒的照射。增大微粒濃度或毛細流管的橫截面面積，就增大了觀察到雙峰脈衝形態的概率。在圖4A中，每個微粒生成一個單峰脈衝，因為在第二微粒進入激發體積之前，第一微粒已經離開了激發體積。在圖4B中，當第一微粒的一小部分仍被照射時，第二微粒就進入了激發體積。在這種情形下，檢測器輸出在這兩個脈衝之間不回到零，但是在最大和最小脈衝值之間有顯著的差。在圖4C中，第一和第二微粒在幾乎相同的時刻經過激發體積，最大和最小脈衝振幅之間的差很小。
在特定樣本中，細胞、細胞片段和其他殘骸可以聚在一起形成聚合體。這些聚合體的尺度通常與所研究的微粒的尺度不同。在鞘流式細胞儀——其中微粒以近似相同的速率經過激發體積——中，脈衝寬度與微粒尺寸強相關，如圖5所示。這樣，使用如Wersto等人在Cytometry 46296-306(2001)中描述的脈衝和面積/寬度技術，雙峰脈衝和聚合脈衝可以被識別並從分析中排除，該文獻的公開內容通過引用全部納入本說明書以用作一般信息。然而，這種類型的分析不能在常規毛細流式細胞儀中執行，因為脈衝寬度也與微粒速率強相關，如圖6所示。在這樣的系統中，由流的徑向差異和微粒速率導致的脈衝形狀差異有效地掩蓋了單微粒和聚合體或雙微粒的脈衝形狀差別。
在某些實施方案中，樣本中微粒的濃度可以被調節，以使照射到兩個以上的微粒的概率很微小，以及使很少檢測到雙峰脈衝。在某些情況下，特定生物樣本中形成聚合體是難以避免的。
在某些實施方案中，通過將微粒聚集在毛細管軸附近的小區域中，可以提高毛細流式系統的準確度。在這種情形下，毛細流式細胞儀的表現可以近似於鞘流式儀器。例如，授予Goix的美國專利No.6,710,871 B1描述了一種毛細流式細胞儀系統，其中磁場被用來迫使帶磁荷的微粒流動在毛細管的被限制的橫截面區域內。Kaduchak等人的標題為「Ultrasonic analyte concentration and applicationin flow cytometry」的美國專利申請公開No.2006/0021437描述了用於聚集毛細管軸附近的微粒的超聲技術。美國專利No.6,710,871 B1和美國專利申請公開No.2006/0021437通過引用全部納入本說明書。
在某些實施方案中，使用數值技術，實時地計算樣本微粒流經流式細胞儀中的激發體積時所產生的脈衝的導數。當細胞儀在典型的微粒濃度範圍和體積流率下運作時，可以從這些導數算出微粒速率，並將其用於修正各脈衝形狀以使它們非常近似於一致的速率流中的脈衝形狀。算出的速率也可以被用來在單微粒流經具有多個激發體積的毛細儀器時唯一地識別單微粒產生的脈衝。在某些實施方案中，算出的脈衝導數中的過零點的數目可以被用來區分雙峰脈衝和單峰脈衝。
在一個具體實施方案中，本發明提供了一種分析來自流式細胞儀的脈衝的方法。在所述流式細胞儀中，流體中的微粒經過電磁輻射的激發體積，並與該電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號。時間-依賴脈衝——其指示一個或多個經過電磁輻射的激發體積的微粒的特性——被生成。通過用高於預定值的起點和終點選擇脈衝的一部分，確定測量窗口。計算該脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數。
圖7是可以被用來計算來自流式細胞儀中檢測器的信號的導數的電子系統70的框圖。所述流式細胞儀可以是毛細流式細胞儀。該圖中的功能性方框利用電子和數位訊號處理領域公知的技術和組件。
參考圖7，光脈衝被檢測器72接收，生成電信號——其被可編程增益放大器放大並被模擬輸出總線74傳輸到模數轉換器(ADC)76。模擬總線74也可以運送來自其他放大檢測器78、壓力感應器、或其他傳感器的信號。舉例說，模擬總線74可以將四個或五個已放大的信號運送到ADC 76。
ADC 76可以，例如，以40kHz的採樣頻率、16比特的解析度將信號數位化。來自ADC 76的被交織(interleave)的數字數據可以被存儲在微計算機78的存儲器中。舉例說，所述微處理器可以是Eden 1GHz處理器，其具有512兆字節的隨機存取存儲器。FIFO緩衝器80和直接存儲器存取模塊(DMA)82可以被用來有效地將該數據傳輸處理與微計算機78同時執行的其他處理複合。
來自計算機存儲器(未示出)的數字數據——其可以包括用於另一個儀器組件84的操作參數以及用於前向散射檢測器可編程放大器及其他可編程放大器的檢測器電壓設置和增益設置——在DIO總線控制器92的控制下通過DIO總線90被從計算機存儲器傳輸到解碼板86和數字輸入/輸出(DIO)緩衝器88。用於其他組件的放大器設置和數字控制設置被從DIO緩衝器88發送到各儀器組件。從被DIO總線90傳輸到解碼板模塊86的數據生成模擬控制信號。
被交織的ADC數據被微計算機78從存儲器中讀出，並被去交織到緩衝器中——每個被測量參數對應一個緩衝器。舉例說，來自檢測器72的數據可以被存儲在單一的、被去交織的緩衝器中。替換性地，來自其他檢測器的數據可以被存儲在其他存儲器中。
上採樣濾波器通常被應用於該去交織數據。合適的濾波器包括現有信號處理技術中公知的8x和16x上採樣低通濾波器。這樣的濾波器提供了改進的採樣內插值，改進了對峰值的估計，拒絕了一些高頻噪聲。
為了算出脈衝的導數，可以通過確定那些脈衝強度與峰強度的比值等於一預定值的點來限定測量窗口。繼而，為這個窗口中的每個數據點計算導數。
可以藉助於一些在存在——一般由流式細胞儀檢測器生成的——噪聲信號的情況下既快速又穩定的任意現有數值技術，利用微處理器78執行導數的計算。例如，可以使用Savitsky-Golay方法計算導數，該方法如Abraham Savitsky和Marcel J.E.Golay於1964年在Analytical Chemistry第36卷1627-1639頁發表的「Smoothing andDifferentiation of Databy Simplified Least Squares Procedures」所述，該文獻的公開內容通過引用全部納入本說明書。這個方法在導數緩衝器中針對每個數據點有序地執行局部多項式回歸，並使用多項式擬合來估計原始信號的一階導數。這將(通過回歸進行的)數據平滑與導數估計濾波器結合起來。
例如，9點Savitsky-Golay濾波器(n＝9)與二次多項式(k＝2)結合使用。通過依次將一些有序的9數據點組乘以下列係數{86，-142，-193，-126，0，126，193，142，-86}，計算與具體數據點的導數成比例的值。第一計算使用數據點1-9，第二計算使用數據點2-10，第三計算使用數據點3-11，等等，直到預定計算窗口內的所有數據點的縮放的導數值被算出。輸入數據點從去交織輸入緩衝器中獲取，該導數計算的結果存儲在導數輸出緩衝器中。
圖8圖示了一脈衝形狀和一根據本發明的一個實施方案計算的導數脈衝形狀。在圖8中，時間-依賴信號和該時間-依賴信號的一階導數是由可從Guava Technologies，Inc.，Hayward，California獲取的毛細流式細胞儀的前向散射信道產生的。T1和T2是檢測器信號與預設門限水平交叉的起點和終點。脈衝寬度由T1和T2之差限定。Z1是一階導數過零點。它與脈衝信號極大值重合。
Savitsky-Golay濾波器是用於從數字數據組計算一階導數的大量合適的數值方法之一。在替換性的實施方案中，可以使用替換性的、具有合適的速度、準確度和穩定性的數值技術來近似得出導數。
在某些實施方案中，從例如由一些脈衝的1/4強度點限定的測量窗口內的導數數據，可以算出微粒速率。測量窗口中的導數的最大和最小值被識別，微粒速率從下面的等式估計出 其中V等於微粒速率，α是導數的最大值α＝max[Abs(導數)]，Abs是絕對值函數，k是縮放因子——其取決於激發雷射束的形狀，P是脈衝高度。對於高斯雷射束其中BW是該束的寬度的1/e2。以上適用於比BW小的微粒。有時，噪聲或其他作用調製了脈衝形狀，有利的是，從導數最大值和最小值的平均來計算α。在一個優選實施方案中，α從下面的公式算出然而，也有許多其他計算α的方法。
用於脈衝和面積/寬度計算的基於導數的速率修正 流式細胞儀經常被用於DNA細胞周期分析。在這種測量中，通過用DNA專用染料給樣本細胞染色並使它們經過流式細胞儀的激發體積，處於細胞周期的G1、S和G2+M階段的樣本細胞的相關片斷被確定。給定微粒的核中DNA的尺寸和量取決於該微粒的細胞周期階段，因此，不同階段的微粒產生的脈衝具有不同的形狀。使用如Wersto等人於2001年在Cytometry第46卷296-306頁發表的「DoubletDiscrimination in DNA Cell-Cycle Analysis」所述的公知技術，可以根據脈衝的振幅、面積和寬度來分析脈衝，該文獻的公開內容通過引用全部納入本說明書。用於脈衝形狀分析的替換性技術在美國專利No.4,021,117和No.3,938,038中有描述，這兩個文獻的公開內容通過引用全部納入本說明書。現有的用於鞘流式細胞儀中脈衝形狀分析的電子和數值信號處理技術將被統稱為「脈衝和面積/寬度技術」。
當樣本含有非零濃度的具有額外DNA材料的聚合微粒時，細胞周期測量的準確度降低。在鞘流式細胞儀中，使用脈衝和面積/寬度技術，聚合脈衝可以被識別。這些技術建立在這樣的事實上聚合體的尺寸和DNA量通常與處於各種細胞周期的單細胞的尺寸和DNA量不同。
在鞘流式細胞儀系統中，面積和寬度的測量可以直接從各脈衝做出，因為細胞以恆定速率經過雷射束。在毛細流式細胞儀中，微粒速率隨距毛細管軸的徑向距離而改變。在典型的毛細系統中，例如，最遠處的微粒的速率可能是在毛細管軸附近行進的微粒的速率的三分之一，各脈衝的面積和寬度嚴重依賴於微粒距流管軸的徑向距離。
使用本發明的速率測量方法，可以從脈衝的導數算出微粒的速率，微粒形狀可以相應地經過速率修正。一旦已經執行速率修正，則可以使用常規脈衝和面積/寬度技術來分析脈衝。在鞘流式儀器中，與速率修正脈衝分析關聯的誤差與在未修正脈衝分析中獲得的誤差相當。
速率修正可以簡單地通過將給定脈衝的寬度和面積值乘以算出的微粒速率來完成。例如，通過測量計算窗口的時間寬度(輸入脈衝的1/4最大值點之間的時間)來確定未修正脈衝寬度，面積通過對計算窗口上的未修正強度數據進行積分來確定。對這兩類值的速率修正通過將未修正數據乘以算出的速率來做出。
基於導數的雙峰脈衝區分 由於典型的毛細流式細胞儀中的流管具有相對較大的橫截面積，一次同時照射一個以上的樣本微粒的概率經常是非零的。圖8是由孤立的單微粒生成的檢測器信號及該檢測信號的一階導數的繪圖。圖9是兩個微粒的同時照射生成的檢測器信號及該檢測器信號的一階導數的繪圖。
圖8和圖9中表示的信號由可從GuavaTechnologies，Inc.，California獲取的毛細流式細胞儀的前向散射檢測器產生。含有Guava
珠的樣本被激發。Guava
珠是濃縮的、具有已知濃度的螢光珠懸浮液。在使用中，這樣的珠可以被稀釋，以產生具有已知濃度的珠懸浮液。單峰脈衝和雙峰脈衝的持續時間是信號與預設門限交叉的時刻T1和T2之差。導數信號在每個極大值和極小值處過零——對於單峰脈衝是一次、對於雙峰脈衝是三次。導數過零點在圖8中被標註為Z1，在圖9中被標註為Z1、Z2和Z3。在兩個以上微粒被同時照射的罕見事件下，導數信號被期待過零(2n-1)次，其中n是被同時照射的微粒的數目。
通過使用本發明的技術計算輸入信號的導數，並確定該導數接近等於零的次數，可以區分雙峰脈衝和單峰脈衝。單峰脈衝具有一個零點，雙峰脈衝具有三個。
替換性地，可以通過計算每個脈衝的最大導數值和寬度來區分雙峰脈衝和單峰脈衝。對於給定微粒尺寸，單峰脈衝的上升沿的最大導數和單峰脈衝的寬度以如下方式隨速率縮放這兩個參數的比值近似獨立於微粒速率。然而，在雙峰脈衝的情形下，上升沿導數隨速率變化的方式與單峰脈衝情形相同，但脈衝寬度超過了單峰脈衝情形，超過量與兩個微粒在流動方向上的距離成正比。因此，可以通過計算脈衝寬度與最大導數的比值來識別雙峰脈衝和單峰脈衝。單峰脈衝對應於比預定的雙峰脈衝門限值小的脈衝寬度-導數比值。根據本發明的實時導數計算可以被用來計算上升沿導數的最大值，而脈衝寬度-導數比值可以被用來區分雙峰脈衝和單峰脈衝。
多源流式細胞儀中基於速率的微粒跟蹤 在特定測量中，需要用兩個或更多激發波長照射樣本微粒。這通常通過以下方式實現將來自不同雷射的輸出束聚焦在沿流動方向的不同點，以使為每個雷射創建分離的激發體積。來自每個體積的光脈衝根據波長和角度被不同的光學系統集中和分離。
在測量兩個或更多激發體積中的單個微粒的情形下，需要將在每個激發體積中發出的脈衝與產生這些脈衝的單微粒關聯。在所有微粒以近似相同的速率行進的鞘流式儀器中，可以通過設置對應於不同激發體積之間的通行時間的時間門來實現這種關聯。例如，上遊體積中的微粒生成的脈衝的上升沿可用於在時間上以以下方式控制下遊激發體積中的數據收集識別和記錄由觸發微粒生成的脈衝。然而，這種逼近可能不能被用在微粒速率與距毛細管軸的距離強烈關聯的常規毛細流式細胞儀中。在最好的情形下，微粒在激發體積之間行進所需的時間是可變的，而在最壞的情形下，兩個微粒經過激發體積的順序在微粒向下遊行進時被反轉。
圖10是兩個微粒經過具有兩個激發體積的毛細流動室的示意性圖示。微粒1號以第一速率行進在毛細管壁附近，微粒2號以充分大於第一速率的第二速率行進在軸附近。在該圖示中，微粒1號在微粒2號之前經過第一激發體積，但在它們流動在激發體積之間時，更快地移動的微粒2號追上並超過了微粒1號。結果是，微粒2號在微粒1號之前經過第二激發體積(以及所有其他下遊激發體積)。一種簡單的、被經過第一激發體積的微粒產生的脈衝的上升沿觸發的電子時間門可能會錯過第二激發體積中的脈衝的一段，在脈衝在第二體積中被記錄的情形下，不可能確定該脈衝是否是由觸發該門的相同微粒產生的。
本發明可以被用來計算微粒在流經第一激發體積時的速率，和該微粒從第一激發體積到達下遊激發體積所需的時間。使用速率數據，微粒在經過下遊激發體積時產生的脈衝可以被關聯到第一體積中的脈衝。因為觸發脈衝和時間門之間的間隔從觸發微粒的速率準確地計算而來，所以錯過脈衝或不準確地將下遊激發體積中的脈衝與觸發脈衝關聯的概率非常低。
因為微粒的速率在微粒流經激發體積時近似恆定，所以，通過對所有區域產生的脈衝執行速率計算，也可以識別特定微粒產生的脈衝。假如第一激發體積中的脈衝的上升沿觸發了第二激發體積中的測量窗口——該窗口足夠寬以包括第一和第二激發體積之間的所有可能的通行時間，則該窗口期間產生的具有近似相等的導數值(速率)的脈衝可以被認為是由同一個微粒生成的。
實施例1 這個實施例闡明了根據本發明的面積和寬度數據的速率修正。圖11A-11B圖示了來自可從Guava Technologies獲取的毛細細胞儀
的未修正面積和寬度數據。這個數據通過使被核DNA染色劑碘化丙啶(PI)染色的哺乳動物細胞以125μl/sec的平均體積流率經過該儀器來產生。
碘化丙啶(PI)在細胞周期分析中被用作核DNA染色劑，以區分處於細胞周期不同階段的細胞。靜止細胞(G0/G1)含有每條染色體的兩個副本。當細胞周期開始時，細胞合成染色體DNA(S階段)。來自DNA嵌入染料PI的螢光強度增大，直到所有染色體DNA都加倍(G2/M階段)。在這個狀態下，G2/M細胞的螢光強度是G0/G1群體的二倍。G2/M細胞最終分裂成兩個細胞。
對於在細胞周期不同階段中尺寸相同的微粒，圖11B中的寬度數據應被尖銳地峰化，圖11A中的面積數據應具有顯示不同階段中DNA內容的定性形式。然而，因為微粒以不同的速率經過激發體積，所以圖11B中的未修正的寬度柱狀圖形成寬闊的峰，而圖11A中的未修正面積柱狀圖的形狀不是顯示不同階段DNA內容的定性形式。
圖12A-12B示出了圖11A-11B在根據本發明的實時速率修正之後的修正數據。圖12B中的速率修正寬度數據的柱狀圖是狹窄的、定義明確的峰，而圖12A中的速率修正面積的柱狀圖定性地顯示了周期階段。圖12A-12B的速率修正數據可以隨後使用Wersto等人的技術來分析，以消除雙峰脈衝和聚合脈衝。
對流式細胞術領域技術人員顯而易見的是，根據本發明的導數和微粒速率的實時計算可以被用於本公開所詳述應用以外的應用。此外，顯而易見，可以使用不偏離本發明精神的多種數值技術來計算導數。例如，可以通過使用對應於更高次的多項式擬合的Savitsky-Golay濾波器，和/或每次計算使用更多數據點，如Abraham Savitsky和Marcel J.E.Golay於1964年在Analytical Chemistry 36卷1627-1639頁發表的「Smoothing and Differentiation of Data bySimplified Least Squares Procedures」所述，來實施本發明。
數字數據處理或流式細胞術領域技術人員應認識到，本發明也可以使用與圖7所示不同的電子組件來實施。特別地，脈衝導數的計算可以由專用數位訊號處理電路來執行，該電路被微處理器或其他控制單元控制。數字電子和信號處理領域公知的多種組件組合可以被用來將模擬信號轉換為數位訊號並計算該數位訊號的導數。使用適當的線纜，多種電子組件可以被置入或連接到流式細胞術儀器。例如，圖7所示的ADC/CIO卡和微處理器功能可以被置入兩個分離的電子底盤(chassis)，這兩個電子底盤彼此物理分離並與毛細流式細胞儀物理分離。
權利要求
1.一種分析來自流式細胞儀的脈衝的方法，在所述流式細胞儀中，流體中的微粒經過電磁輻射的激發體積，並與該電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號，該方法包含下列步驟
生成時間-依賴脈衝，其指示一個或多個經過電磁輻射的激發體積的微粒的特性；
通過用高於預定值的起點和終點選擇該脈衝的一部分來確定測量窗口；和
計算該脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數。
2.權利要求1的方法，其中時間-依賴脈衝是從一個或多個微粒經過激發體積時與電磁輻射相互作用的光散射生成的。
3.權利要求1的方法，其中時間-依賴脈衝是從一個或多個微粒經過激發體積時與電磁輻射相互作用的螢光生成的。
4.權利要求1的方法，其中時間-依賴脈衝是通過使微粒經過毛細流式細胞儀中的激發體積而生成的。
5.權利要求1的方法，其中測量窗口的確定是通過該脈衝部分的起點或終點的振幅與該脈衝峰處的振幅的一比值來確定的。
6.權利要求1的方法，其還包含，識別該脈衝中一階導數接近零值的點，其表示了該脈衝中的峰。
7.權利要求1的方法，其還包含，識別一階導數的最大值，計算所識別的最大值與脈衝部分的寬度的比值，並使用算出的比值區分單峰脈衝和雙峰脈衝。
8.權利要求1的方法，其還包含，識別測量窗口內一階導數接近零值的點的數目，該數目指示同時與激發輻射相互作用的微粒的數目。
9.權利要求1的方法，其還包含，使用一階導數從下列等式計算經過激發體積的微粒的速率
其中V等於微粒的速率，α是導數的最大值α＝max[Abs(導數)]，Abs是絕對值函數，P是脈衝高度，k是縮放因子。
10.權利要求9的方法，其中k通過下式算出
其中BW是電磁輻射寬度的1/e2。
11.一種分析來自毛細流式細胞儀的脈衝的方法，在所述毛細流式細胞儀中，流體中的微粒經過電磁輻射束的激發體積，並與該電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號，該方法包含下列步驟
生成時間-依賴脈衝，其指示一個經過毛細流式細胞儀中的激發體積的微粒的特性；
通過用高於預定值的起點和終點選擇該脈衝的一部分來確定測量窗口；
測量該脈衝部分的值，包括該脈衝部分的寬度、高度或面積；
計算該脈衝振幅在測量窗口上關於時間的一階導數；
使用算出的一階導數來計算經過激發體積的微粒的速率；和
使用算出的微粒速率來修正該脈衝部分的測量值。
12.權利要求11的方法，其中速率從下列等式算出
其中V等於微粒的速率，α是導數的最大值α＝max[Abs(導數)]，Abs是絕對值函數，P是脈衝高度，k是縮放因子。
13.權利要求12的方法，其中k通過下式算出
其中BW是電磁輻射寬度的1/e2。
14.權利要求12的方法，其中測量值的修正通過將測量值乘以已修正的微粒速率來做出。
15.一種分析來自毛細流式細胞儀的脈衝的方法，在所述毛細流式細胞儀中，流體中的微粒經過部分由電磁輻射束限定的毛細管中的激發體積，並與該電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號，該方法包含下列步驟
生成時間-依賴脈衝，其指示一個或多個經過毛細管中的激發體積的微粒的特性；
通過用高於預定值的起點和終點選擇該脈衝的一部分來確定測量窗口；
計算該脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數；
確定該一階導數在測量窗口內接近零值的次數(n)；和
使用所確定的次數(n)來區分脈衝，其中，當n為1時是單峰脈衝，當n為3時是雙峰脈衝，當n為5時是三峰脈衝。
16.權利要求15的方法，其中時間-依賴脈衝是從一個或多個微粒經過毛細管中的激發體積時與電磁輻射相互作用的光散射生成的。
17.權利要求15的方法，其中時間-依賴脈衝是從一個或多個微粒經過毛細管中的激發體積時與電磁輻射相互作用的螢光生成的。
18.一種分析來自毛細流式細胞儀的脈衝的方法，在所述毛細流式細胞儀中，流體中的微粒經過部分由兩個或更多電磁輻射束限定的兩個或更多激發體積，並與該兩個或更多電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號，該方法包含下列步驟
生成經過毛細管中的第一激發體積的第一微粒的第一時間-依賴脈衝；
計算第一時間-依賴脈衝在測量窗口上的一階導數；
使用第一時間-依賴脈衝的第一一階導數計算第一微粒的第一速率；
生成經過毛細管中的第二激發體積的第二微粒的第二時間-依賴脈衝；
計算第二時間-依賴脈衝在測量窗口上的一階導數；
使用第二時間-依賴脈衝的第二一階導數計算第二微粒的第二速率；和
通過比較算出的第一和第二速率，將第一和第二時間-依賴脈衝相關聯。
19.權利要求18的方法，其中第一和第二時間-依賴脈衝是從第一和第二微粒經過第一和第二激發體積時與第一和第二電磁輻射相互作用的光散射生成的。
20.權利要求18的方法，其中第一和第二時間-依賴脈衝是從第一和第二微粒經過第一和第二激發體積時與第一和第二電磁輻射相互作用的螢光生成的。
21.一種用於分析微粒的設備，其包含
毛細管；
光源；
光學系統，其將電磁輻射從光源引導到毛細管，以在毛細管中形成激發體積；
用於使流體中的微粒經過激發體積的裝置，在所述激發體積中這些微粒與電磁輻射相互作用，以散射光和/或發出螢光。
用於檢測脈衝形式的螢光的裝置；和
用於計算該螢光脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數的裝置。
22.權利要求21的設備，其還包含，用於檢測脈衝形式的散射光的裝置，和用於計算該散射光脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數的裝置。
23.權利要求21的設備，其還包含，用於使用算出的一階導數來計算微粒速率的裝置。
全文摘要
一種分析來自流式細胞儀的脈衝的方法。在所述流式細胞儀中，流體中的微粒經過電磁輻射的激發體積，並與該電磁輻射相互作用，以生成脈衝形式的信號。該方法包括生成時間-依賴脈衝，其指示經過電磁輻射的激發體積的一個或多個微粒的特性；通過用高於預定值的起點和終點選擇該脈衝的一部分來確定測量窗口；和計算該脈衝在測量窗口上關於時間的一階導數。
文檔編號G01P3/36GK101611323SQ200780043433
公開日2009年12月23日 申請日期2007年9月27日 優先權日2006年9月29日
發明者R·皮塔羅, B·高德曼, R·勒夫貝爾, D·A·金 申請人:谷阿瓦科技有限公司