紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法

2023-06-19 14:11:21 2

專利名稱：紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法
技術領域：
本發明涉及一種紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法，通過該方法可以獲得含有活性成分的產物。
背景技術：
三七[/ : notoginseng (Burk.) F. H. Chen]為五加科人參屬植物,主產於雲南，主要活性成分為三七總阜苷no toginseng saponins, PNS)。目前為止，已從三七中分離出70餘種人參皂苷，均屬達瑪烷型四環三萜皂苷。按其皂苷元類型又可細分為兩類20(S)_原人參二醇型[20 (S) -protopanaxadiol]和20(S)_原人參三醇型 [20 (S) -protopanaxatriol]。其中原人參二醇型皂苷包括 Rbl、Rb2、Re、RcU Rh2、Rg3、Rb3、C-K,PPD ;原人參三醇型皂苷包括Rgl、Rg2、Re、Rl、Rhl、Fl、PPT。天然皂苷中含量較高的是Rgl、Rb I、RcU Rl、Re、Re ;含量甚微或不含的稀有皂苷為 RcU Rg2、Rg3、Rh I、Rh2、Fl、F2、PPD、PPT> C-Κ。稀有皂苷在治療心腦血管疾病、抗腫瘤方面表現出較好的藥理活性，如人參皂苷Rd對心腦血管、神經系統、免疫系統等作用獨特,有可能成為治療腦卒中的新型臨床治療藥物。人參皂苷Rd在植物中含量少，化學合成至今尚未成功，目前僅能從原植物的根、莖、葉中提取，效率低，成本高。三七總皂苷在胃腸道中吸收較差，皂苷在胃液作用下只發生輕微的水解反應，代謝產物在腸液中酶或菌的作用下，糖苷鍵逐步斷裂，降解成稀有皂苷才真正發揮藥理作用，這個不但增加了胃腸負擔，而且降低了生物利用度。稀有皂苷在三七藥材中不含或含量甚微，可在體外通過生物法由三七總皂苷轉化獲得，並因其效率高、無汙染，而具有較好的應用前景。紅麴黴iMonascus purpureus)是一種藥用真菌,紅麴黴的發酵產物中含有洛伐他汀、豆留醇等具有降脂活性的化合物。目前，以紅麴黴發酵物為主要成分的藥品因效果顯著，安全無副作用，可長期服用的特點，佔據了中藥降血脂藥物的最大市場份額。三七的主要功效在於預防和治療腦中風，而紅麴黴培養物主要用於預防和治療高血脂和高膽固醇血症，它們二者都是防治心腦血管疾病的特效藥，但在適應症方面卻各具特色。為了達到全面防治心腦血管疾病的目的，常常同時服用三七和紅曲，但胃腸對有效成分的吸收、轉化和利用率不高。本發明以三七藥材為發酵培養基成分，直接用紅麴黴(.Monascus purpureus)對三七藥材進行生物轉化，同時獲得藥用稀有人參阜苷、洛伐他汀等活性成分。發酵過程中產生了原藥材中未檢測到，但能直接吸收和利用的活性物質，提高了藥物的生物利用度，發酵培養物兼具三七和紅曲藥效，有可能成為用於防治心腦血管疾病的新型候選藥物。以上發明內容未見國內外相關研究報導。

發明內容
本發明提供了一種紅麴黴對三七藥材進行生物轉化獲得活性成分的方法，該方法利用藥用真菌紅麴黴(ifoftasciAs發酵三七藥材，同時獲得真菌和三七藥用活性成分。該方法的操作步驟如下
(1)菌種製備將紅麴黴(ifoftascwspurpureus)接種到PPDA斜面培養基,於30溫培養，至長出菌落；
(2)按Ig粒度為80-100目的三七粉加入6-8 mL水的比例配製三七粉的水懸液，121°C滅菌30 min，即得三七培養基，備用；
(3)將步驟(I)中製備好的菌種接入步驟(2)配製的三七培養基中，於15-35°C下，120r/min搖床培養2_7 d，即得到含有活性成分的發酵產物，該產物可用於製備防治心腦血管疾病的藥物。 本發明中液體發酵物後處理將步驟(3)中培養好的液體發酵物抽濾，用純水清洗濾渣2次，合併濾液，4000 r/min下離心30 min,取上清液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層後，收集上層正丁醇相60-70°C旋蒸至乾燥，即得含皂苷活性成分的固體；濾渣菌絲體在60-70 °C烘乾至恆重，按每克菌絲體添加10-15 mL甲醇的比例加入甲醇，超聲提取30 min，然後用0.24 濾膜過濾，即得含洛伐他汀的濾液。本發明的關鍵點在於使用藥用真菌對植物藥材進行生物轉化，通過一次發酵過程同時獲得紅曲和三七藥效成分，且三七藥用皂苷成分與原藥材相比，主要皂苷的含量出現了明顯變化，同時產生了要藥材中未檢測到，但更具藥理活性的稀有皂苷成分。由於生物轉化作用，提高了藥材的生物利用度，降低了藥物的胃腸反應和副作用。本發明表明，發酵產物具有全面防治心腦血管疾病的紅曲和三七藥用成分。通過控制發酵條件，可以重構藥用成分種類和含量，進而實現定向改變和調整藥效的人為幹預。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述內容。實施例I :紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法，具體操作如下
(1)菌種製備將紅麴黴iMonascuspurpureus )接種到PPDA斜面培養基，於30 V恆溫培養3 d，至長出菌落；紅麴黴菌種從中國普通微生物菌種保藏管理中心獲得(CGMCC
3.991)；
(2)三七培養基精確稱取3g過80目篩的三七粉於100 mL三角瓶，加入20 mL水，自然pH，121 °C滅菌30 min，即得三七培養基，備用；
(3)液體發酵培養將步驟(I)中製備好的菌種接入步驟(2)製備的三七培養基中，分別於15和35 V，120 r/min培養4 d，即得到含有活性成分的發酵產物；
(4)液體發酵物後處理將步驟(3)中培養好的液體發酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣2次，合併濾液，離心(4000 r/min)30 min，取上清液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取
Ih，靜置分層後，收集上層正丁醇相旋蒸(60 °C)至乾燥，即得含皂苷活性成分的產物，用5mL70%甲醇溶解殘渣，採用HPLC檢測培養物中的皂苷成分；濾渣菌絲體在60°C烘乾至恆重，按每克菌絲體添加12 mL甲醇的比例加入25 mL甲醇,超聲提取30 min,然後用O. 24 Mm濾膜過濾，用HPLC檢測濾液中洛伐他汀含量。見表I。
表I :不同培養溫度對發酵產物有效成分種類和含量的影響
權利要求
1.一種紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法，其特徵在於該方法包括如下步驟 (1)將生產菌株為紅麴黴接種到PPDA斜面培養基中，於30°C恆溫培養，至長出菌落； (2)按Ig粒度為80-100目的三七粉加入6-8 mL水的比例配製三七粉的水懸液，121°C滅菌30 min,即得三七培養基，備用； (3)將步驟(I)中製備好的菌種接入步驟(2)配製的三七培養基中，於15-35°C下，120r/min搖床培養2_7 d，即得到含有活性成分的發酵產物。
2.根據權利要求I所述紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法，其特徵在於對含有活性成分的發酵產物進行抽濾,濾渣用純水清洗2次，合併濾液，濾液4000 r/min離心30min，上清液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層後，收集上層正丁醇相60-70°C旋蒸至乾燥，即得含皂苷活性成分的產物；濾渣菌絲體在60-70°C烘乾至恆重，按每克菌絲體添加10-15 mL甲醇的比例加入甲醇，超聲提取30 min，然後用O. 24 Mm濾膜過濾，即得含洛伐他汀的濾液。
全文摘要
本發明公開了一種紅麴黴對三七藥材進行生物轉化的方法，該方法操作步驟主要包括(1)紅麴黴(Monascuspurpureus)菌種的製備；(2)三七培養基的製備；(3)發酵培養製得到含有活性成分的發酵產物，產物後處理和主要功效成分檢測；使用本發明所提出的紅麴黴發酵三七的方法，直接以三七原藥材作為發酵底物，通過一次發酵過程同時獲得三七和紅麴黴藥用成分，使培養物兼具三七和紅曲的雙重功效，實驗顯示產物中含有降脂活性成分洛伐他汀，同時皂苷的種類和含量出現了明顯變化，產生了更具藥理活性的稀有皂苷。
文檔編號C12P33/00GK102899378SQ20121039580
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者葛鋒, 武陽陽, 王豔, 劉迪秋, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學