I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法與流程

2023-06-11 15:49:41

本發明屬於生物檢測
技術領域：
，尤其涉及一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法。
背景技術：
：鴨病毒性肝炎是一種以肝炎為主要特徵的急性、烈性、高傳染性及高致死性的病毒性傳染病，病原為鴨肝炎病毒(DHV)，主要引起3周齡以下的雛鴨發病。鴨肝炎病毒主要有3個血清型，分別為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，這三個血清型相互獨立，在我國流行的主要是Ⅰ型鴨肝炎病毒(DHV-I)。Ⅰ型鴨肝炎病毒在春季3-4月份最易流行，3周齡以下的雛鴨染病後的死亡率極高，一周齡以內的小鴨死亡率可達80％以上，2-3周齡也達到50％左右，嚴重危害了我國各地養鴨業的健康發展。鴨瘟是由鴨瘟病毒(DPV)引起的急性、高度死亡率的傳染病，又稱為鴨病毒性腸炎，俗稱「大頭瘟」。鴨瘟病毒是皰疹病毒，病毒粒子呈球形，各種年齡和品種的鴨均可感染，在全年各季均可發生，但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通過消化道傳播，也可通過交配、眼結膜和呼吸道傳播，病鴨及被其排洩物汙染的用具、運輸工具乃至與疫區或疫場人員的來往都可能造成鴨瘟的傳播，鴨瘟流行時，成年鴨的發病和死亡較為嚴重，1月齡以下的雛鴨發病較少，往往給養鴨業帶來巨大的經濟損失。目前，Ⅰ型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的檢測方法主要是分離培養、血清學檢測、常規PCR和實時螢光定量PCR檢測。分離培養對培養環境、營養條件、分離操作均有較高的要求，且耗時較長；血清學檢測存在結果判讀存在主觀因素、靈敏度和特異性均不高、易與衣原體等其他微生物出現交叉反應等問題；常規PCR檢測存在引物結合缺乏特異性、實驗室汙染和臨床樣品中PCR抑制物存在造成假陰性等問題，在基因擴增後還需電泳測序來驗證，相對耗時，成本也比較高；實時螢光探針PCR方法依據序列特異性探針區別物種，提高了檢測的特異性和靈敏度，如CN200810198528.9公開了一種Ⅰ型鴨肝炎病毒的分子生物學鑑別方法，採用螢光定量PCR方法鑑定Ⅰ型鴨肝炎病毒，但該方法只能檢測Ⅰ型鴨肝炎病毒，不能同時對Ⅰ型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒進行檢測而及時進行準確地分辨，容易耽誤疫情監測和疫情控制。技術實現要素：為了解決上述技術問題，本發明提供一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法，所述方法中：設計檢測I型鴨肝炎病毒的特異性引物及探針的序列分別為：上遊引物DHV-I-F：5』-TGGGATACCCAGGAGTACACGTA-3』(如SEQIDNo.1所示)；下遊引物DHV-I-R：5』-TGTTAAGCTGGGAGGTGTCTTGT-3』(如SEQIDNo.2所示)；螢光探針DHV-I-P：5』-VIC-CACCCACTGGCTTTGGAGCTGTGC-TAMRA-3』(如SEQIDNo.3所示)；設計檢測鴨瘟病毒的特異性引物及探針的序列分別為：上遊引物DPV-F：5』-CGGTTTTGGGAAGGCTTTCG-3』(如SEQIDNo.4所示)；下遊引物DPV-R：5』-ACCCTAACGGCTCCTGTAG-3』(如SEQIDNo.5所示)；螢光探針DPV-P：5』-FAM-TCCACTGGCATTTGCTTGATTTCCGC-TAMRA-3』(如SEQIDNo.6所示)。進一步的，所述方法包括：(1)設計及合成引物和探針；(2)製備陽性質粒標準品；(3)進行雙重螢光定量PCR反應條件的優化，建立雙重螢光定量PCR檢測體系；(4)採用雙重螢光定量PCR檢測體系對病毒進行檢測。進一步的，製備陽性質粒標準品的具體過程包括：A.合成用於製備陽性質粒標準品的引物；DHV引物：上遊引物P1：5』-GTTTTGGAAGGGAAGATACAGTGGT-3』；下遊引物P2：5』-GTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAAA-3』；擴增目的片段為516bp；DPV引物：上遊引物P3：5』-GCAGGGCATTTGTTAGACGATA-3』；下遊引物P4：5』-TGCCGCCAATTTGTAAAG-3』；擴增目的片段為337bp；B.用商品化試劑盒分別提取I型鴨肝炎病毒RNA和鴨瘟病毒DNA，在-70℃條件下保存備用；C.對I型鴨肝炎病毒的RNA進行反轉錄反應獲得cDNA，反應體系為含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM下遊引物P2、1mMdNTP、1U/μLRnaseInhibition(反轉錄酶抑制劑)、200UPrimeScript反轉錄酶的5×PrimescriptBuffer(5倍的反轉錄緩衝液)和DEPC水的混合液，其中5×PrimescriptBuffer表示其在混合液中的體積分數為20％；具體步驟為：將RNA模板、下遊引物P2放入65℃下水浴10min，然後冰浴5min，短暫離心後加入dNTP、RnaseInhibition、PrimeScript反轉錄酶、5×PrimescriptBuffer和DEPC水，42℃下水浴1h，70℃下水浴10min，冰浴5min，-20℃保存備用；D.分別以I型鴨肝炎病毒的cDNA和鴨瘟病毒的DNA為模板進行PCR擴增反應，然後回收純化擴增產物；其中，I型鴨肝炎病毒的cDNA的PCR擴增反應的反應體系為含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.4μM上遊引物P1、0.4μM下遊引物P2、0.8mMdNTP、1.6mMMgCl2、0.1U/μLExTaq的10×Buffer(10倍的緩衝液)和ddH2O的混合液，其中10×Buffer表示其在混合液中的體積分數為10％；擴增反應條件為：95℃預變性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30個循環，72℃延伸10min；鴨瘟病毒DNA為模板的PCR擴增反應的反應體系為含有0.2-1000ng/μL模板DNA、0.4μM上遊引物P3、0.4μM下遊引物P4、0.8mMdNTP、1.6mMMgCl2、0.1U/μLExTaq的10×Buffer和ddH2O的混合液，其中10×Buffer表示其在混合液中的體積分數為10％；擴增反應條件為：95℃預變性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30個循環，72℃延伸10min；E.將純化後的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的PCR產物分別連接到載體pMD18-T上；再將連接後載體導入大腸桿菌感受態細胞，進行轉化和塗板；最後進行提取獲得陽性標準品質粒。進一步的，所述雙重螢光定量PCR檢測體系具體包括：常規方法提取待測樣品的RNA和DNA，並對RNA進行反轉錄反應獲得cDNA；再以cDNA和DNA為模板進行雙重螢光定量PCR反應。進一步的，所述反轉錄反應的反應體系為含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM隨機引物、1mMdNTP、1U/μLRnaseInhibition、200UPrimeScript反轉錄酶的5×PrimescriptBuffer和DEPC水的混合液，其中5×PrimescriptBuffer表示其在混合液中的體積分數為20％。進一步的，所述反轉錄反應的反應條件為：42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴5min，獲得病毒cDNA。進一步的，所述雙重螢光定量PCR反應的反應體系為含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.2-1000ng/μL模板DNA、0.28μM上遊引物DHV-I-F、0.28μM下遊引物DHV-I-R、0.36μM螢光探針DHV-I-P、0.28μM上遊引物DPV-F、0.28μM下遊引物DPV-R、0.36μM螢光探針DPV-P的2×PremixExTaq和DEPC水的混合液，其中2×PremixExTaq表示其在混合液中的體積分數為50％。進一步的，所述雙重螢光定量PCR反應的反應條件為：95℃30s；95℃5s、60℃50s，40個循環。進一步的，所述雙重螢光定量PCR反應條件的優化包括：a.退火溫度優化：以質粒為模板，在53℃-61℃進行梯度定量PCR，根據擴增反應Ct、擴增曲線的螢光信號強度和熔解曲線篩選最佳退火溫度；b.引物、探針濃度的優化：以質粒為模板，引物和探針的濃度為0.04-0.4μM，進行螢光定量PCR，確定引物和探針的最佳濃度。本發明建立的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法可以同時檢測和鑑別I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒兩種病毒，具有操作簡單、敏感性高、特異性強、重複性好等優點，不僅可以節約成本、還可以為疫情監測和疫情控制爭取到寶貴的時間，並且為這兩種病毒所引起的傳染性鴨病的早期快速診斷、監測和流行病學調查等研究提供有效手段。附圖說明圖1為本發明具體實施方式的I型鴨肝炎病毒的雙重螢光定量PCR方法的標準曲線；圖2為本發明具體實施方式的鴨瘟病毒的雙重螢光定量PCR方法的標準曲線；圖3為本發明具體實施方式的I型鴨肝炎病毒的雙重螢光定量PCR方法的敏感性分析的擴增曲線；圖4為本發明具體實施方式的鴨瘟病毒的雙重螢光定量PCR方法的敏感性分析的擴增曲線；圖5為本發明具體實施方式的I型鴨肝炎病毒的雙重螢光定量PCR方法的特異性分析的擴增曲線；圖6為本發明具體實施方式的鴨瘟病毒的雙重螢光定量PCR方法的特異性分析的擴增曲線。具體實施方式本發明具體實施方式中所採用的商品化試劑主要包括：RNA體外提取試劑盒TotalRNAkit(R6934)購自OMEGA公司；DNAviruskit(D3809-01)購自OMEGA公司；Extaq酶購自TAKARA公司；RNA反轉錄試劑盒PrimescriptRTKit(RR047)購自TAKARA公司；DNA片段回收試劑盒(08214RE1)購自AXY公司；質粒小量提取試劑盒(06313KA1)購自AXY公司；螢光定量PremixExTaq酶(RR390A)購自TAKARA公司。若未特別指明，下列具體實施方式均按照常規實驗條件。一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法，包括：(1)設計和合成引物和探針；參考NCBI中I型鴨肝炎病毒的基因序列，採用Primer5軟體，設計合成一對擴增目的片段為516bp的引物，其擴增產物用於製備標準品，在該標準品序列中選取一段保守序列，應用Beacondesigner7.5軟體設計合成一對能擴增78bp的螢光定量PCR引物和TaqMan螢光探針，設計的檢測I型鴨肝炎病毒的特異性引物及探針的序列分別為：上遊引物DHV-I-F：5』-TGGGATACCCAGGAGTACACGTA-3』；下遊引物DHV-I-R：5』-TGTTAAGCTGGGAGGTGTCTTGT-3』；螢光探針DHV-I-P：5』-VIC-CACCCACTGGCTTTGGAGCTGTGC-TAMRA-3』；參照鴨瘟病毒的UL6和UL7中的保守序列，採用Primer5軟體，設計合成一對擴增目的片段為337bp的引物，其擴增產物用於製備標準品，以該標準品為模板，應用Beacondesigner7.5軟體設計合成一對能擴增78bp的螢光定量PCR引物和TaqMan螢光探針，設計的檢測鴨瘟病毒的特異性引物及探針的序列分別為：上遊引物DPV-F：5』-CGGTTTTGGGAAGGCTTTCG-3』；下遊引物DPV-R：5』-ACCCTAACGGCTCCTGTAG-3』；螢光探針DPV-P：5』-FAM-TCCACTGGCATTTGCTTGATTTCCGC-TAMRA-3』；(2)製備陽性質粒標準品；A.合成用於製備陽性質粒標準品的引物；DHV引物：上遊引物P1：5』-GTTTTGGAAGGGAAGATACAGTGGT-3』；下遊引物P2：5』-GTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAAA-3』；擴增目的片段為516bp；DPV引物：上遊引物P3：5』-GCAGGGCATTTGTTAGACGATA-3』；下遊引物P4：5』-TGCCGCCAATTTGTAAAG-3』；擴增目的片段為337bp；B.用商品化試劑盒分別提取I型鴨肝炎病毒RNA和鴨瘟病毒DNA，在-70℃條件下保存備用；C.對I型鴨肝炎病毒的RNA進行反轉錄反應獲得cDNA，反應體系為含有20ng/μL模板RNA、0.5μM下遊引物P2、1mMdNTP、1U/μLRnaseInhibition、200UPrimeScript反轉錄酶的5×PrimescriptBuffer和DEPC水的混合液；具體步驟為：將RNA模板、下遊引物P2放入65℃下水浴10min，然後冰浴5min，短暫離心後加入dNTP、RnaseInhibition、PrimeScript反轉錄酶、5×PrimescriptBuffer和DEPC水，42℃下水浴1h，70℃下水浴10min，冰浴5min，-20℃保存備用；D.分別以I型鴨肝炎病毒的cDNA和鴨瘟病毒的DNA為模板進行PCR擴增反應，然後回收純化擴增產物；其中，I型鴨肝炎病毒的cDNA的PCR擴增反應的反應體系為含有20ng/μL模板cDNA、0.4μM上遊引物P1、0.4μM下遊引物P2、0.8mMdNTP、1.6mMMgCl2、0.1U/μLExTaq的10×Buffer和ddH2O的混合液；擴增反應條件為：95℃預變性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30個循環，72℃延伸10min；鴨瘟病毒DNA為模板的PCR擴增反應的反應體系為含有20ng/μL模板DNA、0.4μM上遊引物P3、0.4μM下遊引物P4、0.8mMdNTP、1.6mMMgCl2、0.1U/μLExTaq的10×Buffer和ddH2O的混合液；擴增反應條件為：95℃預變性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30個循環，72℃延伸10min；回收純化擴增產物使用Axygen的DNA柱式膠回收試劑盒進行膠回收；E.製備陽性標準品質粒，具體包括：將純化後的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的PCR產物分別連接到載體pMD18-T上；再將連接後載體導入大腸桿菌感受態細胞，進行轉化和塗板；最後進行提取獲得陽性標準品質粒；(3)進行雙重螢光定量PCR反應條件的優化，建立雙重螢光定量PCR檢測體系；S1.雙重螢光定量PCR檢測體系標準曲線的製作以108-102copies/μL的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的質粒分別作為模板進行PCR擴增反應，得到I型鴨肝炎病毒的雙重螢光定量PCR方法的標準曲線(圖1)和鴨瘟病毒的雙重螢光定量PCR方法的標準曲線(圖2)，由圖可知每個反應體系中模板拷貝數在108-102copies/μL的範圍內有很好的線性關係，相關係數為0.999，I型鴨肝炎病毒的擴增效率為E＝100.8％，鴨瘟病毒的擴增效率為E＝95.7％；S2.雙重螢光定量PCR反應條件的優化a.退火溫度優化：以標準品質粒為模板，在53℃-61℃進行梯度定量PCR，根據擴增反應Ct、擴增曲線的螢光信號強度和熔解曲線篩選最佳退火溫度；b.引物、探針濃度的優化：以標準品質粒為模板，引物和探針的濃度為0.04-0.4μM，進行螢光定量PCR，確定引物和探針的最佳濃度；經試驗摸索表明，I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的引物的終濃度均為0.28μM，I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的探針的終濃度均為0.36μM，最佳退火溫度為60℃；S3.建立雙重螢光定量PCR檢測體系，檢測體系具體包括：①採用商業試劑盒，使用常規方法提取待測品的RNA和DNA，並對RNA進行反轉錄反應獲得cDNA，所述反轉錄反應的反應體系為含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM隨機引物、1mMdNTP、1U/μLRnaseInhibition、200UPrimeScript反轉錄酶的5×PrimescriptBuffer和DEPC水的混合液；反轉錄反應的反應體系中的隨機引物、dNTP、RnaseInhibition、PrimeScript反轉錄酶、5×PrimescriptBuffer、DEPC水均來自RNA反轉錄試劑盒PrimescriptRTKit(RR047)；反應條件：42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴5min，獲得病毒cDNA；②以cDNA和DNA為模板進行雙重螢光定量PCR反應，反應體系為含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.2-1000ng/μL模板DNA、0.28μM上遊引物DHV-I-F、0.28μM下遊引物DHV-I-R、0.36μM螢光探針DHV-I-P、0.28μM上遊引物DPV-F、0.28μM下遊引物DPV-R、0.36μM螢光探針DPV-P的2×PremixExTaq和DEPC水的混合液；反應條件為：95℃30s；95℃5s、60℃50s(收集螢光信號)，40個循環；S4.對已經建立的雙重螢光定量PCR檢測體系進行檢驗①雙重螢光定量PCR檢測方法的敏感性分析將質粒標準品進行10倍倍比稀釋，取1×108-1×102copies/μL標準質粒各2μL作為混合模板進行雙重螢光定量PCR檢測，確定最低檢出量並設立陰性對照；設置7組試驗，分別以10倍倍比稀釋的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的質粒(1×108-1×102copies/μL)作為模板進行PCR擴增，試驗組號與質粒濃度的對應關係如表1所示：表1試驗組號與質粒濃度的對應關係試驗組號質粒濃度(copies/μL)11×10821×10731×10641×10551×10461×10371×102敏感性結果分別見圖3和圖4，由圖可知，採用1×102copies/μL的質粒作為模板對I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒進行PCR檢測仍然都有螢光曲線，表明該檢測方法敏感度為100copies/μL；②雙重螢光定量PCR檢測方法的特異性分析應用本發明提供的雙重螢光定量PCR檢測體系，分別對包括I型鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒在內的多種病毒樣品進行檢測，驗證I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法的特異性；應用本發明提供的雙重螢光定量PCR檢測方法對12組病毒樣品進行檢測，各組病毒樣品中所含病毒種類如表2所示：表2各組病毒樣品中所含病毒種類特異性結果如圖5和圖6所示，由圖可知，只有I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒有擴增螢光曲線，其他病原核酸檢測均無擴增螢光曲線，因此該檢測方法特異性較好；③雙重螢光定量PCR檢測方法的重複性分析重複性試驗分為組內重複試驗和組間重複試驗，組內重複試驗：在同一試驗中用106copies/μL的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的質粒標準品混合模板做5個平行的反應，計算各濃度螢光Ct值的標準差和變異係數，驗證I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法的穩定性；組內重複試驗結果如表3所示，對同一樣品做5個平行的反應，I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法的組內重複性良好；表3雙重螢光定量PCR組內重複性試驗組間重複試驗：對上述同一混合模板以相同的反應條件在3d和7d後重複進行試驗，計算其Ct值的標準差和變異係數，驗證I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法的穩定性；組間重複試驗結果如表4所示，採用相同的核酸模板，以相同的檢測條件，3d和7d後重複進行試驗，I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的Ct值平均變異係數分別為0.30％和1.2％，I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法的組間重複性良好；表4雙重螢光定量PCR組間重複性試驗(4)採用雙重螢光定量PCR檢測體系對病毒進行檢測；利用建立的雙重螢光定量PCR檢測體系對江蘇徐州地區鴨群收集的166份肛拭子進行檢測，結果檢出Ⅰ型鴨肝炎病毒13份(陽性率7.8％)，鴨瘟病毒75份(陽性率45％)。最後應說明的是，以上實施方式僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施方式對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。序列表中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒雙重螢光定量PCR方法6PatentInversion3.3123DNA人工序列1TGGGATACCCAGGAGTACACGTA23223DNA人工序列2TGTTAAGCTGGGAGGTGTCTTGT23324DNA人工序列3CACCCACTGGCTTTGGAGCTGTGC24420DNA人工序列4CGGTTTTGGGAAGGCTTTCG20519DNA人工序列5ACCCTAACGGCTCCTGTAG19626DNA人工序列6TCCACTGGCATTTGCTTGATTTCCGC26當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp