重組的mva及其產生方法
2023-06-19 15:16:56
專利名稱：重組的mva及其產生方法
技術領域：
本發明涉及可用於產生重組的MVA病毒的MVA突變體，以及被該突變的MVA病毒感染的宿主細胞。本發明進一步涉及DNA-載體構建體，以及用該突變的MVA病毒和該DNA-載體構建體構建重組MVA的方法。
背景技術：
牛痘病毒(VV)屬於痘病毒科(poxviruses)正痘病毒屬(Orthopoxvirus)。牛痘病毒的某些毒株例如英國Lister研究所的Elstree株作為預防天花的活疫苗已經應用了許多年。由於接種疫苗可能引發併發症(Schr，Zeitschr.FürPrventivmedizin 18，41-44 )，並且1980世界衛生組織(WHO)宣布天花已經被消滅，所以如今只有高危人群才接種以預防天花。
牛痘病毒已經被用作生產和傳輸外源抗原的載體(Smith等，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 2，383-407 )。在DNA重組技術的輔助下，這使得可以將編碼外源抗原的DNA序列(基因)引入到牛痘病毒基因組中。如果該基因在病毒DNA的整合位點對於牛痘病毒的生命周期不是必需的，那麼產生的重組牛痘病毒就可能是有侵染性的。也就是說可以侵染外源細胞並且表達所整合的基因(歐洲專利申請No.83,286和No.110,385)。這樣產生的重組病毒一方面可以用作預防感染的活疫苗，另一方面也可以用來在真核細胞中生產外源蛋白。
牛痘病毒是被最廣泛評估的活的載體，並且它所具有的高度穩定、操作廉價、便於管理、可以容納大量的外源DNA的獨特的性質也支持它被用作重組疫苗。牛痘病毒載體具有既可以誘導抗體反應又可以誘導細胞毒素反應的優點，可以以一種更為自然的方式向免疫系統提供抗原，並且在多種的動物模型中成功地作為載體疫苗用於傳染病的免疫保護。此外，牛痘病毒載體還是非常有價值的研究工具，它可以用來分析重組蛋白的結構-功能關係、鑑定體液和細胞介導的免疫反應的靶標、鑑別抗特定疾病免疫防禦的類型。
然而，牛痘病毒對人是有傳染性的，並且出於安全性的考慮和規章制度，牛痘病毒作為表達載體在實驗室中的使用受到了很大地影響。此外，重組牛痘病毒將來可能的應用，例如生產用於人類的新的治療或預防方法的重組蛋白或重組病毒粒子，很可能由於重組牛痘病毒載體多產的複製而受到阻礙。文獻中報導的大多數重組牛痘病毒都是基於牛痘病毒的西裡瑟夫(Western Reserve，WR)毒株。另一方面，已知該毒株有很強的神經毒性，因此不適合用於人和動物(Morita等，Vaccine 5，65-70 )。
出於對牛痘病毒標準毒株安全性的考慮，已經從高度減毒的病毒毒株中開發了牛痘載體。這些減毒的病毒毒株已被鑑定具有有限的體外複製能力，和體內無毒性。這些毒株需專門培養以避免出現不希望的副作用，這是早已知道的。因而，通過將牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)在雞胚成纖維細胞中經過長時間的連續傳代就可能培育出修飾的安卡拉牛痘病毒(modified vaccinia virus Ankara，MVA)(參見Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V和Stickl，H.(1975)Infection 3，6-14；瑞士專利No.568392)。該MVA病毒按照布達佩斯條約的要求在CNCM(法國國家微生物保藏中心，Institut Pasteur，Collectione Nationale de Cultures deMicroorganisms，25，rue de Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)於1987年12月15日進行保藏，保藏號為I-721。
該MVA病毒已被分析，以鑑定其相對於野生型CVA病毒在基因組上的變化。已經確定存在六個主要的缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)(Meyer，H.，Sutter，G.Mayr A.(1991)J.Gen.Virol.72，1031-1038)。這個修飾的安卡拉牛痘病毒只有很低的毒性，也就是說用於免疫接種時不具有副作用。因而特別適合無免疫應答的受試者的初次免疫。MVA毒株的卓越品質已被大量的臨床試驗所證明(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390(1987)，Stick等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392， )。
作為用於表達重組基因的安全的病毒載體，修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)是一個有價值的工具，並且，還可以用於其它不同的目的，如在體外研究蛋白質功能，或在體內誘導產生抗原特異性的細胞免疫反應或體液免疫反應。MVA最主要的優點是即使在人類和大多數哺乳動物細胞中有複製缺陷的，但仍能進行基因的高水平表達。作為一種疫苗，MVA有很好的安全記錄，能在生物安全I級的條件下操作，並已證明，當在動物體內提供異源抗原時，可產生免疫性和保護性(1-8)，其作為人類首選的疫苗已經進入到臨床階段(9-11)。
而對於新構建體進行評估的需要不斷增加，當與有複製能力的重組牛痘病毒相比較時，MVA載體的產生是不同的，這是由於該病毒的生長缺陷以及減少的細胞病變效應。因而需要快速簡易的重組MVA的構建方法，以允許對多個候選的構建體進行比較評估。
與親代毒株相比，MVA有大約有佔其基因組15％的缺失(30,000個鹼基對)，包括K1L基因的大部分。僅有263bp長度的片段依然存在於MVA基因組中。正如在1998年Antoine，G.，F.Scheiflinger，F.Dorner和F.G.Falkner所描述的，MVA的K1L基因序列對應於其基因組上20685-20981位之間的022L開放閱讀框的前263個鹼基對。該修飾的安卡拉牛痘病毒的全基因組以及它與其它正痘病毒基因組的比較可以在《病毒學》(Virology)244365-396中找到。
以前，已經開發了一種簡易高效的構建重組MVA的方法。該方法基於對牛痘病毒宿主範圍基因K1L的短暫表達的選擇。該方法基於通過短暫的宿主範圍基因表達選則重組MVA(12)，以牛痘病毒K1L基因功能作為MVA能夠在兔腎細胞系RK-13中存活的嚴格標記物。描述了構建體和新MVA載體質粒的使用，在所述質粒上攜帶有一個牛痘病毒宿主範圍基因K1L的表達框架，作為短暫的可選擇的標記。這些質粒既允許在MVA基因組上穩定地插入增加的重組基因，也允許對MVA基因組序列進行精確的靶向突變。重複DNA序列連接在K1L基因的兩側，被設計用來在非選擇培養條件下通過同源重組從病毒基因組上除去標記基因。
當上述選擇的方法直接用於構建攜帶有包括來自水母Aequorea victoria的綠色螢光蛋白(gfp)的異源基因序列的多重重組MVA時，發明人發現一部分分離的重組MVA可以在RK-13細胞系中存活，但是不能表達感興趣的目的基因。基於對分離的多重MVA分子水平的分析，發現了兩個不同的導致目的基因不表達的原因(i)在重組基因的插入位置只有標記基因K1L，並沒有重組基因插入。(ii)MVA基因組的自然缺失II的區域被影響/截短(圖1A)。第一種情形是由於首先在MVA基因組的側翼I基因序列與現有技術中的轉移質粒的側翼I重複序列之間發生了一次單交叉(12)，接著又在殘留的側翼I序列間發生了一次同源重組，於是只有K1L標記序列穩定地插到了重組MVA基因組中。第二種情形是在MVA中與轉移質粒中的K1L基因之間發生了同源重組。後一種重組的發生Tscharke和Smith也已經研究過(13)。
因此，本發明的一個目的是為克服上述問題而提供一種改進的生產重組MVA的方法。本發明進一步的目的時提供可以被用於該重組方法的MVA突變體以及DNA-載體構建體。
這體現在獨立權利要求的主題中。本發明優選的實施例體現在從屬權利要求中。
發明內容
本發明提供了一種新的MVA突變體，其特徵為該MVA的K1L基因序列(正如下面所定義的只包括一個片斷)和優選的它的啟動子序列或該啟動子序列的一個功能部分已經通過在MVA基因組上引入突變或缺失，或同時引入突變和缺失而失活。
正如上面所說到的，在MVA基因組(編碼序列)中只提供K1L基因的264bp長度的片段。另外，相應的包括另外100bp的調控序列也被提供。該MVA K1L基因序列是MVA基因組上20685-20981之間的開放閱讀框022L的一部分，正如Antoine，G.，F.Dorner，和F.G.Falkner在1998年所闡述的。這樣就可以理解失活MVA K1L基因序列的一個功能部分和調控序列是完全可以達到本發明的目的。「失活」意味著在序列上的改變，以避免在MVA中的與轉移質粒(DNA-載體構建體)上的K1L基因序列之間的同源重組，這樣就避免了在MVA基因組的自然缺失II的區域引發的影響/截短(和導致目的基因不表達)。
根據優選的實施方式，MVA的K1L基因，優選包括它的啟動子序列，或該啟動子序列的功能部分通過從病毒基因組缺失而失活。作為另一種備選方案，K1L基因功能缺陷的重組MVA可以通過序列突變來產生。例如插入突變，通過抑制K1L基因特異的同源重組使K1L基因失活。該重組的MVA可以成為方便的導入外源基因以及接下來篩選轉染的毒株的方法，即，用於獲得重組MVA的方法。
正如前面所提到的，在MVA基因組中的失活通常意味著一定程度的失活，該失活導致避免MVA中和轉移質粒(載體構建體)中的K1L基因的同源重組。在突變的情形下，本發明中失活的K1L序列與牛痘病毒(VV)中的K1L序列間的同源性低於50％，優選在10-50％之間，更優選在15-40％之間，最優選在20-30％之間。同源性為0的情況也可能存在。
在缺失突變的情形中，所缺失的片斷，至少包括MVA K1L基因的100bp，更優選包括150或200bp。如上面所說的，還可能缺失全部的264bp。此外，調控序列也應該缺失更大的程度，以避免同源重組的發生。K1L基因的編碼區和調控序列完全缺失也是可能的(即，缺失約360bp)。
使用最近建立起來的質粒DNA轉染的方法用於被MVA感染的原代雞胚成纖維細胞(CEF)，隨後在黴酚酸(mycophenolic acid)存在的情況下，通過用β-半乳糖苷酶篩選產生病毒(Sutter，G.和B.Moss.1992，PNAS USA 8910847-10851)，從而產生具有從病毒基因組中刪除K1L編碼序列的突變MVA。
本發明的原理是只要在RK-13細胞系中的MVA中不導入適當的DNA序列(K1L編碼序列和或者任意地進一步的例如編碼外源蛋白的DNA序列)，複製就不發生。因此本方法/MVA突變體/DNA構建體是適於重組MVA的篩選。同時，它們也是產生MVA的有效工具。
這裡所採用的術語「重組的MVA」指的是那些經過例如DNA重組技術而被遺傳改造的MVA，以及指的是被提供以用於諸如疫苗或是表達載體的用途的MVA。
根據本發明，重組的MVA牛痘病毒可以通過下面的步驟製備。然而，應理解，本領域的技術人員能在本發明的範圍內和運用他所具有的本領域的知識進行改變。此外，在此所引用的文獻作為參考而全部引入。
DNA構建體被導入到細胞，尤其是真核細胞中。優選鳥類、哺乳類和人類的細胞。該DNA構建體包括編碼牛痘病毒(VV)K1L蛋白或K1L來源的多肽的DNA序列，以及編碼外源多肽的DNA序列。上述兩個DNA序列均被DNA序列側面連接在非必需位點的側面。所述的非必需位點，如MVA基因組中的缺失III等自然缺失區。優選的真核細胞是被本發明中的突變的MVA多產地感染的BHK-21(ATCC CCL-10)、BSC-1(ATCC CCL-26)、CV-1(ECACC 87032605)或者MA104(ECACC 85102918)細胞，並允許同源重組。進一步優選的宿主細胞是雞的成纖維細胞，鵪鶉的成纖維細胞，QT-9細胞系，Vero細胞，MRC-5細胞，B-細胞或者是人的原發細胞(例如，原發成纖維細胞、樹突狀細胞)。
正如上面所提到的，DNA構建體包括一個編碼VV的K1L基因的序列或者是功能等效的基因的序列。在本發明中所說的功能等效是指與VV的K1L基因的核苷酸相比較包含一個或多個替換、插入、缺失的核苷酸，但不改變它的功能。這些缺失優選是1個核苷酸，但是也可以有2個、3個、4個或更多個核苷酸5』或3』或者在序列內部，或者這些核苷酸被其他的核苷酸所替代。根據本發明的這些VV的K1L等效蛋白編碼的核酸可顯示出和原始的VV的K1L基因的核苷酸例如至少有80％，更典型的為至少90％或是95％的序列一致性(如上所述)。
在本文中，特別地，編碼等效的VV的K1L蛋白的各種變化的VV的K1L基因例如在序列中的缺失、插入和/或替換，被稱為「沉默的」變化，這也被認為是本發明的一部分。
例如，在核酸序列中的這種改變被認為引起一個等同的胺基酸的替代。優選的是，這樣的胺基酸的替代是那種結構和化學性質相似的胺基酸之間的替換，即，保守性胺基酸的替換。
胺基酸的替換可以依據殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性(兩性分子)的相似性來實現。例如，疏水性胺基酸有丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性和中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正(鹼性的)電荷的胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的胺基酸有天冬氨酸和穀氨酸。
「插入」或「缺失」的數目通常是1到5個胺基酸。允許的變化的程度可以通過重組DNA方法在一個多肽序列上引入插入、缺失或替換的試驗來決定。所得的變異體可以檢測它們的生物活性。
凡是影響蛋白質N端或C端部分的核苷酸的變化通常不會改變蛋白質的活性，因為這些部分通常不涉及生物活性。每一種建議的修飾均在現階段現有技術的範圍內，並且編碼產物保持生物活性。
如果DNA構建體被導入到真核細胞中，並且K1L編碼DNA和外源DNA已經與病毒DNA重組，就可能通過在細胞中傳代分離到期望的重組牛痘病毒MVA。這些細胞要求有K1L功能來支持病毒的生長，例如RK-13細胞。重組病毒的克隆可以通過已知的噬斑純化的方式(Nakano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1593-1596[1982)；Franke等，Mol.Cell.Biol.1918-1924 ；Chakrabarti等，Mol.Cell.Biol.3403-3409 ；Fathi等，Virology 97-105 )。
這些被插入的DNA構建體可以是線性的和環狀的。環狀的DNA優選被使用。特別優選使用質粒。
這些DNA構建體可包含側面連接如下位點的左側和右側的序列在MVA基因組上非必需位點，例如缺失區III(Sutter，G.和Moss，B.(1992)Pr.C.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851)；MVA基因組上該設計的K1L缺失位點或任何根據本發明的突變MVA基因組內的非必需位點。
外源DNA序列可以被插到非必需位點，例如自然缺失區的兩側的序列之間。
外源DNA序列可以是編碼治療性多肽的基因，治療性多肽如分泌的蛋白質，例如抗體的多肽、趨化因子(chemokines)、細胞因子(cytokines)或幹擾素，或者是來源於病原體的可優選用作疫苗的多肽，或者用於生產有治療或科研價值的多肽。病原體可理解為是能引起疾病的病毒、細菌、寄生蟲，以及在生物體中無限增殖並可能導致病理生長的腫瘤。這些病原體的例子已被Davis，B.D.等人描述(《微生物》(Microbiology)，第三版，HarperInternational Edition)。優選的病原基因來源於流感病毒、麻疹和呼吸合胞病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒例如HIV I和HIV II、人類肝炎病毒例如HCV和HBV、皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、惡性瘧原蟲(malaria parasitePlasmodium falciparum)和引起肺結合的分枝桿菌(Mycobacteria)。
優選的編碼腫瘤相關抗原的基因來源於與黑色素瘤相關的鑑定抗原，例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相關蛋白1和2；睪丸癌抗原，例如，MAGE-1、-2、-3和BAGE；在腫瘤中過表達的非突變型共用抗原(non-mutated sharedantigens)，例如，Her-2/neu，MUC-1和p53。
為了使外源DNA序列或基因可以表達，必須在該DNA中提供調控序列，該調控序列是基因轉錄所必須的。該調控序列(被稱作啟動子)是本領域的技術人員已知的，例如，牛痘病毒特異性啟動子，如在EP-A-198,328中所描述的牛痘11kD基因，和7.5kD基因(EP-A-110,385)或者允許啟動牛痘病毒特異轉錄的異源痘病毒啟動子，或者允許啟動牛痘病毒特異轉錄的合成的啟動子。
根據優選的實施方式，本發明的DNA-載體構建體包括以下功能性連接的部分
-在其真正的啟動子(K1L標記基因)，牛痘病毒特異啟動子或者異源痘病毒啟動子的轉錄調控下的VV的K1L編碼序列-兩個在K1L標記基因兩側的DNA序列用於隨後通過同源重組從重組MVA中除去標記，優選的是兩個相同的無活性的(例如，大腸桿菌lacZ基因來源的)DNA片段，-一個供外源基因可選自地連接的多克隆位點，-允許牛痘病毒特異轉錄的牛痘病毒特異性啟動子或異源的痘病毒啟動子，或允許牛痘病毒特異轉錄人造的啟動子，所述部分通過兩個MVA-DNA序列被連接到側面，所述的MVA-DNA序列是外源基因的主要插入目標，插入到根據本發明上述的突變MVA基因組中的任何非必需位點中，MVA基因組的缺失區III內的位點，或者是MVA基因組中設計的K1L缺失位點。
這些DNA構建體可以通過轉染導入到細胞中，例如用磷酸鈣沉澱法(Graham等，Virol.52，456-467 ；Wigler等，Cell 777-785 )，電穿孔法(Neumann等，EMBO J.1，841-845 )，顯微注射法(Graessmann等，Meth.Enzymoloy 101，482-492(1983))，脂質體法(Straubinger等，Methodsin Enzymology 101，512-527(1983))，原生質體法(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，2163-2167(1980))或是通過本領域技術人員了解的其他方法。磷酸鈣沉澱法是優選的轉染方法。
為製備疫苗，依據本發明所產生的MVA牛痘病毒可以被轉化成生理上可以接受的形式。基於多年來為防治天花接種製備疫苗的經驗(Kaplan，Br.Med.Bull.25，131-135 )，這是可以實現的。典型的，在安瓿中，最好是玻璃安瓿中，約106-108個重組MVA顆粒於100ml添加了2％的蛋白腖和1％人血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液中被凍幹。凍乾物可包括適合於腸胃外給藥的膨脹劑(比如甘露醇、葡聚糖、糖、苷氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或者其他助劑(比如抗氧化劑、穩定劑)。然後將玻璃安瓿密封保存，最好在-20℃以下，可以保存幾個月。
為了接種，凍乾物可以溶解於0.1-0.2ml的水溶液中，優選的是生理鹽水，而且可以用於腸胃外給藥的，例如，皮下接種。根據本發明的疫苗優選在皮內注射。在注射的位置可能會有輕微的紅腫，有時還會發癢(Stickl等，supra)。給藥的方式、劑量和注射次數是本領域的技術人員通過已知的方法是可以選擇。在一定長度的時期內恰當地進行幾次免疫有利於獲得對異源抗原高水平的免疫反應。
綜上所述，本發明的生產重組MVA的方法包括以下幾步如上所述用突變的MVA感染宿主細胞，利用本發明的DNA-載體構建體轉染宿主細胞，和通過在兔腎細胞RK-13上的生長來篩選修復的MVA，或者也可用其他細胞類型，這些類型主要要求具有K1L基因功能，使MVA或如權利要求1所述的突變MVA能多產的生長。
圖1可能存在的基於K1L的宿主細胞範圍篩選的缺陷(pit-falls)和其去除的示意圖。(A)是MVA基因組(HindIII的限制性酶切譜圖)和pIIIdHR載體質粒的示意性譜圖。缺失區II的位點描述開放性閱讀框(ORFs)，包括K1L的基因片段(陰影區)。缺失區III的位點側鏈-I和側鏈-II指的是MVA-DNA序列，該MVA-DNA序列對於外源基因靶向插入MVA基因組中缺失III的位點是必需的。側鏈-I-rep表示的是與側鏈-I的右端同源的一個283bp MVA-DNA片段的重複序列，它可以通過同源重組的方法刪除K1L的表達區。K1L-標記，K1L基因序列包括真正的啟動子，Pvv，牛痘病毒的特異性啟動子，MCS，多克隆位點。1和2是指採用常規的K1L篩選(虛線顯示)潛在的不期望的同源重組事件。(B)從MVA基因組中去除K1L序列。最上面是MVA基因組的HindIII限制性酶切譜圖，下面是位於MVA基因組上的缺失II位點上的開放閱讀框(ORF)，包括成片段的K1L基因(陰影區)。pIInewLZ-gpt-delK1L的缺失質粒，攜帶在261bpK1L片段兩側的MVA序列(N2L和K2L的基因序列)；N2L-rep，N2L開發閱讀框5』區的315bp的重複區域；P11，牛痘病毒的晚期啟動子；P7.5，牛痘病毒的早期/晚期啟動子；LacZ，編碼β-半乳糖苷酶的大腸桿菌LacZ基因；gpt，編碼葉黃素-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶的大腸桿菌gpt基因。最下面是位於MVA-IInew中的缺失II位點。(C)新的MVA轉移質粒pIIIΔHR。側鏈-I和側鏈-II是指MVA-DNA序列，該序列對於外源基因靶向插入到MVA基因組中缺失III位點是必需的。K1L-標記是K1L基因的序列，包括真正的啟動子、Pvv、牛痘病毒的特異性啟動子、MCS、多克隆位點。兩個相同的lacZ衍生的DNA片段(del)拷貝位於K1L標記基因的兩側，用於隨後通過同源重組從重組的MVA上除去該可選擇的標記。
圖2包括用於HCV非結構蛋白3的基因序列的重組MVA的構建以及基因組結構。MVA基因組的HindIII限制性酶切的示意圖位於最上面。HCV編碼序列位於牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5的轉錄控制因子的下遊，並且通過同源重組的方法插入到MVA基因組缺失III的位點。側鏈-I和側鏈-II指的是MVA-DNA序列，該序列接近缺失III位點，並用於將目標重組到MVA基因組中。Rec2是指位於側鏈1的右側末端的283bp重複的MVA-DNA序列，並可以通過同源重組從最終的重組病毒基因組中去除K1L可選擇的標記。重組MVA-HCV-NS3的基因組結構示於最下方。
圖3MVA-P7.5-NS3的體外特性左圖病毒的DNA的PCR分析，用於檢測插入到缺失III位點的基因序列和NS3的特異性序列。野生型MVA的DNA基因組，MVA-HCV-NS3和轉移質粒pIII-dHR-P7.5-NS3，該質粒作為模板DNA用於擴增由瓊脂糖凝膠電泳分離的獨特的DNA片段。1-kB-梯(Gibco)作為標記(第一道)。右圖使用10IU/細胞的MVA或者MVA-P7.5-NS3感染CEF細胞，感染24小時後收集。細胞溶菌產物中的蛋白質通過SDS-10％PAGE分離，然後使用多克隆的HCV的特異性抗血清進行Western印跡分析。標準蛋白質的位置和分子量(kDa)在MW道上顯示。
以下實施例用於更好地理解本發明，而不是用來給人以本發明僅限於該實施例的主題的印象具體實施方式
為了提高K1L瞬時的選擇性技術，發明人採取了兩種方法構建沒有K1L的MVA(例如MVA(IInew)，圖1B)；設計一種新的DNA載體的構建體(轉移質粒)(例如pIIIΔHR，圖1C)。
1.病毒的生長和純化1.1MVA和MVA突變病毒的生長MVA病毒是毒性被大大地削弱了的牛痘病毒，通過在雞胚成纖維細胞(CEF)中對原始的CVA毒株進行連續的傳代培養而得到的。該產生歷史的通常的觀點、牛痘MVA毒株的特點和使用，參考Mayer等人在Infection3，6-14 的文章中進行了總結。由於適應了CEF，MVA病毒在其它細胞體系中的生長受到了極大的限制。除了一種具有良好特性、容易保持細胞系的倉鼠(hamster)幼仔的腎細胞(BHK-21)可以支持MVA病毒的生長，而且可以像CEF一樣高效的表達重組基因，而且在表達載體和活的重組疫苗的開發中已經被推薦用於標準的MVA增殖。(Drexler等，1998，J.Gen.Virol.，79，347-352)。
MVA病毒在CEF細胞中能夠正常地生長，而且它已經適應了該宿主細胞。為了製備CEF細胞，我們需要將11天齡的胚胎從孵化的雞蛋中分離出來，去除末端，把雞胚切成小塊，慢慢地溶解在含有25％胰島素的溶液中，在室溫下放置2小時。最終的細胞懸浮液用1倍體積的培養基I(MEM Eagle，例如可購自Gibco，Basle，Switerland；Order No.072-1500中所提到的)稀釋，培養基I包含5％的胎牛血清(FCS)，青黴素(100units/ml)，鏈黴素(100mg/ml)和2mM的穀氨醯胺，然後使用細胞篩過濾(例如，可購自Technomara AG，Zurich，Switzerland，Order No.Bellco 1985，150目)，然後使用臺式離心機在2000rpm、室溫下離心5分鐘使細胞沉澱(Hermle KG，D-7209 Gosheim，FRG)。細胞沉澱物佔初始培養基I體積的1/4，使用這種方法得到的CEF細胞在細胞培養皿上分散開。他們繼續在培養基I中生長，置於37℃的CO2培養箱中，根據所需的細胞密度培養1-2天，然後用來直接感染或者是經過1-2個進一步細胞傳代以後感染。原始培養物的製備在R.I.Freshney所寫的《動物細胞培養》中有清楚的描述(Alan R.Liss Verlag，New York ，第11章，99頁以後)。
我們研究的MVA突變體常規是在CEF細胞或者在倉鼠幼體的腎細胞BHK-21(美國典型培養物保藏中心ATCC CCL-10)中繁殖的，所述細胞生長在含有最低含量必需物的培養基中(MEM)，其中含有10％的胎牛血清(FCS)。BHK-21細胞保存在含有5％CO2的潮溼空氣中，溫度保持在37℃。
病毒感染使用以下的方法。細胞在175cm2的細胞培養瓶中培養。在細胞有80-90％匯合的時候除去培養基，將細胞置於MVA病毒的磷酸緩衝液(PBS/Dulbecco，例如Animed AG，Muttenz，Switzerland，Order No.23.100.10)懸浮液(每個細胞含0.01的感染粒子(＝pfu)，0.01ml/cm2)中孵育1個小時。然後加入培養基(0.2ml/cm2)，將培養瓶置於37℃條件下孵育2-3天，直到約80％的細胞已環繞。在進行下一處理之前(純化等)，病毒的溶解產物與細胞和培養基一起在-30℃條件下儲存在細胞培養瓶中，而不經處理。
1.2病毒的純化純化步驟是為了獲得儘可能純的與MVA和WR病毒(Joklik，Virology18，9-18 ；Zwartouw等，J.gen.Microbiol.29，523-529 )一致的病毒製備物，其中不含任何宿主細胞所特有的成分。被感染並保存在-30℃的條件下的細胞培養物先解凍，將塑料基板上的殘餘細胞搖晃下來或刮下來，把細胞和病毒通過離心的方法(Sorvall離心機，GSA轉子，10℃、5000rpm、1小時)與培養基分離。將含有病毒和細胞的沉澱部分一次懸浮在PBS中(沉澱體積的10-20倍)，然後將懸浮液按照上面的方法再次離心。新的沉澱物溶解在10倍體積的RSB緩衝液中(10mM Tris-HCl pH 8.0，10mMKCl，1mM MgCl2)，然後將懸浮液進行短暫的超聲處理(Labsonic 1510帶有一個直徑4毫米的探頭，購自Bender and Hobein，Zürich，Switzerland；在60W、室溫下進行2×10秒)以破碎剩餘的完整細胞使得病毒粒子從細胞膜內釋放出來。細胞核和較大的細胞碎片可以通過隨後短暫的離心除去(Sorvall GSA轉子，購自杜邦公司，D-6353Bad Nauheim，FRG；3000rpm、10℃離心3分鐘)。沉澱物再次懸浮在上述的RSB緩衝液中，按上述方法進行超聲和離心。所收集到的含有游離的病毒粒子上清液被合併，然後使用10ml含有35％蔗糖的10mM Tris-HCl pH 8.0將其分層，隨後使用KontronTST 28.38/17轉子(Kontron Instrumente，Zurish，Switzerland；相當於Beckman SW27轉子)在10℃14,000rpm下離心90分鐘。將上清液丟棄，含有病毒粒子的沉澱放入10ml，pH 8.0的10mM Tris-HCl緩衝液中，然後進行短暫的超聲處理使微粒分布均勻(室溫下進行2×10秒，使用上述的裝置)，使用分級梯度的方法進行進一步的純化過程。各級梯度分別包括含有蔗糖的5ml、pH 8.0的10mM Tris-HCl(蔗糖的濃度梯度為20％、25％、30％、35％和40％)。該梯度使用Kontron TST 28.38/17轉子在10℃下、14,000rpm下離心35分鐘。離心以後在30％和40％蔗糖區域之間可以看到幾條分散的含有病毒粒子的條帶。將這個區域從梯度中虹吸出來(10ml)，蔗糖溶液用PBS緩衝液(20ml)稀釋，然後離心將病毒沉澱出來(Kontron TST 28.38/17轉子在10℃、14,000rpm下離心35分鐘)。該沉澱這時主要含有純的病毒粒子，將它放入PBS中，使得病毒的平均濃度達到(1～5)×109pfu/ml。純化的病毒貯液可以直接使用或者按照隨後試驗的要求用PBS稀釋。
2.MVA病毒突變體的構建和鑑定2.1K1L缺失質粒的構建為了從MVA基因上去除掉剩餘的263bp的K1L序列和MVA ORF022L的啟動子序列(全部去除的序列包括MVA基因組中從20719到21169的區域，Antoine，G.，F.Scheiflinger，F.Dorner and F.G.Falkner，1998，Virology 244365-396)，發明人構建了缺失的質粒pIInewLZ-gpt-delpUCII-LZ(14)的側鏈l，以前被用於MVA基因的缺失區II的位點的同源重組的質粒由不含K1L基因序列並且已經通過PCR方法從MVA基因組的DNA中分離出來的新的側鏈(K2L)代替，所用的引物是IIflnewA5』CAG CTG CAG CGG CCG CCTTAC ACC GTA CCC 3』(SEQ ID NO1)，和IIflnewB5』CAG GCA TGC GTAGAA CGT AGA TCC GG 3』(SEQ ID NO2)。另外，N2L開放閱讀框架(ORF)的5』區域有一個315bp的重複序列(也使用PCR的方法分離，使用引物delIIA5』CAG CTG CAG CCA TAA TGG TCA ATC GCC 3』(SEQ ID NO3)和delIIB5』CAG GCG GCC GCG GTA TTC GAT GAT TAT TTT TAA CAAAAT AAC 3』(SEQ ID NO4))，被插入到LacZ-gpt-序列組件的下遊，形成了pIInewLZ-gpt-del，並且允許通過N2L基因序列的同源重組去除標記序列組件。
2.2MVA突變體的形成MVA(IInew)通過pIInewLZ-gpt-del基因轉染到感染了MVA(F6的獨立克隆)的原雞胚成纖維細胞(CEF)而獲得，接下來使用前面所述的在黴酚酸存在的條件下篩選有β-半乳糖苷酶產生的病毒(7)。篩選到重組的MVA以後，選擇壓力被除去並且分離沒有標記物的病毒(圖1B)。
3.重組MVA病毒的產生3.1質粒載體的構建另外，為了排除在MVA轉移質粒中存在的MVA重複序列和MVA基因組序列之間的同源重組的可能性，我們設計了一個新的質粒pIIIΔHR，該質粒包含K1L標記序列組件，其兩側與兩個從lacZ基因衍生而來的短的216bp重複序列連接。
K1L標記序列組件，即在其真正的啟動子的控制轉錄下的K1L編碼全序列，可以用來自Western Reserve牛痘病毒(由B.Moss博士提供，LVDNIH，Bethesda MD，USA)的基因組DNA中的一段1100-bp的DNA片段，通過PCR進行擴增，所使用的寡聚核苷酸K1L-5』-3CAG CAGCCC GGGTGCGAT AGC CAT GTA TCT ACT AAT CAG(SEQ ID NO5)和K1L-3』-1CAGCAGCCC GGGGGA AAT CTA TCT TAT ATA CAC(SEQ ID NO6)(限制性內切酶SmaI的酶切位點用下劃線標出)。
在兩側帶有正向重複序列的K1L標記序列組件從pΔK1L中切下來，如前面描述過的(12)，並插入到pIIIdHR中，取代K1L標記和側鏈I的重複序列以產生pIIIΔHR(圖1C)。MVA重組病毒的最終基因組現在將包含目標基因序列和LacZ的基因片段。插入額外的外源DNA可能會導致載體病毒的不太「乾淨」，然而該惰性序列可能會充當一個普通的基因標記，便於對重組MVA的識別。
3.2重組MVA的形成和分離最後，這些變化變化在感染/轉染實驗中對重組效率的影響被檢測。CEF細胞被MVA(F6)或者MVA(IInew)感染，然後被pIIIdHR-gfp或者pIIIΔHR-gfp轉染。48小時以後收集樣品，然後用等分試樣來感染單層RK13細胞。三天以後收集全部感染的單層細胞，將材料在RK13細胞進行二次傳代。感染三天以後可見的/gfp螢光細胞聚集體的數目可以通過紫外/可見光顯微鏡來確定。然後發明人通過這個數據計算出正確重組結果的百分數，即，插入到MVA中的K1L標記序列組件和gfp基因(Table 1)。使用發明人所提出的常規的選擇系統(MVA(F6)和pIIIdHR-gfp)，他們發現在第二次RK13傳代後全部轉化灶重組的30.5％為K1L和gfp。從MVA基因組中去除殘餘的K1L序列可以略微提高正確的重組(45％，MVA(IInew)和pIIIdHR-gfp)。然而，從MVA轉移質粒上去除側鏈I重複序列會引起預期的重組結果明顯的增加(71％)甚至使用含有殘餘的K1L序列的MVA。發明人使用新的MVA和gfp-轉移質粒(MVA(IInew)和pIIIΔHR-gfp)實際上獲得了達100％的效率。在平板稀釋和確定轉化灶的數目以前，首先進行RK13的第一次「盲」傳代，因為我們觀察到當計算在RK13第一代中GFP陽性細胞時，所得結果顯示過高正確重組的結果，然而當進入下一次傳代時，大約一半這些分離的病毒不能誘導轉化灶的GFP-陽性病毒。觀察到的這個現象可能是因為不穩定的單一重組的情況和/或來自攜帶質粒DNA的短暫gfp表達。
總結起來發明人可以通過以下手段可以大大的提高基於K1L的選擇技術(i)去除MVA基因組中殘留的K1L序列(ii)設計新的MVA轉移質粒，其攜帶同源的非MVA序列以使短暫的標記基因缺失。雖然程度不同，但是每種方法獨立使用都可以提高預期的重組病毒的產生。不含有K1L序列的MVA主幹病毒和改造過的MVA載體質粒結合使用可以實現非常高效的選擇，並且可以使基因準確的轉移到目標基因組的位點上，而且可以幾乎將MVA重組病毒單獨分離。
4.產生/選擇rMVA的方法通過這種方法成功構建了表達HCV-J細胞(基因型1b)中的非結構3(nonstructural 3，NS3)上的開放閱讀框架(ORF)的重組MVA(rMVA)，這可以作為我們當前以缺失內在的K1L序列(MVA-IInew)的MVA親代病毒為基礎並且使用了同源的非MVA重複序列(LacZ)的轉移質粒而產生rMVA這個新技術應用的一個例子。最初，我們曾試圖使用Staib C.等在2000，Biotechniques 281137-1148所描述的方法，使用傳統的宿主細胞範圍選擇的方法製備可以表達HCV-J毒株(基因型1b)中HCV NS3基因(MVA-HCV/NS3)的rMVA。
包含HCV cDNA的質粒來自一篇關於慢性肝炎的日本專利，並由日本京都大學的Kunitada Shimotohno博士(Kato等，1990，PNAS 879524-9528)提供，該質粒用PCR擴增被用來製備NS3基因(編碼HCV多肽的第1028-1658個胺基酸)，並且用於將PCR擴增的產品克隆到MVA的轉移載體pIII-dHR-P7.5中(圖2)。使用MVA(克隆分離的F6)感染單層的CEF細胞，然後使用pIII-dHR-P7.5-NS3轉染細胞，接下來使用K1L作為選擇標記，用RK13細胞進行幾步噬斑純化(plaque purification)步驟，我們沒有獲得真正的重組病毒。我們分離了穩定結合在MVA基因組缺失區3(del3)位點的只帶有K1L序列的rMVA，或者是根本不能獲得穩定生長病毒後代的rMVA。作為一種補救措施，我們決定使用我們改造的新的K1L篩選技術，把NS3基因序列重新克隆到新的MVA載體質粒pIII-ΔHR-P7.5中，然後通過同源重組，使用改進的不含有K1L的分離MVA IInew作為用於整合該表達序列組件的受體病毒。事實上，通過這種策略上的改變，我們可以只經過幾步噬斑純化的過程，就產生並且分離出我們所要的重組病毒MVA-HCV/NS3。圖3描述了通過PCR分析(左圖)所得的rMVA病毒在體外的特性，檢測到NS3的ORF已經準確的插入到了MVA基因組的del3位點，並且已經完全去除了K1L選擇標記序列組件。而且，從Western印跡分析能夠證明這種新形成的MVA-HCV/NS3可以在感染的CEF細胞中正確地產生NS3多肽(圖3，右圖)。MVA-HCV/NS3目前已經被評價為一種很有前途的可供選用的病毒載體，用於預防和/或治療人類感染HCV的疫苗的研發。因此，在本專利申請中描述的我們改進的方法，已經使我們獲得了一種您的重要的rMVA載體構建體，如果使用標準的方法，這將會很繁瑣甚至是不可能的。
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表1使用傳統的與使用新的MVA和轉移質粒方法的重組效率計算gfp-表達的轉化灶*佔光學顯微鏡下可見所有轉化灶**的百分比。括號中的數字表示的是每個樣品的兩個不同的10倍稀釋液中轉化灶的實際數值，並且每個樣品作了三個獨立的實驗。
權利要求
1.一種MVA突變體，其中在MVA基因組中的K1L基因序列和它的啟動子序列或所述序列的功能部分優選已經通過缺失或突變的方法而失活。
2.一種由權利要求1中所述的MVA感染的宿主細胞。
3.根據權利要求2所述的宿主細胞是真核細胞。
4.根據權利要求3的真核細胞是雞成纖維細胞、鵪鶉成纖維細胞、QT-9細胞、BHK-21細胞、BS-C-1細胞、MA104細胞、CV-1細胞、Vero細胞、MRC-5細胞、B-細胞或人的原代細胞(例如，原代成纖維細胞、樹突細胞)。
5.一種DNA-載體構建體，包括編碼牛痘病毒(VV)K1L基因或功能等價基因的序列。
6.根據權利要求5所述的DNA-載體構建體，其中該構建體進一步包括編碼外源蛋白質或其功能部分的DNA序列。
7.根據權利要求6所述的DNA-載體構建體，其中外源蛋白質是一種來源於包括治療性多肽和病原體的多肽以及它們中的功能部分所組成的組中的異源蛋白質。
8.根據權利要求7所述的DNA-載體構建體，其中治療性多肽來源於包括分泌蛋白質，例如抗體多肽、趨化因子、細胞因子或是幹擾素所組成的組中。
9.根據權利要求8所述的DNA-載體構建體，其中所述的病原體來源於病毒、細菌、原生動物和寄生蟲，以及腫瘤細胞或與腫瘤細胞相關的抗原和它們的功能部分所組成的組中。
10.根據權利要求8所述的DNA-載體構建體，其中病毒選自流感病毒、麻疹和呼吸道合胞體病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒、人類肝炎病毒、皰疹病毒或乳頭狀瘤病毒所組成的組中。
11.根據權利要求9所述的DNA-載體構建體，其中原生動物是惡性瘧原蟲。
12.根據權利要求9所述的DNA-載體構建體，其中細菌是引起肺結核的分枝桿菌。
13.根據權利要求9所述的DNA-載體構建體，其中與腫瘤細胞相關的抗原選自與黑色素瘤相關的分化抗原，例如絡氨酸酶、絡氨酸酶相關的蛋白質1和2；癌症檢測抗原，例如MAGE-1，-2，-3和BAGE；和在腫瘤上過度表達的未突變的共享抗體，例如Her-2/neu、MUC-1和p53。
14.根據權利要求6～13任意一項所述的DNA-載體構建體，其中牛痘病毒K1L和外源蛋白質的編碼區均在兩側連接有DNA序列，該DNA序列側面連接在MVA基因組中非必需位點。
15.根據權利要求14所述的DNA-載體構建體，其中非必需位點是MVA基因組中的缺失III的位點，MVA基因組中設計的K1L缺失的位點或根據權利要求1突變的MVA基因組上的任何非必需位點。
16.前述任意一項權利要求所述的DNA-載體構建體，其中該載體包括以下功能連接的組件-K1L標記基因，包括牛痘病毒的K1L編碼序列和轉錄單元，優選包括其真正的啟動子的轉錄控制序列，-兩個DNA序列，連接在K1L標記基因的兩側，以通過同源重組隨後從重組的MVA上除去該標記，優選兩個相同的無活性的(例如，來自大腸桿菌的lacZ)DNA片斷，-克隆位點，優選為多克隆位點，異源基因可以任意地插入該位點；-用於牛痘病毒的特異性轉錄的啟動子，優選來自牛痘病毒的啟動子，或可以使牛痘病毒特異性轉錄的異源痘病毒的啟動子，或可以使牛痘病毒特異性轉錄的合成的啟動子；所述組件側面連接有兩個MVA-DNA序列，這些序列對於外源基因靶向插入到以下位點是必需的，所述位點包括根據權利要求1突變的MVA基因組中的任何非必需位點、MVA基因組中的缺失III的位點、或MVA基因組中設計的K1L缺失的位點。
17.根據權利要求5～16中任意一項所述的DNA-載體構建體是質粒。
18.產生重組MVA的方法，包括以下步驟-用根據權利要求1的MVA突變體或野生型MVA感染MVA的宿主細胞；-用根據權利要求5～17中任意一項的DNA-載體構建體轉染該宿主細胞；和-通過在兔腎PK-13細胞中，或在任何其它本質上要求K1L基因功能，以使MVA或是權利要求1的MVA突變體能生產性生長的細胞類型中進行生長，來篩選恢復的MVA。
全文摘要
本發明涉及可用於產生重組的MVA病毒的MVA突變體，以及被這些突變的MVA病毒感染的宿主細胞。本發明進一步涉及DNA－載體構建體，以及利用這些突變的MVA病毒和DNA－載體構建體產生重組MVA的方法。
文檔編號C12N15/86GK1723285SQ200480001849
公開日2006年1月18日 申請日期2004年2月18日 優先權日2003年2月18日
發明者卡羅琳·斯泰伯, 瑪麗亞納·洛維爾, 沃克·愛爾福勒, 歌德·薩特爾 申請人:蓋斯福研究中心健康和環境有限公司