獲得紫杉烷類雙萜的高生產性培養細胞的方法

2023-06-11 08:48:56

專利名稱：獲得紫杉烷類雙萜的高生產性培養細胞的方法
本申請是申請號為94191435.6、申請日為1994年11月9日、發明名稱為「紫杉烷類雙萜的生產方法以及獲得以高產量產生紫杉烷類雙萜的培養細胞的方法」的發明專利申請的分案申請。
本發明涉及適於用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治療劑的紫杉烷類雙萜(包括紫杉酚)的生產方法，以及獲得以高產量產生紫杉烷類雙萜的培養細胞的方法。
紫杉醇適於用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治療劑，它是從短葉紫杉中分離後鑑定出的紫杉烷類雙萜，短紫杉是一種紫杉屬、紫杉科植物，並且具有與其活性相關的複合酯基。在短葉紫杉的植物體的所有部分中均可發現紫杉醇，但是據報導，樹皮中紫杉醇的含量超過了所有其它部分中的含量。目前，從天然的或培養的植物體中收集紫杉醇，但是紫杉屬植物生長緩慢，而且其生長至距地20cm需要10年以上，這還不算剝掉樹皮後樹會死亡，因此不易得到大量紫杉醇。如果能夠通過組織培養製備紫杉烷類雙萜如紫杉醇和作為紫杉醇前體的漿果赤黴素III，那麼可以容易地獲得大量紫杉醇而不需要砍樹，因此是有利的。
作為通過利用培養的植物細胞生產紫杉醇的常規方法，美國專利公開了利用培養的短葉紫杉的生產方法(US5,019,504)，但是，其中所述紫杉醇的產率為1-3mg/l，這不足以工業化生產。此外，通過細胞培養生產紫杉醇不穩定，甚至當可以通過選擇得到高生產率的初生細胞時，也難以通過傳代培養保持其含量[E.R.M.Wickremesine等，細胞與組織培養國際會儀(1992)]。
另一方面，作為紫杉醇生產的現有技術，Holton等的US5,015,744說明書中描述了由漿果赤黴素III(紫杉醇生物合成中的前體)開始的半合成方法。通過使用植物組織培養物，可以製備用於半合成方法的原料如漿果赤黴素III，因此該植物組織培養物也可以通過上述半合成方法用於生產紫杉醇。
本發明的第一個目的是提供通過植物組織培養物生產紫杉烷類雙萜的簡單方法。
本發明的第二個目的是提供獲得以高產量產生紫杉烷類雙萜的培養細胞的方法。
本申請的第一個發明是生產紫杉烷類雙萜的方法，其中在至少一種選自茉莉酮酸類化合物(jasmonic acids)、含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯(antiethylene)劑的物質存在下，培養產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞，然後從所得培養物中回收紫杉烷類雙萜。
本申請的第二個發明是生產紫杉烷類雙萜的方法，其中通過自培養開始階段控制培養瓶中氣相氧的濃度低於大氣中氧的濃度，或者通過自培養開始階段控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解的氧濃度低於此溫度下飽和溶解的氧的濃度，對產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞進行培養，然後從所得培養物中回收紫杉烷類雙萜。
本申請的第三個發明是獲得以高產量產生紫杉烷類雙萜的培養細胞的方法，其中產生紫杉烷類雙萜的植物細胞因其比重不同而分成許多層，雙至少一層中的細胞進行培養，然後從培養細胞中選擇以高產量產生紫杉烷類雙萜的培養細胞。
下面將更詳細地描述本發明。
本發明的紫杉烷類雙萜沒有具體限定為任何雙萜，只要它具有紫杉烷骨架即可，其說明性實例包括紫杉醇、7-表紫杉醇、漿果赤黴素III、7-表漿果赤黴素III、cephalomannine、7-epicephalomannine、10-脫乙醯基漿果赤黴素III、10-脫乙醯基cephalomannine、10-脫乙醯基紫杉醇、taxagifine及其類似物、紫杉烷1a及其類似物、木糖基cephalomannine和木糖基紫杉醇等。
本發明用於生產紫杉烷類雙萜的植物是例如紫杉屬，例如歐洲紫杉、東北紫杉、東北紫杉var.nana REHDER、短葉紫杉、加拿大紫杉、紅豆杉和米堤亞紫杉。
按照本申請的第一個發明，可以通過已知的方法進行上述植物培養，只是要在至少一種下述物質存在下培養產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞，這些物質是茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑。
用於本申請第一個發明的茉莉酮酸類化合物的實例包括通式(I)所示的化合物 ，通式(II)所示的化合物 ，通式(III)所示的化合物 。
優選的上述通式(I)所示的茉莉酮酸類化合物的實例包括通式(I′)所示化合物 ，優選的上述通式(II)所示的茉莉酮酸類化合物的實例包括通式(II′)所示化合物 ，優選的上述通式(III)所示的茉莉酮酸類化合物的實例包括通式(III′)所示化合物 。
在上述通式(I)、(II)和(III)中，以R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6、R6a、R7、R8或R9表示的具有1-6個碳原子的烷基的實例包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
在上述通式(I)、(II)和(III)中，以R1a、R1b、R1c、R1d、R1e或R1f表示的具有1-6個碳原子的烷氧基的實例包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基和正己氧基。
當R7是OM時，以M表示的鹼金屬原子或鹼土金屬原子的實例包括例如鈉、鉀和鈣。
當R7是NHR8時，以R8表示的具有1-6個碳原子的醯基可以是直鏈的或支鏈的，其實例包括例如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基和丙烯醯基。
當R7是NHR8時，以R8表示的胺基酸殘基的實例包括異亮氨醯基、酪氨醯基和色氨醯基。
當R7是OR9時，以R9表示的糖殘基的實例是吡喃葡糖基，並且當上述通式(I)中的R6b是-O-糖殘基時，糖殘基的實例是吡喃葡糖基。
在上述通式(I)、(II)和(III)所示的化合物中，可以在五元環中相鄰的碳原子之間形成雙鍵。
通式(I)所示化合物的說明性實例包括下述化合物(化合物A)
(化合物B)
(化合物C)
(化合物D)
通式(II)所示化合物的說明性實例包括下述化合物(化合物E)
(化合物F)
(化合物G)
(化合物H)
通式(III)所示化合物的說明性實例包括下述化合物(化合物I)R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6HC3與C4之間形成雙鍵R7-OH或-OCH3n1-3(化合物J)R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6HR7-OHn1。
其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e或R1f是羥基或者在五元環中的相鄰碳原子之間形成雙鍵的通式(III)所示化合物的說明性實例包括下述化合物(水合物K)
(1)n＝1，R＝H(2)n＝7，R＝H(3)n＝7，R＝OH(化合物L)
(1)R＝H(2)R＝OH(化合物M)
(化合物N)
通式(I)、(II)或(III)所示化合物的優選實例包括其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6是氫原子，R7是羥基或甲氧基，由C1-C2-C3-C4-C5-C6組成的側鏈不含雙鍵或者在C1與C2、C2與C3或C3與C4之間含有一個雙鍵的化合物。
用於本發明的以通式(I)、(II)或(III)表示的茉莉酮酸類化合物具有各種立體異構體(順-反異構體和旋光異構體)，每個異構體可以單獨使用或者以混合物的形式使用。
上述所有的茉莉酮酸類化合物都可以改善紫杉烷類雙萜的生產率，但是，從其高效改善生產率的角度出發，特別優選的是塊根油酮酸(tuberonic acid)、塊根油酮酸甲酯(methyl tuberonate)、南瓜子酸(cucurbic acid)、南瓜子酸甲酯(methyl cucurbate)、茉莉酮酸和茉莉酮酸甲酯(它們是其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6是氫原子，R7是羥基或甲氧基，n是1，且在C3與C4之間形成雙鍵的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物)。
這些茉莉酮酸類化合物是通過合成或者提取等方法從植物中產生的(H.Yamane等，Agric.Biol.Chem.，44，2857-2864(1980))。
附帶說一下，有關於各種植物本身以植物激素類物質的形式產生茉莉酮酸類化合物的說明，所述植物激素類物質可引起各種與生長促進、組織成熟和表現為抵抗疾病有關的各種反應(TeruhikoYoshihara.Shokubutsu Saibo Kogaku，Vol 2，No.4 523-531(1990))。
因此，本發明所涉及的茉莉酮酸類化合物不僅能從培養體系的外部加入，也可以由培養細胞或培養組織自身產生。促進培養細胞或培養組織產生這種內源性茉莉酮酸類化合物的方法的實例包括向培養基中加入微生物培養物、其提取物或其熱處理的物質或者植物提取物，這種方法的說明性實例是加入真菌細胞壁部分，參見M.J.Mueller等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(16)，7490-9494(1993))。通過用機械方法或者用紫外線處理或加熱的方法部分損傷培養細胞或培養組織，也可以增加內源性茉莉酮酸類化合物的產量，這種方法的一個說明性實例是將一部分細胞機械破碎(R.A.Cleeman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(11)，4938-4941(1989))。
由於茉莉酮酸類化合物難溶於水，因此通常將其溶於有機溶劑如乙醇和甲醇中，或者將其溶於表面活性劑等中，然後加至培養基中。可以使用游離形式的茉莉酮酸類化合物本身，或者使用其用鹼中和的鹽的形式。
在茉莉酮酸類化合物中，以通式(I)或(III)表示的化合物中傾向於以穩定的反式而非不穩定的順式形式存在，因為通過酸、鹼或加熱可在五元環中羰基的α-位發生差向異構作用。在使用天然或合成茉莉酮酸類化合物的平衡試驗中，反式茉莉酮酸類化合物以90％的比例存在，而順式茉莉酮酸類化合物以10％的比例存在。一般認為順式茉酮酸類化合物具有更高的活性。但是，本發明所用的茉莉酮酸類化合物包括上述式(I)或(III)所示化合物的所有立體異構體及其混合物。
培養基中茉莉酮酸類化合物的濃度需要為0.01-1000μM，並且按照本申請的第一個發明，特別優選的是控制茉莉酮酸類化合物的濃度為0.1-500μM。
在DE 4122208 C1中描述了通過向植物細胞培養物中加入茉莉酮酸類化合物誘導產生某些次級代謝產物，但是，未見有關在茉莉酮酸類化合物作為培養基添加劑存在下對產生紫杉烷類雙萜的植物進行組織培養的報導，而且出乎所有預料的是通過本申請第一個發明的方法增加了紫杉烷類雙萜的產量，這裡紫杉烷類雙萜與上述專利中所述次級代謝產物具有完全不同的生物合成途徑或生物合成控制機理。
在國際專利公開WO 93/17121中描述了茉莉酮或甲基茉莉酮可以有效地誘導紫杉醇產生，這裡所述的茉莉酮或甲基茉莉酮具有與式(I)、(II)或(III)所示茉莉酮酸類化合物相似的結構。但是這些化合物不象茉莉酮酸類化合物那樣具有式(I)、(II)或(III)中由式-(CH2)n-CO-R7所示的基團例如羧基，而且發現這些化合物的紫杉醇誘導活性很低(參見比較實施例24)。
用於本申請第一個發明的重金屬沒有特別限定為任何重金屬，只要其屬於銅或鐵族即可，但是作為銅族的金屬，特別優選使用銀，作為鐵族的金屬，特別優選使用鈷。除此之外，當使用銀或鈷時，優選以含有所述重金屬的化合物、含有所述金屬的複合離子形式或以所述金屬離子的形式使用。這些化合物可以單獨使用或者結合使用。
含銀化合物的說明性實例包括硝酸銀、硫酸銀、氟化銀、氯酸銀、高氯酸銀、醋酸銀、亞硫酸銀、六氟磷酸銀(V)、四氟硼酸銀、硫酸雙胺合銀(I)和二氨基合銀酸(I)鉀(potassium diamiuoargentate)等。其中，可以列舉的特別優選的化合物是硝酸銀和硫酸銀等。
含銀複合離子的說明性實例包括[Ag(S2O3)2]3-、[Ag(S2O3)3]5-、[Ag(NH3)2]+、[Ag(CN)2]-、[Ag(CN)3]2-、[Ag(SCN)2]-和[Ag(SCN)4]3-等。其中，可以列舉的特別優選的複合離子是[Ag(S2O3)2]3-和[Ag(S2O3)3]5-等。
含鈷化合物的說明性實例包括氯化鈷、硝酸鈷、硫酸鈷、氟化鈷、高氯酸鈷、溴化鈷、碘化鈷、硒酸鈷、硫氰酸鈷、醋酸鈷、硫酸鈷銨、硫酸鈷(II)鉀、氯化六胺合鈷(III)、氯化五胺合鈷(III)、氯化硝基五胺合鈷(III)、氯化二氯四胺合鈷(III)半水合物、氯化二硝基四胺合鈷(III)、氯化碳酸根四胺合鈷(III)、四硝基二胺合鈷酸(III)銨、六硝基合鈷酸(III)鈉、氯化三(乙二胺)合鈷(III)三水合物、氯化二氯二(乙二胺)合鈷(III)、三(草酸根)合鈷酸(III)鉀三水合物、六氰基合鈷酸(III)鉀、(乙二胺四乙酸根)合鈷酸(III)鉀二水合物、氫四羰基合鈷(I)、二羰基(環戊二烯基)合鈷(I)、八羰基合二鈷(O)、六羰基乙炔合二鈷(O)、二(環戊二烯基)合鈷(I)和(環戊二烯基)(1，5-環辛二烯)合鈷(I)等。
含鈷複合離子的說明性實例包括五胺水合(aqua)鈷離子、硝基五胺合鈷離子、二氯四胺合鈷離子、二硝基四胺合鈷離子、碳酸根四胺合鈷離子、四硝基二胺合鈷離子、六硝基合鈷離子、三(乙二胺)合鈷離子、二氯二(乙二胺)合鈷離子、三(草酸根)合鈷離子、六氰基合鈷離子和(乙二胺四乙酸根)合鈷離子等。
在所述重金屬中，含銀化合物、含銀複合離子或銀離子在培養基中的濃度優選為10-8M-10-1M，進一步優選的濃度為10-7M-10-2M。含鈷化合物、含鈷複合離子或鈷離子在培養基中的濃度優選為10-6M-10-1M，進一步優選的濃度為10-5M-10-2M。
迄今為止，未見有關在含銀化合物、含銀複合離子或銀離子作為培養基添加劑存在下對產生紫杉烷類雙萜的植物進行組織培養的報導。儘管在通常用作紫杉屬植物組織培養的培養基(例如linsmaier-Skoog培養基。Murashige-Skoog培養基和Gamborg’s B-5培養基)中包括作為培養基成分之一的含鈷化合物或鈷離子，但是其使用濃度為1×10-7M-4×10-7M[Growth and breeding of a woody plant，由thelatest biotechnology complete works editors committee編輯，NogyoTosho，第265-268頁]，這遠低於本發明方法所用的濃度。同時，象上述銀化合物的情況一樣，未見有關在本申請第一個發明中所用的高濃度的含鈷化合物或鈷離子存在下對產生紫杉烷類雙萜的植物進行組織培養的報導。此外，出乎所有預料的是通過在這些重金屬存在下進行培養，增加了紫杉烷類雙萜的產量。
按照本申請的第一個發明，術語「胺類」是指胺或其鹽。作為用於本申請第一個發明的胺類，可以使用單胺類或多胺類，但是，特別優選使用多胺類。
此外，用於本申請第一個發明的胺類的實例包括單-、二-或三烷基胺，其中烷基的部分氫原子可以被羥基取代，例如甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、二乙醇胺、三乙醇胺或其鹽；多亞甲基二胺，其中多亞甲基部分可以被亞氨基中斷，並且氨基中的氫可以被低級烷基取代，例如腐胺、屍胺、亞精胺、精胺、乙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、三亞乙基四胺或其鹽；環烷胺例如環戊胺、環己胺或其鹽；或環胺如六亞甲基四胺和哌嗪或其鹽。在這些胺中，可以列舉的優選的胺是多胺如腐胺[NH2(CH2)4NH2]、屍胺[NH2(CH2)5NH2]、亞精胺[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2]、精胺[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2]、乙二胺[NH2(CH2)2NH2]、N，N-二乙基-1，3-丙二胺[(C2H5)2N(CH2)3NH2]、二亞乙基三胺[NH2(CH2)2NH(CH2)2NH2]等或其鹽。
所述胺在培養基中的濃度優選為10-8M-10-1M，進一步優選的濃度為10-7M-10-2M。
通過向植物組織培養物中加入胺誘導產生次級代謝產物的一個說明性實例可見於日本專利公開4-262788，其中通過向長春化的培養細胞中加入胺誘導了吲哚生物鹼的產生。但是，未見有關在胺作為培養基添加劑存在下對產生紫杉烷類雙萜的植物(這是與長春花不同種的植物)進行組織培養的報導，並且出乎所有預料的是，由此可以增加紫杉烷類雙萜的產量，這裡紫杉烷類雙萜與吲哚生物鹼具有完全不同的生物合成途徑。
用於本申請第一個發明的抗乙烯劑沒有特別限定為任何具體的物質，只要它是抑制培養物的乙烯生物合成機理的物質和/或去除培養物中保留的乙烯或者去除在含培養物的培養瓶中於氣相中或培養基中存在的乙烯的物質即可。
抑制乙烯生物合成機理的方法的說明性實例包括如下抑制將S-腺苷甲硫氨酸催化轉化為1-氨基環丙烷-1-甲酸的酶的活性的方法和抑制將1-氨基環丙烷-1-甲酸催化轉化為乙烯的酶的活性的方法，具有前一功能的化合物的說明性實例包括氨基羥乙酸(aminoxyaceticacid)、乙醯水楊酸、Rhizobitoxine、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、甲氧基乙烯基甘氨酸、α-氨基異丁酸和2，4-二硝基苯酚等。還可以包括所述化合物的鹽、酯、胺基酸衍生物和糖衍生物。
鹽的說明性實例包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽；酯的說明性實例包括甲酯、乙酯、丙酯和丁酯；胺基酸衍生物的說明性實例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的說明性實例包括葡萄糖和麥芽糖衍生物。本發明的鹽、酯、胺基酸衍生物和糖衍生物不僅僅限於上述化合物。
具有後一功能的化合物的說明性實例包括五倍子酸、其鹽、酯、胺基酸衍生物和糖衍生物[Hiroshi Hyodo，Society of HorticultureAutumn Convention 1987 Symposium Summary，p.122，SusumuKuraishi，Phytohormone，Tokyo University Publication，p.111]。
鹽的說明性實例包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽；酯的說明性實例包括甲酯、乙酯、丙酯和丁酯；胺基酸衍生物的說明性實例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的說明性實例包括葡萄糖和麥芽糖衍生物。本發明的鹽、酯、胺基酸衍生物和糖衍生物不僅僅限於上述化合物。
去除培養物中保留的乙烯或者去除在含培養物的培養瓶中於氣相中或培養基中存在的乙烯的物質的說明性實例包括1，5-環辛二烯和異硫氰酸及其鹽、酯(例如異硫氰酸烯丙酯和異硫氰酸苄酯)、胺基酸衍生物和糖衍生物[Megumi Munakata，Chemical control in plants，29(1)，89-93(1994)]。
鹽的說明性實例包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽；酯的說明性實例包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和烯丙酯；胺基酸衍生的說明性實例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的說明性實例包括葡萄糖和麥芽糖衍生物。本發明的鹽、酯、胺基酸衍生物和糖衍生物不僅僅限於上述化合物。
抗乙烯劑在培養基中的所需濃度為10-8M-10-1M，特別優選的是控制抗乙烯劑的濃度為10-7M-10-2M。
已知乙烯是一種植物激素，參與許多植物中出現的各種生理現象，例如個體生長、形態發生和老化。Kim，Dong II等在Biotechnol.Bioeng.，38(4)，331-339(1991)中報導了一個利用乙烯提高植物次級代謝產物的生產率的說明性實例。但是，正如上述報導中通常表明的那樣，在所有利用控制乙烯來提高次級代謝產物的生產率的實例中，都是控制對植物組織培養物補充乙烯，而迄今為止，未見有關象本發明方法一樣利用對抑制乙烯產生的控制來改善次級代謝產物生產的報導。
此外，抗乙烯劑一般用作花、水果和蔬菜的保鮮劑，而未見有關將抗乙烯劑用於改善次級代謝產物生產的報導。
在這種情況下，本發明人發現，乙烯通過產生紫杉烷類雙萜的植物組織和細胞大大抑制了紫杉烷類雙萜的產生。因此，基於上述發現，發明人在抗乙烯劑存在下對所述組織培養物進行了培養，結果發現，抗乙烯劑不僅控制了上述抑制作用，而且還明顯提高了從培養物中獲得紫杉烷類雙萜的量。到目前為止，未見有關通過在抗乙烯劑存在下培養產生紫杉烷類雙萜的植物組織培養物誘導紫杉烷類雙萜產生的報導，並且出乎所有預料的是上述次級代謝產物的生產率甚至可以通過本申請第一個發明的方法得以提高。
用於本申請第一個發明的培養基的實例包括植物組織培養慣用的那些已知培養基，例如Murashige Skoog培養基(1962)、linsmaier Skoog培養基(1965)、木本植物培養基(1981)、Gamborg’s B-5培養基和Mitsui’s M-9培養基。
植物激素，以及如果需要，碳源、無機成分、維生素、胺基酸等也可以加入這些培養基中。
作為碳源，可以使用二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，澱粉或者以適當比例混合的兩種或更多種這些糖源的混合物。
無機成分的說明性實例包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些成分可以以化合物的形式加入，例如硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀和氯化鈷等。
作為植物激素，可以使用例如植物生長素如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及細胞激動素如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為維生素，可以使用例如生物素、硫胺(維生素B1)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸等。
作為胺基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、穀氨醯胺和半胱氨酸等。
一般來說，碳源的使用濃度約為1-30g/l，無機成分的使用濃度約為0.1μM-100mM，植物激素的使用濃度約為0.01-10μM，而維生物和胺基酸的使用濃度分別為約0.01-100mg/l。
按照本發明，液體培養基和通常含有0.1-1％瓊脂和gelan膠的固體培養基都可以使用，但是，一般優選使用液體培養基。
本發明的組織培養可以使用所述植物的一部分根的組織或細胞、生長點、葉、莖、種子、花粉、花葯及花萼等，或者使用在上述培養基或其它常用培養基中通過其組織培養得到的培養細胞。
本發明還可以用於通過用根瘤土壤桿菌或髮根病土壤桿菌感染植物獲得的贅生性細胞/或髮根。
通過在至少一種選自茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質存在下對這些組織和細胞進行培養，可以得到比在一般培養條件下進行組織培養所得到的培養組織或培養細胞具有更高紫杉烷類雙萜生產率的培養組織或培養細胞。
當至少一種選自含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質與上述通式(I)、(II)或(III)所示的茉莉酮酸類化合物一起使用時，本申請第一個發明的作用得以加強。
通過用有機溶劑如甲醇萃取，可以從培養物例如按照上述方法獲得的培養組織、培養細胞和培養基中分離出紫杉烷類雙萜。通過使合適的吸附劑或有機溶劑共存於培養基中，還可以在培養過程中連續回收紫杉烷類雙萜。
對本發明一個優選的組織培養實例可以進行如下說明。
將一片紫杉屬植物的植物體，例如根、生長點、葉、莖、和種子等滅菌，置於用gelan膠固化的木本植物培養基中，於10-35℃保持約14-60天，這樣一部分組織碎片就變成了愈傷組織。通過將如此得到的愈傷組織傳代培養，生長速度逐漸增加，並且得到穩定的愈傷組織。術語穩定的愈傷組織是指在培養過程中保持愈傷組織狀態而沒有分化成莖葉或根，並且它的細胞生長速度均勻的愈傷組織。
將這種穩定的愈傷組織轉入適於生長的液體培養基例如液體木本植物培養基中，並使其生長。在液體培養基中生長速度進一步增加。按照本發明，使穩定的愈傷組織或構成上述愈傷組織的細胞在至少一種選自茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質存在下，於固體培養基或液體培養基中生長。而且，還可以根據穩定的愈傷組織或構成所述愈傷組織的細胞的比重的不同將其分成多層，並且使至少一層中所含有的細胞在含有至少一種選自茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物，含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質的培養基中生長。
在一般的按其比重將細胞分層的已知方法中，由用於離心分離的培養基形成密度梯度，將細胞在其上分層，然後進行離心分離。
作為離心分離用的培養基，可以使用Ficoll、Percoll(均由Pharmacia LKB Biotechnology Co.Ltd.生產)、蔗糖和氯化銫等。在包括實施例5在內的實施例中，通過使用Ficoll產生密度梯度，培養基沒有特別限定為任何物質，只要其不損傷細胞即可。
形成密度梯度的層數沒有別限定。對各層的比重之差沒有具體限制，而且各層的比重之差可以相同或不同。
因此，密度梯度的定義包括其中梯度連續變化的情況(即其中形成密度梯度的層數接近於無窮大，而且各層間的比重差接近於0)。
通過如此形成密度梯度、使細胞分層和進行離分分離，可以按其比重的差別將細胞分成多層。
所形成的層的比重一般為1.00-1.20g/ml、優選1.03-1.11g/ml。作為用於培養的層，至少選擇一層，但是也可以選擇所有的層，並對其進行培養。
當選擇了多層並對所選層中所含的細胞進行培養時，可以將細胞在各層中分別培養，但是，也可以將所選多層的兩層或更多層中的細胞混合併進行培養。
通過培養比重為1.07或更低的層中所含的細胞，一般可以得到具有高紫杉烷類雙萜生產率的培養細胞，但是也不總是限定在這樣的比重範圍內，因為比重會隨所培養的細胞或培養條件而波動。還有一種趨勢，就是當按比重差異進行分層時，較高比重層中的細胞具有較高的紫杉烷類雙萜含量。因此，為了確保可以得到以高產量生產紫杉烷類雙萜的培養細胞，需要將分配在所有層中的細胞培養一段時間，然後測定各層細胞中紫杉烷類雙萜的濃度，並從這些層中選擇含有以高產量生產紫杉烷類雙萜的培養細胞的層。
通過製備具有特定比重(如1.07g/ml)的離心分離用培養基並按上述方法進行離心分離，也可以按比重的差異將細胞分成多層。
再者，本申請第一個發明可以與本申請第二個發明一起使用，其中通過自培養的開始階段控制培養瓶中氣相氧的濃度低於大氣中氧的濃度、或者通過自培養的開始階段控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度低於在同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，進行培養。
在這裡，術語「培養的開始階段」是指從開始培養至培養開始後的第7天這一段時間，而控制培養瓶中氣相氧的濃度或者控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度優選從培養開始時進行。控制時間沒有特別的限制，並且在所述條件下的控制可以在整個培養期間進行，或者只是在整個培養期間的一部分時間內進行，但是優選在整個培養期間至少控制3天。
培養瓶中氣相氧的濃度需要控制在4-15％、特別優選控制在6-12％。液體培養基中溶解氧的濃度需要控制在於同樣溫度下飽和溶解氧濃度的1-75％、特別優選控制在10-75％。
還可以將本申請的第一個發明、本申請的第二個發明與本申請的第三個發明全部結合在一起。
按照本申請的第一個發明，當培養細胞處於指數生長期或平穩期時加入茉莉酮酸類化合物是有效的，並且特別優選在從指數生長期至平穩期的過渡階段中加入茉莉酮酸類化合物。同樣可以述及的是旨在增加內源性茉莉酮酸類化合物產量的處理時間。例如，當對細胞進行各為21天的傳代培養時，第7-16天是加入茉莉酮酸類化合物或者進行處理以增加內源性茉莉酮酸類化合物產量的適宜時間，而且當細胞在指數生長期、例如在7-14天進行傳代培養時，適宜的時間是移植後的當即。加入茉莉酮酸類化合物或者進行處理以增加內源性茉莉酮酸類化合物產量可以一次性、分多次或連續進行。
在培養開始後以及在培養細胞從指數生長期至平穩期的過渡階段前加入含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子或重金屬離子是有效的，特別優選在培養開始時加入。所述化合物或離子的加入可以一次性或分多次進行。
在細胞從指數生長期至平穩期的過渡階段前加入胺是有效的，特別優選在培養開始時加入。所述化合物的加入可以一次性或分多次進行。
在細胞從指數生長期至平穩期的過渡階段前加入抗乙烯劑是有效的，特別優選在過渡到平穩期後立即加入。所述化合物的加入可以一次性或分多次進行。
本申請第一個發明的組織培養溫度一般為約10-35℃，根據高生長速度，優選約23-28℃。培養周期優選為14-42天。
當液體培養基用於本申請第一個發明的培養時，在培養完成後可以通過例如傾析或過濾等方法從培養基中分離出培養細胞，並且通過例如用有機溶劑萃取等方法，可以從培養的細胞和/或培養基中分離出所需的紫杉烷類雙萜。
下面說明本申請的第二個發明。
按照本申請的第二個發明，培養植物是指培養植物的組織或細胞，其中按常規的已知方法進行培養，不同的是自培養的開始階段通過控制培養瓶中氣相氧的濃度低於大氣中氧的濃度、或者自培養的開始階段通過控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度低於在同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，進行培養。
迄今為止，在生產紫杉烷類雙萜的植物的培養中，未見有關在如此條件下進行培養的報導，所述條件是補充給進行組織或細胞培養的培養瓶的氣相氧的濃度或者與組織或細胞接觸的培養基中溶解氧的濃度低於大氣中氧的濃度或者低於飽和溶解的氧濃度，並且出乎所有預料的是由此增加了紫杉烷類雙萜的產量。
按照本申請的第二個發明，進行組織或細胞培養的培養瓶中氣相氧的濃度需要控制在4-15％、特別優選控制在6-12％。與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度需要控制在同樣溫度下飽和溶解氧濃度的1-75％、特別優選控制在10-75％。
用於本申請第二個發明的培養基的實例包括植物組織培養慣用的那些已知培養基，例如Murashige Skoog培養基(1962)、Linsmaier Skoog培養基(1965)、木本植物培養基(1981)、Gamborg’s B-5培養基Mitsui’s M-9培養基等。
植物激素，以及如果需要，碳源、無機成分、維生素、胺基酸等也可以加入這些培養基中。
作為碳源，可以使用二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，澱粉或者以適當比例混合的兩種或更多種這些糖源的混合物。
無機成分的說明性實例包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些成分可以以化合物的形式加入，例如硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀和氯化鈷等。
作為植物激素，可以使用例如植物生長素如吲哚乙酸(LAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及細胞激素如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為維生素，可以使用例如生物素、硫胺(維生素BI)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸等。
作為胺基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、穀氨醯胺和半胱氨酸等。
一般來說，碳源的使用濃度約為1-30g/l，無機成分的使用濃度約為0.1μM-100mM，植物激素的使用濃度約為0.01-10μM，而維生物和胺基酸的使用濃度分別為約0.01-100mg/l。
按照本申請的第二個發明，液體培養基和通常含有0.1-1％瓊脂和gelan膠的固體培養基都可以使用。
本申請第二個發明的組織培養可以使用所述植物根的組織碎片或細胞、生長點、葉、莖、種子、花粉、花葯及花萼等，或者使用在上述培養基或其它常用培養基中通過其組織培養得到的培養細胞。
本申請第二個發明還可以用於通過用根瘤土壤桿菌或髮根病土壤桿菌感染植物獲得的贅生性細胞/或髮根。
當自培養的開始階段通過控制培養瓶中氣相氧的濃度低於大氣中氧的濃度、或者自培養的開始階段通過控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度低於同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，對這些組織或細胞進行培養時，可以得到比一般培養條件下進行組織培養所得到的培養組織或培養細胞具有更高紫杉烷類雙萜生產率的培養組織或培養細胞。
按照本申請的第二個發明，「培養的開始階段」是指從開始培養至培養開始後的第7天這一段時間，而控制培養瓶中氣相氧的濃度、或者控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度優選從培養開始時進行。
控制時間沒有特別的限制，並且在所述條件下的控制可以在整個培養期間進行，或者只是在整個培養期間的一部分時間內進行，但是優選在整個培養期間至少控制3天。
可以將本申請第二個發明的製備方法與在各種紫杉烷類雙萜生產促進物質存在下進行的培養方法一起使用，以進一步提高紫杉烷類雙萜的生產率。
紫杉烷類雙萜生產促進物質的實例包括例如用於上述本申請第一個發明的、上述通式(I)、(II)或(III)所示的茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的複合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑。
還可以將申請的第二個發明與下面將要詳述的本申請的第三個發明一起使用，其中按照其比重的差異將細胞分配於多層中，並且對至少一層中所含的細胞進行培養。
可以將本申請第二個發明的製備方法與所述本申請第一個發明的方法(其中在茉莉酮酸類化合物等存在下進行培養)以及本申請第三個發明的方法(其中按照其比重的差異將細胞分配於多層中，並且對至少一層中所含的細胞進行培養)一起使用。
通過用有機溶劑如甲醇萃取，可以從培養物例如按照上述方法獲得的培養組織、培養細胞和培養基中分離出紫杉烷類雙萜。
對本申請第二個發明的一個優選的組織培養實例可以進行如下說明。
將一片紫杉屬植物的植物體，例如根、生長點、葉、莖、和種子等滅菌，置於用gelan膠固化的木本植物培養基中，於10-35℃保持約14-60天，這樣一部分組織碎片就變成了愈傷組織。通過將如此得到的愈傷組織傳代培養，生長速度逐漸增加，並且得到穩定的愈傷組織。術語穩定的愈傷組織是指在培養過程中保持愈傷組織狀態而沒有分化成莖葉或根，並且它的細胞生長速度均勻的愈傷組織。
將這種穩定的愈傷組織轉入適於生長的液體培養基例如液體木本植物培養基中，並使其生長。在液體培養基中生長速度進一步增加。按照本發明，使穩定的愈傷組織或構成上述愈傷組織的細胞在下述培養條件下生長，其中自培養的開始階段控制培養瓶中氣相氧的濃度低於大氣中氧的濃度、或者自培養的開始階段控制與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度低於同樣溫度下飽和溶解的氧濃度。
通過消耗氧(呼吸作用)，組織或細胞獲得用於維持和個體生長所需的能量。眾所周知，當培養組織或細胞時，隨著培養時間的推移，細胞質量增加，氧的消耗也增加。因此，除非從體系外部強行補充流通氣體，否則隨著培養時間的推移，含有組織或細胞的培養瓶(例如燒瓶)中氣相氧的濃度、或者與組織或細胞接觸的培養基中溶解氧的濃度自然下降到低於大氣中氧的濃度或者同樣溫度下飽和溶解的氧濃度。
本發明與上述發現的不同之處在於通過將含有組織或細胞的培養瓶中氣相氧的濃度、或者培養基中溶解氧的濃度能動地控制在低於大氣中氧的濃度或同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，進行培養。
在增強本發明效果的一個說明性方法中，在增養瓶中的組織或細胞進行傳代培養之前，將培養瓶中氣相氧的濃度或者液體培養基中溶解氧的濃度預先控制在低於大氣中氧的濃度或者同樣溫度下飽和溶解的氧濃度。
如上所述，控制時間沒有特別的限制，但是優選在整個培養期間至少控制3天。
此外，控制方法沒有特別的限制，只要該方法可以將含有組織或細胞的培養瓶中氣相氧的濃度、或者與組織或細胞接觸的液體培養基中溶解氧的濃度控制在低於大氣中氧的濃度或者同樣溫度下飽和溶解的氧濃度即可，該方法的某些實例是將通過使空氣與氮氣等混合(以降低氧濃度)得到的、具有控制的氧濃度的氣體直接通入培養瓶中的氣相中或培養基中；或者將這樣的氣體直接通入培養瓶外面的培養基中(即在通氣罐等中)，然後將該培養基倒入培養瓶中；或者將補充到培養瓶中的氣體(如空氣)以控制餵入速度的方式直接通入氣相或培養基中；或者將此氣體直接通入培養瓶外面的培養基中(即在通氣罐等中)，然後將此培養基倒入培養瓶中；或者將培養瓶置於低氧氣氛下進行培養；或者在氧吸附劑存在下進行培養。
本發明的組織培養溫度一般為約10-35℃，根據高生長速度，優選約23-28℃。培養周期優選為14-42天。
當液體培養基用於本發明的培養時，在培養完成後可以通過例如傾析或過濾等方法從培養基中分離出培養細胞，並且通過例如用有機溶劑萃取等方法，可以從培養的細胞和/或培養基中分離出所需的紫杉烷類雙萜。通過使吸附劑或合適的有機溶劑共存於培養體系中，還可以在培養過程中連續回收所需的化合物。
下面說明本申請的第三個發明。
按照本申請的第三個發明，可以列舉的含有培養細胞(所述細胞經培養後顯示了高紫杉烷類雙萜生產率)的層是比重為1.07或更低的層。
在一般的按其比重將細胞分層的已知方法中，由用於離心分離的培養基形成密度梯度，將細胞在其上分層，然後進行離心分離。
作為離心分離用的培養基，可以使用Ficoll、Percoll(均由Pharmacia LKB Biotechnology Co.Ltd.生產)、蔗糖和氯化銫等。在實施例中，通過使用Ficoll產生密度梯度，但是培養基沒有特別限定為任何物質，只要其不損傷細胞即可。Ficoll已經用於分離核外粒體等(Hess，R.等，Nature 208(1965)，856-858)或者用於分離動物細胞(Walder，I.A.等，Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.，112(1963)494-496)等。
形成密度梯度的層數沒有特別限定。
在實施例中，由比重為1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的層形成了各層比重之差為0.02的密度梯度，但是比重之差並不限於該值，而且各層比重之差可以相同或不同。
因此，密度梯度的定義包括其中梯度連續變化的情況(即其中形成密度梯度的層數接近於無窮大，而且各層間的比重差接近於0)。
通過如此形成密度梯度、使細胞分層和進行離心分離，可以按其比重的差異將細胞分成多層。
所形成的層的比重一般為1.00-1.20g/ml、優選1.03-1.11g/ml。作為用於培養的層，至少選擇一層，但是也可以選擇所有的層，並對其進行培養。
當選擇了多層並對所選層中所含的細胞進行培養時，可以將細胞在各層中分別培養，但是，也可以將所選多層的兩層或更多層中的細胞混合併進行培養。
通過培養比重為1.07或更低的層中所含的細胞，一般可以得到具有高紫杉烷類雙萜生產率的培養細胞，但是也不總是限定在這樣的比重範圍內，因為比重會隨所培養的細胞或培養條件而波動。還有一種趨勢，就是當按比重的差異進行分層時，較高比重層中的細胞具有較高的紫杉烷類雙萜含量。因此，為了確保可以得到以高產量生產紫杉烷類雙萜的培養細胞，需要將分配在所有層中的細胞培養一段時間，然後測定各層細胞中紫杉烷類雙萜的濃度，並從這些層中選擇含有以高產量生產紫杉烷類雙萜的培養細胞的層。
迄今為止，未見有關在按照細胞的比重將其分配之後、對產生紫杉烷類雙萜的植物培養細胞進行培養的報導，並且出乎所有預料的是，按照比重之差可以將細胞分成具有不同紫杉烷類雙萜生產率的多個細胞層，而且通過培養比重為1.07或更低的層中所含的且在被分配時其紫杉烷類雙萜的含量並沒有如此之高的細胞可以得到以高產量生產紫杉烷類雙萜的細胞。
按照本發明，還可以根據比重的不同，通過製備具有特定比重(例如1.07g/ml)的、用於離心分離的培養基，並按照上述方法進行離心分離，將培養細胞分成多層。
本發明所用培養基包括通常的培養基成分。作為這樣的成分，通常使用無機成分和碳源，還可以加入植物激素、維生素、以及(如果需要)胺基酸。作為碳源，可以使用二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，澱粉或者以適當比例混合的兩種或更多種這些糖源的混合物。
無機成分的說明性實例包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些成分可以以化合物的形式加入，例如硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀和氯化鈷等。
作為植物激素，可以使用例如植物生長素如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及細胞激動素如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為維生素，可以使用例如生物素、硫胺(維生素B1)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸等。
作為胺基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、穀氨醯胺和半胱氨酸等。
一般來說，無機成分的使用濃度約為0.1μM-100mM，碳源的使用濃度約為1-30g/l，植物激素的使用濃度約為0.01-10μM，而維生物和胺基酸的使用濃度分別為約0.01-100mg/l。
用於本發明的培養基的實例包括植物組織培養慣用的那些已知培養基，例如Murashige Skoog培養基(1962)、Linsmaier Skoog培養基(1965)、木本植物培養基(1981)、Gamborg’s B-5培養基和Mitsui’s M-9培養基。其中可以加入上述植物激素、以及(如果需要)上述碳源、維生素和胺基酸。
按照本發明，液體培養基和通常含有0.1-1％瓊脂和gelan膠的固體培養基都可以使用，但是優選使用液體培養基。
本發明的組織培養可以使用所述植物根的組織碎片或細胞、生長點、葉、莖、種子、花粉、花葯及花萼等，或者使用在上述培養基或其它常用培養基中通過其組織培養得到的培養細胞。
與沒有進行分層的對照區域相比，通過將這些細胞分成特定的比重範圍、然後按照本發明對其進行培養，可以得到具有較高紫杉烷類雙萜生產率的培養細胞。通過用有機溶劑如甲醇萃取，可以從這些培養細胞中分離出紫杉烷類雙萜。
本發明一個優選的組織培養實例可以進行如下說明。
將一片紫杉屬植物的植物體，例如根、生長點、葉、莖、和種子等滅菌，置於用gelan膠固化的木本植物培養基中，於10-35℃保持約14-60天，這樣一部分組織碎片就變成了愈傷組織。通過將如此得到的愈傷組織傳代培養，生長速度逐漸增加，並且得到穩定的愈傷組織。術語穩定的愈傷組織是指在培養過程中保持愈傷組織狀態而沒有分化成莖葉或根，並且它的細胞生長速度均勻的愈傷組織。
將這種穩定的愈傷組織轉入適於生長的液體培養基例如液體木本植物培養基中，並使其生長。在液體培養基中生長速度進一步增加。
本發明的組織培養溫度一般為約10-35℃，根據高生長速度，優選約23-28℃。培養周期優選為14-42天。
當液體培養基用於本發明的培養時，在培養完成後可以通過例如傾析或過濾等方法從培養基中分離出培養細胞，並且通過例如用有機溶劑萃取等的方法，可以從中分離出所需的紫杉烷類雙萜。
按照本申請的第一個發明的第二個發明，可以容易地獲得大量紫杉烷類雙萜。
按照本申請的第三個發明，可以通過簡單的操作獲得以高產量生產紫杉烷類雙萜的培養細胞。
當本申請的第一個、第二個或第三個發明工業化實施時，通過單獨或者結合使用本申請的下列第四、第五、第六或第七個發明，可以進一步增加其效率。
這就是說，必需向培養液中補充含氧氣體以培養產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞。空氣一般用於此目的，但是，經過深入的研究之後，本發明發現通過使用含有0.03-10％、優選0.1-5％二氧化碳的氣體作為通入對產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞進行培養的罐中的氣體，可以有效地生產紫杉烷類雙萜，從而完成了本申請的第四個發明。
本申請人還發現通過對產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞進行兩階段培養，可以明顯提高培養物中紫杉烷類雙萜的生產率，並且可以控制因傳代培養所造成的紫杉烷類雙萜生產率的波動，所述兩階段包括第一階段和第二階段，在第一階段中使用加入了氧化劑或水溶性含氧有機化合物的培養基，以便獲得在隨後的階段中用於生產紫杉烷類雙萜的活化的組織或細胞，第二階段是在促進紫杉烷類雙萜生產的條件下進行的，這樣便完成了本申請的第五個發明。在此，氧化劑的實例包括過硫酸鹽如過硫酸鉀和過氧化氫，水溶性含氧有機化合物的實例包括二甲基甲醯胺、二甲亞碸和乙二醇等。上述添加劑在培養基中的總濃度在加入後的當即優選為10-6M-10-1M，更優選的是將其濃度控制在10-5M-10-2M。
本發明人還發現通過將組織或細胞接種於含有濃度為2-50g/l、優選10-30g/l的糖化物和/或濃度為2-50mmol/l、優選10-30mmol/l的硝酸根離子的培養基中，然後通過每天向培養基中連續或間歇加入含有0.2-5g/l、優選0.5-3g/l糖化物和/或0.2-5mmol/l、優選0.5-3mmol/l硝酸根離子的營養源(相對於所述培養基的初始體積)，可以對產生紫杉烷類雙萜的植物組織或細胞進行高密度培養，由此每一培養瓶中紫杉烷類雙萜的產量可以明顯提高，這樣便完成了本申請的第六個發明。在此，我們稱「密度」為培養瓶中單位體積培養溶液的細胞質量，表示為幹細胞質量(g)/升培養溶液。按照本申請的第六個發明，優選在進行培養的同時，通過加入上述營養源溶液、同時從組織或細胞中分離和取出相同體積的培養基對培養基進行更新，並且從至少一種選自所得培養物、培養過程中取出的回收培養基和培養結束時所得的培養基的所得物中回收紫杉烷類雙萜。本申請的第六個發明對於改善高密度培養中紫杉烷類雙萜的生產率特別有效，其中在開始培養時相對於培養基體積的上述植物的組織或細胞的密度為50g鮮重/升或者更高。
再者，儘管當獲得高密度細胞時一般就終止培養，但是，本發明人經過深入的研究，完成了在移出細胞的同時繼續培養的連續培養，並且經過進一步檢驗之後最終完成了連續培養方法，這就是本申請的第七個發明。這就是說，通過下述方法可以以常規方法難以實現的高速度產生紫杉烷類雙萜，所述方法是以0.1-10的特定更新比例(該比例由無量綱數F＝VI/V/μ定義，其中V是培養罐中培養基的總體積，VI是補充新鮮培養基的速度，μ是組織或細胞的具體生長速度)連續或間歇加入新鮮的培養基，並且從連續或間歇從培養罐中取出的、含組織或細胞的培養基中和/或連續或間歇從培養罐中取出的、既不含組織也不含細胞的培養溶液中回收紫杉烷類雙萜，這樣便完成了本申請的第七個發明。更優選的是將培養基的特定更新比例F設置為0.5-5。培養溶液中糖化物的濃度優選為5-40g/l，培養溶液中硝酸根離子的濃度優選為10-40mmol/l。對於每升中細胞鮮重為50-500g的細胞密度，本發明是有效的，但是，只要其所處的密度範圍不需要極劇烈的攪拌，那麼密度越高，越能有效地生產紫杉烷類雙萜，因此優選的密度為每升200g或者更高。
為了將本申請的上述第四、第五、第六或第七個發明與本申請上述第三個發明結合，可以按照本申請的第四、第五、第六或第七個發明，對本申請第三個發明所得到的細胞進行培養，以生產所需的紫杉烷類雙萜。
附圖的簡要說明

圖1是表示在加入100μM茉莉酮酸甲酯後，培養基中紫杉醇產量的變化圖。
圖2是表示在加入100μM茉莉酮酸甲酯後，培養基中漿果赤黴素III產量的變化圖。
圖3是對按照本申請第二個發明進行組織培養所使用的培養裝置的一個實例的圖解說明。圖3中所用的每個數字具有如下含義。1空氣供入管2氮氣供入管3培養瓶4補充含氧氣體的分布器5溶解氧的電極6溶解氧的濃度控制器7出口8閥門9氧氣流控制閥10空氣過濾器11高速攪拌機圖4是表示分層後在培養物中的生長圖。
圖5是表示分層後培養物中紫杉烷含量的圖。
圖6是表示細胞在各層中分布的圖。
圖7是表示各層中紫杉烷含量(在細胞中)的圖。
圖8是對按照本申請第六或第七個發明進行組織培養所使用的培養裝置的一個實例的圖解說明。圖8中所用的每個數字和字母具有如下含義。12培養基餵入管13培養基餵入口14隻用於取出培養基(該培養基不含組織和細胞)的帶有過濾器的開口15培養基出口管16補充含氧氣體的分布器17高速攪拌機18培養混合物(含組織或細胞的培養溶液)的排出管19加壓流入口a、b、c、d和e閥門實施本發明的最佳方式用下列實施例和比較實施例進一步說明本發明，但是這些實施例不構成對本發明範圍的限制。[實施例1]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％重量的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基的錐瓶中，培養基中加有上述成分以達到同樣的濃度，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，120rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在25℃進行為期14天的搖動培養。在開始培養後的第14天，加入作為通式(I)所示化合物的tuberonic acid的甲酯(通式(I)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6a表示氫原子，R6b是羥基，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵)，以使最終濃度達到0.01-1000μM，然後再培養7天。
培養完成後，經過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到每升液體培養基中培養細胞的產量。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比效對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表1中。[比較實施例1]實施實施例1的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。所得結果示於表1中。[實施例2]實施實施例1的方法，只是從開始培養後的第7天開始，每2天一次，連續4次加入tuberonic acid的甲酯(每次達到25μM的最終濃度，並達到100μM的總濃度)。所得結果示於表1中。[實施例3]
實施實施例1的方法，只是在開始培養後的第一天加入100μM的tuberonic acid的甲酯，然後再進行20天的培養。所得結果示於表1中。[實施例4]實施實施例1的方法，只是在開始培養後的第7天加入100μM的tuberonic acid的甲酯，然後再進行14天的培養。所得結果示於表1中。
表1
以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例5]首先用不鏽鋼篩對由實施例1的方法得到的加快生長速度的細胞進行篩分，得到粒度為250-840μM的細胞簇。用Ficoll製備比重為1.07(g/ml)的培養基，將上述細胞鋪於其上，並以700rpm的轉速離心6分鐘。細胞按其比重不同分為兩層。分出比重為1.07g/ml或更低的層中所含的細胞，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌後，將1克(鮮重)細胞轉入含20ml液體木本植物培養基的錐瓶中，並在25℃搖動培養14天。在培養開始後的第14天，加入tuberonic acid的甲酯，使其最終濃度達到250μM，再培養7天。培養完成後，實施實施例1的方法。所得結果示於表2中。通過將選擇具有特定比重的細胞與添加tuberonic acid的甲酯相結合，可以大大提高紫杉烷類雙萜的生產率。[比較實施例2]實施實施例5的方法，只是不加tuberonic acid的甲酯。所得結果示於表2中。
表2
以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例6]向按實施例1的方法開始培養後的第14天獲得的短葉紫杉的培養細胞中加入250μM tuberonic acid的甲酯，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例1的方法。所得結果示於表3中。[比較實施例3]實施實施例6的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。結果示於表3中。[實施例7]實施實施例6的方法，只是使用米堤亞紫杉的培養細胞。結果示於表3中。[比較實施例4]實施實施例7的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。結果示於表3中。
表3
以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例8]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，120rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在25℃進行為期14天的搖動培養。在開始培養後的第14天，加入作為一種茉莉酮酸類化合物的cucurbic acid的甲酯(通式(II)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵)，以使最終濃度達到0.01-1000μM，然後再培養7天。
培養完成後，經過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到每升液體培養基中培養細胞的產量。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表4中。[比較實施例5]實施實施例8的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。所得結果示於表4中。[實施例9]實施實施例8的方法，只是從開始培養後的第7天開始，每2天一次，連續4次加入cucurbic acid的甲酯(每次達到25μM的最終濃度，並達到100μM的總濃度)。所得結果示於表4中。[實施例10]實施實施例8的方法，只是在開始培養後的第一天加入100μM的cucurbic acid的甲酯，然後再進行20天的培養。所得結果示於表4中。[實施例11]實施實施例8的方法，只在在開始培養後的第7天加入100μM的cucurbic acid的甲酯，然後再進行14天的培養。所得結果示於表4中。
表4
以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例12]首先用不鏽鋼篩對由實施例8的方法得到的加快生長速度的細胞進行篩分，得到粒度為250-840μM的細胞簇。用Ficoll製備比重為1.07(g/ml)的培養基，將上述細胞鋪於其上，並以700rpm的轉速離心6分鐘。細胞按其比重不同分為兩層。分出比重為1.07g/ml或更低的層中所含的細胞，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌後，將1克(鮮重)細胞接種至含20ml液體木本植物培養基的錐瓶中，並在25℃搖動培養14天。在培養開始後的第14天，加入cucurbic acid的甲酯，使其最終濃度達到250μM，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例8的方法。所得結果示於表5中。通過將選擇具有特定比重的細胞與添加cucurbic acid的甲酯相結合，可以大大提高紫杉烷類雙萜的生產率。[比較實施例6]實施實施例12的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。所得結果示於表5中。
表5
*)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例13]向按實施例8的方法開始培養後的第14天獲得的短葉紫杉的培養細胞中加入250μM cucurbic acid的甲酯，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例8的方法。所得結果示於表6中。[比較實施例7]實施實施例13的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。結果示於表6中。[實施例14]實施實施例13的方法，只是使用米堤亞紫杉的培養細胞。結果示於表6中。[比較實施例8]實施例14的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。結果示於表6中。
表6
*)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例15]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，120rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在25℃進行為期14天的搖動培養。在開始培養後的第14天，加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵，其中90％是反式，10％是順式)，以使最終濃度達到0.01-1000μM，然後再培養7天。
培養完成後，經過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到每升液體培養基中培養細胞的產量。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表7中。[比較實施例9]實施實施例15的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。所得結果示於表7中。[實施例16]實施實施例15的方法，只是從開始培養後的第7天開始，每2天一次，連續4次加入茉莉酮酸甲酯(每次達到25μM的最終濃度，並達到100μM的總濃度)。所得結果示於表7中。[實施例17]實施實施例15的方法，只是在開始培養後的第一天加入100μM的茉莉酮酸甲酯，然後再進行20天的培養。所得結果示於表7中。[實施例18]實施實施例15的方法，只是在開始培養後的第7天加入100μM的茉莉酮酸甲酯，然後再進行14天的培養。所得結果示於表7中。[實施例19]實施實施例15的方法，只是加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是羥基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵，其中90％是反式，10％是順式)，以使最終濃度達到0.01-1000μM。所得結果示於表8中。[比較實施例10]實施實施例19的方法，只是不加入茉莉酮酸。結果示於表8中。[實施例20]在加入100μM茉莉酮酸甲酯之前、加入後的第3天以及加入後的第7天，實施例15的培養基中所含的紫杉烷類雙萜的分析結果示於圖1和圖2中。在培養的第7天，約一半紫杉醇和約70％漿果黴素III滲入培養基中。實施實施例20的方法，只是不加茉莉酮酸甲酯。結果示於圖1和圖2中。首先用不鏽鋼篩對由實施例15的方法得到的加快生長速度的細胞進行篩分，得到粒度為250-840μM的細胞簇。用Ficoll製備比重為1.07(g/ml)的培養基，將上述細胞鋪於其上，並以700rpm的轉速離心6分鐘。細胞按其比重不同分為兩層。分出比重為1.07g/ml或更低的層中所含的細胞，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌後，將1克(鮮重)細胞接種至含20ml液體木本植物培養基的錐瓶中，並在25℃搖動培養14天。在培養開始後的第14天，加入茉莉酮酸甲酯，使其最終濃度達到250μM，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例15的方法，所得結果示於表9中。通過將選擇具有特定比重的細胞與添加茉莉酮酸甲酯相結合，可以大大提高紫杉烷類雙萜的生產率。[比較實施例12]實施實施例21的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。所得結果示於表9中。[實施例22]向按實施例15的方法開始培養後的第14天獲得的短葉紫杉的培養細胞中加入250μM茉莉酮酸甲酯，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例15的方法。所得結果示於表10中。[比較實施例13]實施實施例22的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。結果示於表10中。[實施例23]實施實施例22的方法，只是使用米堤亞紫杉的培養細胞。結果示於表10中。[比較實施例14]實施實施例23的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。結果示於表10中。
表7<
以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。
表8
*)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。
表9
*)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。
表10
>*)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。[實施例24]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，加入作為含重金屬化合物的[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達到10-9M-1M。然後在25℃進行為期21天的搖動培養。
培養完成後，過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到其生長速度。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表11中。[實施例25]實施實施例24的方法，只是在開始培養後的第7天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達到10-3M，再進行14天的培養。培養完成後，實施實施例24的方法。結果示於表11中。[實施例26]實施實施例24的方法，只是在開始培養後的第14天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達到10-3M，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例24的方法。結果示於表11中。[實施例27]實施實施例24的方法，只是在開始培養後的第18天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達到10-3M，再進行3天的培養。培養完成後，實施實施例24的方法。結果示於表11中。[實施例28]實施實施例24的方法，只是從開始培養(第0天)起，以4天的間隔，連續5次加入[Ag(S2O3)2]3-(每次達到2×10-4M的最終濃度，並達到10-3M的總濃度)。所得結果示於表11中。[實施例29]實施實施例24的方法，只是在開始培養後的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(II)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵)，以使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表11中。[實施例30]實施實施例24的方法，只是將燒瓶置於有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然後將瓶子密封，使空氣和氮氣混合，以使補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度達到10％，並且以每分鐘25ml的速度經入口補充該氣體。所得結果示於表11中。[實施例31]實施實施例30的方法，只是在培養的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表11中。[實施例32]
實施實施例24的方法，只是在培養開始時(第0天)加入10-3M的硝酸銀Ag(NO3)，代替[Ag(S2O3)2]3-。所得結果示於表11中。[實施例33]實施實施例32的方法，只是在培養的第14天加入10-3M的硝酸銀Ag(NO3)代替[Ag(S2O3)2]3-。所得結果示於表11中。[比較實施例15]實施實施例24的方法，只是不加[Ag(S2O3)2]3-。所得結果示於表11中。[實施例34]實施實施例24的方法，只是加入氯化鈷(CoCl2)代替[Ag(S2O3)2]3-作為含重金屬的化合物，使最終濃度達到10-9M-1M。所得結果示於表12中。[實施例35]實施實施例34的方法，只是在開始培養後的第7天加入氯化鈷(CoCl2)代替[Ag(S2O3)2]3-，使最終濃度達到10-5M。再進行14天的培養。培養完成後，實施實施例34的方法。結果示於表12中。[實施例36]實施實施例34的方法，只是在開始培養後的第14天加入氯化鈷，使最終濃度達到10-5M。再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例34的方法，結果示於表12中。[實施例37]實施實施例34的方法，只是在開始培養後的第18天加入氯化鈷，使最終濃度達到10-5M。再進行3天的培養。培養完成後，實施實施例34的方法，結果示於表12中。[實施例38]實施實施例34的方法，只是從開始培養(第0天)起，以4天的間隔，連續5次加入氯化鈷(每次達到2×10-6M的最終濃度，並達到10-5M的總濃度)。所得結果示於表12中。[實施例39]實施實施例34的方法，只是在開始培養後的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵)，以使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表12中。[實施例40]實施實施例34的方法，只是將燒瓶置於有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然後將瓶子密封，使空氣和氮氣混合，以使補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度達到10％，並且以每分鐘25ml的速度經入口補充該氣體。所得結果示於表12中。[實施例41]實施實施例40的方法，只是在培養的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表12中。
表11 [b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加計算總產量。]
表12
>[a)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。][b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加計算總產量。][實施例42]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，然後加入作為胺的亞精胺，使其最終濃度達到10-9M-1M。然後在25℃進行為期21天的搖動培養。
培養完成後，經過過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到其生長速度。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表13中。[實施例43]實施實施例42的方法，只是在開始培養後的第7天加入亞精胺，使其最終濃度達到10-5M，再進行14天的培養。培養完成後，實施實施例42的方法。結果示於表13中。[實施例44]實施實施例42的方法，只是在開始培養後的第14天加入亞精胺，使其最終濃度達到10-5M，再進行7天的培養。培養完成後，實施實施例42的方法。結果示於表13中。[實施例45]實施實施例42的方法，只是在開始培養後的第18天加入亞精胺，使其最終濃度達到10-5M，再進行3天的培養。培養完成後，實施實施例42的方法。結果示於表13中。[實施例46]實施實施例42的方法，只是從開始培養(第0天)起，以4天的間隔，連續5次加入亞精胺(每次達到2×10-6M的最終濃度，並達到10-5M的總濃度)。所得結果示於表13中。[實施例47]實施實施例42的方法，只是在開始培養後的第14天加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵)，以使最終濃度達到10- 4M。所得結果示於表13中。[實施例48]實施實施例42的方法，只是將燒瓶置於有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然後將瓶子密封，使空氣和氮氣混合，以使補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度達到10％，並且以每分鐘25ml的速度經入口補充該氣體。所得結果示於表13中。[實施例49]實施實施例48的方法，只是在培養的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表13中。[比較實施例16]實施實施例42的方法，只是不加亞精胺。所得結果示於表13-15中。[實施例50]實施實施例42的方法，只是加入精胺代替亞精胺，使最終濃度達到10-9M-1M。所得結果示於表14中。[實施例51]實施實施例42的方法，只是加入腐胺代替精胺，使最終濃度達到10-9M-1M。所得結果示於表15中。
表13 [b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加計算總產量。]
表14 [b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加，計算總產量。]
表15<
>[a)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。][b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加，計算總產量。][實施例52]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20m1液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在25℃進行為期14天的搖動培養。在培養開始後的第14天加入作為抗乙烯劑的乙醯水楊酸(HOOCC6H4OCOCH3)，使其最終濃度達到10- 9M-1M。再進行7天的培養。
培養完成後，經過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到其生長速度。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表16中。[實施例53]實施實施例52的方法，只是在培養開始時(第0天)加入乙醯水楊酸，使其最終濃度達到10-5M，再進行21天的培養。培養完成後，實施實施例52的方法。結果示於表16中。[實施例54]實施實施例52的方法，只是在開始培養後的第7天加入乙醯水楊酸，使其最終濃度達到10-5M，再進行14天的培養。培養完成後，實施實施例52的方法。結果示於表16中。[實施例55]實施實施例52的方法，只是在開始培養後的第18天加入乙醯水楊酸，使其最終濃度達到10-5M，再進行3天的培養。培養完成後，實施實施例52的方法。結果示於表16中。[實施例56]實施實施例52的方法，只是從開始培養後的第7天開始，以2天的間隔，連續5次加入乙醯水楊酸(每次達到2×10-6M的最終濃度，並達到10-5M的總濃度)。所得結果示於表16中。[實施例57]實施實施例52的方法，只是在開始培養後的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R4和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵)，以使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表16中。[實施例58]實施實施例52的方法，只是將燒瓶置於有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然後將瓶子密封，使空氣和氮氣混合，以使補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度達到10％，並且以每分鐘25ml的速度經入口補充該氣體。所得結果示於表16中。[實施例59]實施實施例58的方法，只是在培養的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達到10-4M。所得結果示於表16中。[比較實施例17]實施實施例52的方法，只是不加乙醯水楊酸。所得結果示於表16中。[參照實施例1]實施實施例52的方法，只是在培養開始時(第0天)加入10-3M的乙烯利(C2H6O3CIP)代替乙醯水楊酸作為抗乙烯劑。所得結果示於表16中。[參照實施例2]實施實施例52的方法，只是在培養開始後的第14天加入10-3M的Ethrel代替乙醯水楊酸。所得結果示於表16中。[實施例60]實施實施例52的方法，只是加入鹽酸氨基羥乙酸[(H2NOCH2COOH)2HCl]作為抗乙烯劑，使最終濃度達到10-9M-1M。所得結果示於表17中。[實施例61]實施實施例52的方法，只是加入五倍子酸丙酯[(HO)3C6H2COOCH2CH2CH3]作為抗乙烯劑，使最終濃度達到10-9M-1M。所得結果示於表18中。
表
>[a)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。][b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加計算總產量。]
表17 [b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加，計算總產量。]
表18
a)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。][b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加，計算總產量。][實施例62]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養細胞接種於含有20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並燒瓶置於有氣體入口和氣體出口的室式容器(容量3000ml)中，然後將室密封，使空氣和氮氣混合，以使補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度達到4-15％，並且以每分鐘25ml的速度經入口補充該氣體，在25℃進行為期21天的搖動培養。
培養完成後，經過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到其生長速度。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表19中。[比較實施例18]實施實施例62的方法，只是將補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度控制在20％。所得結果示於表19中。[參照實施例3]實施實施例62的方法，只是在大氣中對接種於培養瓶中的培養細胞進行培養。所得結果示於表19中。[實施例63]實施實施例62的方法，只是將補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度控制在10％，並從培養開始起補充該混合氣體，共補充3天，然後補充空氣至培養結束(18天)。所得結果示於表19中。[實施例64]實施實施例62的方法，只是將補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度控制在10％，並從培養開始起補充該混合氣體，共補充7天，然後補充空氣至培養結束(14天)。所得結果示於表19中。[實施例65]實施實施例62的方法，只是將補充到所培養細胞中的氣體中氧的濃度控制在10％，並從培養開始起補充該混合氣體，共補充14天，然後補充空氣至培養結束(7天)。所得結果示於表19中。[實施例66]實施實施例62的方法，只是在開始培養後的第14天，加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個雙鍵；其中90％是反式，10％是順式)，以使最終濃度達到1000μM。所得結果示於表20中。通過將補充低濃度氧與添加茉莉酮酸甲酯相結合，可以顯著提高紫杉烷類雙萜的生產率。[實施例67]將85克(鮮重)由實施例62的方法得到的加快生長速度的培養細胞接種於用於攪拌罐培養的罐(容量3000ml)中，該罐具有一個用於測定溶解氧濃度的電極和溶解氧濃度控制器，在該罐中已經倒入了1700ml液體木本植物培養基。然後在25℃進行為期21天的攪拌罐培養，同時通過調節空氣與氮氣的混合比例，將培養基中溶解氧的濃度控制在0.1ppm或者更低。培養裝置的圖解示於圖3中，所得結果示於表21中。[實施例68]實施實施例67的方法，只是通過調節混合比例，將溶解氧的濃度控制在1ppm或者更低。所得結果示於表21中。[實施例69]實施實施例67的方法，只是通過調節混合比例，將溶解氧的濃度控制在2ppm或者更低。所得結果示於表21中。[實施例70]實施實施例67的方法，只是通過調節混合比例，將溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低。所得結果示於表21中。[實施例71]實施實施例67的方法，只是通過調節混合比例，將溶解氧的濃度控制在6ppm或者更低。所得結果示於表21中。[比較實施例19]實施實施例67的方法，只是補充空氣。所得結果示於表21中。[實施例72]實施實施例67的方法，只是從培養開始起，通過調節混合比例，將培養基中溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低，共控制3天，然後補充空氣至培養結束(18天)。所得結果示於表21中。[實施例73]實施實施例67的方法，只是從培養開始起，通過調節混合比例，將培養基中溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低，共控制7天，然後補充空氣至培養結束(14天)。所得結果示於表21中。[實施例74]實施實施例67的方法，只是從培養開始起，通過調節混合比例，將培養基中溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低，共控制14天，然後補充空氣至培養結束(7天)。所得結果示於表21中。
表19 [b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加計算總產量。][c)該值表示在補充混合氣體期間室式容器中的最大氣相氧濃度。]
表20
a)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。][b)通過將漿果赤黴素III的產量、cephalomannine的產量和紫杉醇的產量相加，計算總產量。][c)括號中的數字表示在25℃下在比較實施例和各個實施例中最大溶解氧的濃度相對於飽和溶解氧濃度(8ppm)的比例(％)。][d)該值表示在補充混合氣體期間培養基中的最大溶解氧濃度。][e)括號在數字表示在25℃、在補充混合氣體期間各個實施例中最大溶解氧的濃度相對於飽和溶解氧濃度(8ppm)的比例(％)。][實施例75]將預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置於已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、於黑暗處進行靜態培養，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入上述成分以達到同樣的濃度)的錐瓶中，並在旋轉搖動器上進行搖動培養(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進行傳代培養，以加快其生長速度。
首先用不鏽鋼篩對將1克(鮮重)如此得到的培養細胞進行篩分，得到粒度為250-840μM的細胞簇。用Ficoll製備比重為1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的密度梯度，將上述細胞鋪於其上，並以700rpm的轉速離心6分鐘。細胞按其比重不同分配在各層中。分出每層中所含的細胞，使其不彼此混合，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌後，將約0.1克(鮮重)細胞轉入內徑為18mm、含0.8ml液體木本植物培養基的培養井中，並在25℃搖動培養21天。培養21天後，將全部細胞轉入內徑為36mm、含3ml上述液體培養基的培養井中，再於25℃繼續搖動培養28天。
培養完成後，經過濾和冷凍乾燥收集歐洲紫杉的培養細胞，然後稱量乾重，得到其在每升液體培養基中的生長量。用甲醇等從乾燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過採用高效液相色譜法與標準的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤黴素III比較對其進行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產量。所得結果示於表22、圖4和圖5中。[比較實施例20]實施實施例75的方法，只是在用不鏽鋼篩分離細胞簇後，不按密度梯度進行分配。所得結果示於表22、圖4和圖5中。[實施例76]實施實施例75的方法，只是使用具有相同母體植物、但在不同階段形成愈傷組織的培養細胞。條件是在一組中，收集比重為1.07或更高的層中所含的細胞，並進行培養。所得結果示於表22中。[比較實施例21]實施實施例76的方法，只是在用不鏽鋼篩分離細胞簇後，不按密度梯度進行分配。所得結果示於表22中。
表22
>[*)用總產量(細胞中+培養基中)除以細胞產量，計算含量。][參照實施例4]將約0.2克(鮮重)實施例75中得到的、分配於比重為1.03或更低(表22)的層中之後進行培養的細胞接種於內徑為36mm、含3ml液體木本植物培養基的培養井中，再於25℃搖動培養28天。培養完成後，細胞再依比重為1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的密度梯度進行分配。一經密度梯度分配後，立即收集細胞，並且測定分配細胞的分布及紫杉烷類雙萜的含量。所得結
>[*)用細胞中的產量除以細胞產量，計算含量。][實施例77]將1克(鮮重)實施例1中所用的相同培養細胞接種於含20ml液體(其中含10-5M-10-2M過硫酸鉀)的錐瓶中，並在25℃進行為期21天的第一階段培養。
培養完成後，經過濾收集培養細胞，一部分細胞用作第二階段培養的細胞，對剩餘的細胞進行細胞產量和細胞中紫杉烷含量的測定。因此，將1克(鮮重)的培養細胞接種於含20ml液體木本植物培養基(向其中加入萘乙酸使濃度達到10-5M)的錐瓶中，在25℃進行為期14天的搖動培養。在培養的第14天，向培養基中加入茉莉酮酸甲酯，使其在培養基中的濃度達到100μM，再繼續培養7天。另一方面，將第一階段培養中所得的剩餘細胞凍幹，然後測量乾重，以得到其在每升液體培養基中的細胞產量。通過高效液相色譜法測定幹細胞中紫杉醇的含量。通過與對第一階段培養中所得細胞進行測定的同樣方式，測定第二階段培養中所得細胞的細胞產量和紫杉醇產量。所得結果示於表24中。[比較實施例22]實施實施例77的方法，只是不使用過硫酸鉀。所得結果示於表24中。
表24 將100克(鮮重)實施例1中所用的相同培養細胞接種於裝有1升標準液體木本植物培養基(蔗糖濃度20g/l，硝酸根離子濃度14.7mM，α-萘乙酸10-5M)(其中加有2mM[Ag(S2O3)2]-3)、用於攪拌罐培養的罐(容量2升；圖8)中，以40rpm的攪拌速度在25℃、於黑暗中開始培養，同時以每分鐘0.1升的速度通入空氣，從培養的第2天開始至第14天連續補充含20g/l蔗糖和20mM硝酸鈉的培養基，使得1天加入的蔗糖量為2g/l，1天加入的硝酸根離子的量為2mmol/l，並且通過排出口(這不同於營養源供入口，而且其上連有一個100目的不鏽鋼過濾器)連續取出培養溶液，該取出速度與加入營養源溶液的速度(培養瓶中，培養基的更新比例為每天10％)相同，以此進行為期21天的攪拌罐培養。培養完成後，收集培養細胞和培養基，按與所述實施例1中所用相同的方法測定紫杉醇的產量。所得結果示於表25中。[比較實施例23]實施實施例78的方法，只是中途不加入營養源。所得結果示於表25中。
表25
實施例79]將約50克(鮮重)實施例1中所用的相同培養細胞和1升液體木本植物培養基轉入培養罐(容量2升)中，以40rpm的攪拌速度和每分鐘0.1升的通氣速度在25℃、於黑暗中進行為期14天的培養。在開始培養後的第14天測量的沉澱細胞體積(PCV)為0.2升。從第14天開始，補充新鮮的培養基(其中在與初始培養基具有同樣組成的培養基中加入了[Ag(S2O3)2]-3)、並取出不含細胞的培養溶液。新鮮培養基每天的補充量為在同一時間PCV的2/5，而不含細胞的培養溶液的取出量則控制在1升。在培養開始後的第35天，PCV達到0.6升。此後，通過每天一次取出含細胞的培養溶液，以保持平均PCV為0.6升，並且通過取出不含細胞的培養溶液，保持培養溶液的量為1升，從而保持平穩狀態。在培養開始後進行為期90天的培養。在60天的平穩期內補充的新鮮培養基的量為15升，從培養罐中取出的培養基的量為14天，得到的細胞量為0.15kg(乾重)，特定生長速度μ為0.08(天-1)，平均培養基更新比例為2.88。在平穩期從培養罐中取出的細胞和培養基的分析結果表明產生了525mg紫杉酚。這相當於8.8mg/升/天的生產率。
按與實施例1中所用相同的方法測定細胞和培養基中紫杉醇的含量。[實施例80]將50克(鮮重)實施例1中所用的相同培養細胞和1升液體木本植物培養基轉入培養罐(容量2升)中，以40rpm的攪拌速度在25℃、於黑暗中進行為期14天的培養，同時以每分鐘0.1升的速度通入加有2％二氧化碳的空氣。培養完成後，收集細胞和培養基，得到15.2克乾燥的細胞。按與實施例1中所用相同的方法測定細胞和培養基中紫杉醇的含量，結果表明產生了31克紫杉醇。[比較實施例24]實施實施例1的方法，只是加入茉莉酮代替methyl tuberonate，以使最終濃度達到0.01-1000μM。所得結果示於表26中。[比較實施例25]實施比較實施例24的方法，只是不加茉莉酮。所得結果示於表26中。
表26
>[*)以總產量(細胞中+培養基中)為基礎計算產量。]工業實用性本發明可以工業化生產紫杉烷類雙萜，包括適於用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治療劑的紫杉醇。
權利要求
1.獲得紫杉烷類雙萜的高生產性培養細胞的方法，其中按照其比重差異將產生紫杉烷類雙萜的植物培養細胞分配於多層中，並且對至少一層中所含的細胞進行培養，然後從這些培養細胞中選擇出紫杉烷類雙萜的高生產性培養細胞。
2.按照權利要求1的方法，其中產生紫杉烷類雙萜的植物是紫杉屬植物。
3.按照權利要求1的方法，其中對在比重為1.07或者更低的層中所含的細胞進行培養。
全文摘要
本發明公開了一種獲得紫杉烷類雙萜的高生產性培養細胞的方法,其中按照其比重差異將產生紫杉烷類雙萜的植物培養細胞分配於多層中,並且對至少一層中所含的細胞進行培養,然後從這些培養細胞中選擇出紫杉烷類雙萜的高生產性培養細胞。
文檔編號C12N5/00GK1251391SQ9911015
公開日2000年4月26日 申請日期1999年6月30日 優先權日1993年11月15日
發明者行宗敬人, 大西直一, 原康弘, 多葉田譽, 東庸介, 菅忠三, 松原浩一 申請人:三井化學株式會社