作為臨床標記的dmbt1及其用途的製作方法

2023-06-11 19:42:01

專利名稱：作為臨床標記的dmbt1及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於鑑定及監測具有雌激素或孕激素作用化合物的方法、組合物和化合物。在目前的方法裡，用抑癌候選基因DMBT1(惡性腦腫瘤1中刪除的基因(deleted in malignant brain tumors 1))的調控和編碼序列來確定化合物的雌激素和孕激素的活性。
背景技術：
激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)代表了預防醫學較重要的一個領域，對個人及公共健康有很大的影響。由於許多原因使用了激素替代療法，包括對絕經、部分或全部子宮切除和閉經的治療。絕經後，常給予雌激素作為激素替代療法來治療或預防臨床適應症例如輕度到嚴重的血管疏縮性症狀(vasomotorsymptoms)和外陰陰道萎縮症(vulvovaginal atrophy)、骨質疏鬆症，並且正試驗於阿耳茨海默症(Alzheimer’s disease)和結腸癌。在一些無月經(amenorrhoeic)的情況下，可給予雌激素來恢復月經。
雖然使用雌激素的HRT已有許多對健康有益的證明，但也伴隨一些副作用。這些作用包括增加患子宮癌和乳腺癌、乳房脹痛及子宮出血的風險。結合療法(Co-adminstrative therapies)已被用來減少這種副作用。例如在HRT期間為了抵消增加的患子宮內膜癌的風險，黃體酮常與雌激素聯合給藥。遺憾的是，用這種聯合治療的方法可出現其他的併發症。例如，通常不認為黃體酮治療適合無子宮的婦女，並且最近的研究表明在雌激素和黃體酮HRT用藥情況下患癌症和中風的危險增加。
HRT領域較新的進展包括使用被稱作選擇性雌激素受體調節劑(Selective Estrogen Receptor Modulators，SERMs)的化合物作為HRT中雌激素的替代物。SERMs是可提供雌激素的有益作用而避免其他副作用的藥物。例如，SERM可在骨組織提供所需的雌激素激動劑(agonist)活性而在子宮組織提供拮抗劑(antagonist)活性。目前臨床上有效的有兩種SERM。SERM他莫昔芬(tamoxifen)用於預防和治療乳腺癌，SERM雷洛昔芬(raloxifene)用於預防和治療骨質疏鬆。這些藥物及其它的SERM特異結合併影響雌激素受體的活性。
另外一類可用於HRT方案的化合物包括孕酮受體調控劑(Progesterone Receptor Modulators，PRM)，例如其包括米非司酮(mifepristone)和奧那司酮(onapristone)。PRM已被考慮作為雌激素替代療法的附加劑並且也用於單獨治療。PRM是特異結合孕酮受體並調控該受體活性的化合物，從而影響細胞的活性。PRM的一個重要性質是其抗增殖作用。例如，在月經周期的卵泡期給予PRM可抑制子宮內膜的增殖活性。PRM有許多潛在的用途，包括治療子宮內膜異位、子宮平滑肌瘤、避孕和激素替代療法。
儘管HRT研究有進展，仍很需要新的SERM和PRM。鑑定和使用新的SERM和PRM可提供更適合特定病症或預防治療的療法。這些化合物有可能提供雌激素替代療法的益處而無伴隨目前療法的危險和副作用。例如，新的SERM也許能促進靶組織例如骨和神經組織中的活性同時非靶組織如子宮內膜組織和乳房組織不受影響。
此外，用來鑑定新的SERM和PRM迫切需要新的組合物和方法。這些組合物和方法也可能對臨床檢測已知或實驗性SERM和PRM的活性有價值。更好的是，這些方法將易於快速和準確的測定那些SERM和PRM化合物。
很清楚，用來測定雌激素或孕激素(分別如SERM和PRM證明)活性的標記物會是一個對本技術領域頗有價值的貢獻。這種標記物會對用於激素替代療法的新化合物的開發有利。
發明概述如本文所述，本發明提供了用於鑑定或篩選具有雌激素活性化合物的化合物、組合物和方法。本發明的一個基礎是發現了具有雌激素活性的化合物能上調DMBT1基因的表達。因此一方面本發明提供了一種用於鑑定具有雌激素活性的待測化合物的方法。該方法包括步驟(a)用待測化合物接觸雌激素應答系統(estrogen-responsivesystem)；(b)從雌激素應答系統獲得關於由DMBT1調控序列控制的基因表達信息；和(c)用來自步驟(b)的信息確定待測化合物是否具有雌激素活性。在一些情況下，基因的表達是與對照比較來測量的，並且基因表達量的增加與具有雌激素活性的待測化合物相關。
用來測量基因表達的雌激素應答系統可以是動物、部分動物體例如雌激素應答組織或細胞。由DMBT1調控序列控制的基因可以是DMBT1本身或是可操作性連接到DMBT1調控序列的異源基因。
另一方面，本發明提供了一種方法以確定待測化合物是否具有選擇性雌激素活性。在這個方法中兩種不同的雌激素應答系統接觸相同待測化合物，由每個系統測量DMBT1調控序列控制的基因表達。如果一個雌激素應答系統表現出基因表達提高而另一應答系統表現為表達降低或無表達，則此待測化合物具有選擇性雌激素活性。
再一方面，選擇性雌激素活性的測定可通過接觸兩種不同的雌激素應答系統，並在一個系統中測量DMBT1調控序列控制的基因表達而在另一個系統中測量雌激素活性另一不同標記(例如組織生長)來實現。如果一個雌激素應答系統表現為如基因表達無增加而另一個表現為如陽性反應(例如組織生長)，那麼待測化合物就具有選擇性雌激素活性。
又一方面，本發明提供了測定化合物的孕激素或抗孕激素活性的方法。在這個方法中使雌激素及孕酮應答系統(estrogen-andprogesterone-responsive system)與雌激素化合物接觸，也與待測化合物接觸。從已經接觸了雌激素和待測化合物的系統測量DMBT1調控序列控制下的基因表達。從基因表達測量得到的信息可與標樣比較並用來確定待測化合物是否具有孕激素活性或抗孕激素活性。
在其他方面，本發明提供了一種監測受試者雌激素和孕激素活性的方法。該方法的步驟包括處理受試者、從處理後的受試者獲得關於DMBT1表達的信息和用表達信息測定雌激素或孕激素活性。
還有一方面，本發明提供了一個雌激素應答系統，其包含的核酸具有可操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列。雌激素應答系統可以是含有外源核酸一個細胞，例如含有質粒，其序列包含可操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列。細胞典型表達的功能性雌激素受體可以進行內源性或外源性表達。在相關方面，本發明也提供了一個雌激素及孕酮應答系統，其包含的核酸具有可操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列。該系統細胞同時典型表達功能性雌激素受體和功能性孕酮受體。
又一方面本發明提供分離的異源核酸序列，其包含部分可操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列。具體的，有效的分離異源核酸具有可操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列，該序列至少包含SEQ ID NO.1的核苷酸840-872。這些核酸可使得受體基因應答雌激素信號從而產生增量調節。其它有效的分離異源核酸包含的可操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列由SEQ ID NO11-2259全部或部分核苷酸或其變異體組成。
附圖簡述

圖1，雌酮、SERM和雌激素拮抗劑對大鼠子宮重量的影響(E雌酮；T他莫昔芬；R雷洛昔芬；和IICI182780)。
圖2，雌酮、SERM和雌激素拮抗劑對大鼠子宮中DMBT1表達的影響。
圖3，雌酮與SERM、雌激素拮抗劑同時給藥對大鼠子宮中DMBT1表達的影響。
圖3B，增加雌激素或黃體酮濃度(MPA)對大鼠子宮中DMBT1表達的影響。
圖4，雌酮和SERM對大鼠子宮重量的影響(E雌酮；5RA-DCC5R-芳基-5，11-二氫-苯並吡喃並(4，3-c)苯並吡喃；和5SA-DCC5S-芳基-5，11-二氫-苯並吡喃並(4，3-c)苯並吡喃)。
圖5，雌酮和SERM對大鼠子宮中DMBT1表達的影響。
圖6，雌激素對DMBT1/螢光素酶報告構建體(luciferase reporterconstructs)的誘導作用。分析的報告構建體是pDMBT1-1/lucDMBT1-1347至+41的啟動子區域(向上指的三角)；pDMBT1-2(向下指的三角)/lucDMBT1-2921至+41的啟動子區域；oligo(實心菱形)(pDMBT1-3/luc)pDMBT1-2766至-2734的啟動子區域；pGL3(空心方形)pGL3basic(對照)；pERE-luc(實心橢圓)雞卵黃蛋白ERE序列(chicken vitellogenin ERE sequence)；和pTA(實心方形)；pTAbasic(對照)。
圖7，DMBT1 mRNA在雌激素和不同PRM處理過的OVX猴子宮內膜中的表達。(E2雌酮；Mif米非司酮；17N11-DE17β-N-取代-11β-二甲氨基苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮；17β-N-取代-11β-哌啶苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮17N11-PE)結果以平均值+/-標準差提供。大多數實驗組的猴為n＝3。*指n＝1的組，**指n＝2的組。
發明詳述除非另外限定，這裡所用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同。與這裡所述的那些基本相似或等同的任何方法、設備和材料都可用於實踐或實驗本發明。
這裡公開的所有公布和專利僅供公開之用。本文所有內容不能解釋為一種許可，即發明者無權提早任何公布和/或發明日期，包括這裡引用的任何公布和/或發明。
在本發明中常用的確定術語具有以下列出的含義。這些術語還可在詳述中做更詳細的解釋。
如這裡用的術語「包含」、「含有」和「包括」是用其公開的、非限制含義。
「雌激素活性」是指對生物系統產生一種或更多的類似雌激素作用的能力。「雌激素」是指天然的雌激素(包括但不僅限於雌二醇、雌酮和雌三醇)，以及合成的雌激素(包括但不僅限於乙炔雌二醇(ethinyl estradiol)、己烯雌酚(diethylstilbesterol)和美雌醇(mestranol))。雌激素的這種作用是特有的，稱為「雌激素激動劑活性」(estrogen agonist activity)。具有雌激素活性的化合物模擬至少一種雌激素的作用，並且通常是通過結合雌激素受體以起始產生這種作用。不言而喻在一個複雜生物體例如哺乳動物體內，雌激素對不同的類型組織均有活性，因此對一種組織的任一種特定雌激素活性都可被稱為雌激素活性。被稱為SERM的化合物具有典型的雌激素活性。
「雌激素作用」(estrogenic effect)是指當雌激素與其受體結合時細胞、組織或生物體中出現的應答反應。雌激素作用的例子包括雌激素受體獨立轉移至胞核；誘導雌激素應答基因包括DMBT1的表達；提高一氧化氮產量；細胞增殖，包括如乳腺上皮細胞和子宮內膜細胞的增殖；細胞分化和生長，包括如提高神經的生長和分化；組織生長和子宮內膜組織的生長；骨礦物質密度的增加；血液成分的改變包括高密度脂蛋白(HDL)膽固醇和甘油三脂的增加、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的降低以及凝固性增強；和炎症的增加。
「雌激素應答系統」用作廣義是指在如對雌激素的應答時基因表達開始變化或者蛋白磷酸化作用改變的細胞群。這裡所用的「雌激素應答系統」是指單細胞、細胞群並因而指組織、器官或甚至是複雜的多細胞有機體，例如可對雌激素產生應答並可在其中試驗雌激素應答作用的動物。
「選擇性雌激素應答」的證明是當化合物對兩個不同的雌激素應答系統或一個雌激素應答系統的兩個不同部分有不同的活性。促進選擇性雌激素應答的化合物通常稱為SERMs，這裡提供了其一些例子。但是其它非通常稱為SERMs但也可表現雌激素活性的化合物也可能促進選擇性雌激素應答。
「抗雌激素活性」(Anti-estrogenic activity)是指能產生與雌激素引起的作用相反的作用和/或產生的作用能阻遏(減少)雌激素導致的作用。有「抗雌激素活性」的化合物包括如1)降低基因表達或減弱組織生長的化合物，而通常雌激素提高該基因的表達或提高該組織的生長；2)提高基因表達或增加組織生長，而通常雌激素降低該基因表達或減弱該組織生長；或3)當伴隨雌激素給藥時降低雌激素應答量的化合物。許多已知的稱為「雌激素拮抗劑」的化合物具有「抗雌激素活性」。
「孕激素活性」(Progestogenic activity)是指對生物系統有一種或更多類似由孕酮引起的作用。這裡所用的孕酮是指孕酮及其合成的類似物(黃體酮，progestins)。孕酮的這種作用是典型的「孕酮激動劑活性」(progesterone agonist activity)。具有孕酮活性的化合物模擬至少一種孕酮的作用，並且通常通過結合孕酮受體以起始產生這種作用。在一個複雜生物體內例如動物，優選哺乳動物體內，孕酮對不同類型的組織具有作用，因而任一種特定對一種組織孕酮作用都可被指為孕酮活性。
「抗孕激素活性」(Anti-progestogenic activity)指能產生與孕酮導致的作用相反的作用和/或產生的作用能阻遏(減少)孕酮導致的作用。通常具有抗孕酮活性的化合物可與孕酮受體結合併改變其活性。一些抗孕激素化合物或處理也能減少對一個系統的雌激素作用。例如，一些抗孕激素化合物可結合至孕酮受體並減弱由雌激素引起的基因表達或組織生長。許多已知的稱為「孕酮拮抗劑」的化合物能阻礙具有孕酮活性的化合物的作用，並具有抗孕激素的活性。
被稱為「孕酮受體調控劑」(progesterone receptor modulators，PRM)的化合物能結合孕酮受體並改變其活性。在一些情況下PRM可調整雌激素和孕激素化合物對生物系統的作用。一些PRM可具有抗孕激素活性，例如孕酮拮抗活性。
這裡「孕酮應答系統」(Progesterone-responsive system)用其廣義，指一個細胞群在如應答孕酮時起始改變基因表達或蛋白質磷酸化作用。這裡「孕酮應答系統」指單個細胞、細胞群因此指組織、器官甚至複雜多細胞生物體，例如可應答雌激素並可在其中試驗孕酮應答作用的動物體。
「雌激素和孕酮應答系統」用其廣義，指一個細胞群在如應答雌激素和孕酮時起始改變基因表達或蛋白質磷酸化作用。這裡「雌激素和孕酮應答系統」指單個細胞、細胞群因此指組織、器官甚至複雜多細胞生物體，例如可應答雌激素和孕酮並可在其中試驗雌激素和孕酮應答作用的動物體。
「DMBT1基因」是指(1)編碼的蛋白與人DMBT1蛋白有約高於60、65、70、75、80、85、90或95％的同一性(Mollenhauer et al.(1997)Nat.Genet.1732-39；GenBank protein accession NoNP_015568.1)；(2)編碼的蛋白能與源自抗DMBT1蛋白的抗體如多克隆或單克隆抗體結合，如這裡所述的人DMBT1蛋白；(3)能在嚴格雜交條件下與特定核酸特異性雜交，該核酸與人DMBT1cDNA(GenBank nucleotide accession NoNM_007329.1)有高於60、65、70、75、80、85、90或95％的同一性；或者(4)能通過特定引物進行擴增，該引物能在高嚴格條件下與DMBT1 cDNA如上述人DMBT1 cDNA進行特異性雜交。嚴格雜交條件為本領域熟知。(如參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989))「DMBT1」基因包括已鑑定的人(GenBank檢索號NM_017579和AJ243212)、大鼠(GenBank檢索號U32681，86％核苷酸與人的同一)、小鼠(GenBank號U37438，89％核苷酸與人的同一)、母牛(BF600097，87％同一性)和其它動物的DMBT1直系同源基因(ortholog)。該基因也被稱為糖蛋白(glycoprotein(GP))340、CRP-ductin、hensin和ebnerin。
「DMBT1調控序列」指在應答雌激素信號時DMBT1基因中能調控DMBT1(或者DMBT1直系同源基因)的開放閱讀框的核酸序列。在DMBT1調控序列方面，人DMBT1基因5′區域的一個3715bp序列可見SEQ ID NO1(EMBL檢索號No.AJ271916)，並列於表2。這裡提到的DMBT1 5′調控區域的核苷位置是相對於DMBT1起始密碼子(+1)並根據表2中SEQ ID NO1的核苷標號方式表示的。DMBT1調控序列的例子將在下文討論。
如本文所用，本發明的「變異體」核酸分子是一個與相應野生型核酸分子至少有80％，優選至少約90％更優選至少約95％，但低於100％同源性或同一性的連續核酸分子。變異核酸包含相應野生型核酸分子中沒有的核苷酸鹼基，例如相對於相應野生型多核苷酸分子發生的5′、3′或內部的刪除或添加。本發明的變異多核苷酸是在應答雌激素信號時能啟動DMBT1表達的DMBT1調控序列。
「外源」指多核苷酸或多肽不是在宿主細胞中天然存在或不是由宿主細胞產生。
當然本文所用的術語並不是為了限制本發明的範圍。需要指出的是在這裡和附加的權利要求書中，如果沒有在上下文中另外明確表示，單數形式(「一」和「該」)均包括其相應物的複數形式。因此如″一個細胞″的提法可指一個或多個細胞，或本領域技術人員已知的它們的等價物等。
總體上，本發明提供了可有效鑑別和/或監測具有或能啟動雌激素活性的化合物或處理方案的方法、組合物和化合物。本發明至少部分基於以下發現，即具有雌激素活性的化合物能增量調控在DMBT1調控序列控制下的基因表達，例如它控制的DMBT1基因或報告基因。在一個相關實施方案中，本發明可用於分別鑑別如下化合物，即不能增量或減量調控在DMBT1調控序列控制下的基因表達，因而不具有雌激素活性，或者具有抗雌激素活性。
另一方面，本發明提供了可有效鑑別和/或監測具有或能啟動孕激素活性或抗孕激素活性的化合物或處理方案的方法、組合物和化合物。本發明證明當將具有孕激素或抗孕激素活性的化合物與雌激素化合物伴隨給藥時，能夠在某種雌激素和孕酮應答系統中減弱雌激素介導的在DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用。例如一種具有孕激素活性的化合物能在大鼠子宮內減弱雌激素介導的在DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用；而一種具有抗孕激素活性的化合物能在猴子宮內減弱雌激素介導的在DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用。
本發明進一步提供了雌激素應答系統，它包含的DMBT1調控序列可有效鑑別或監測被懷疑具有雌激素或抗雌激素活性的化合物。本發明提供了雌激素和孕酮應答系統，它包含的DMBT1調控序列，可有效鑑別或監測被懷疑具有孕激素或抗孕激素活性的化合物。
也提供了分離的核酸，含有可操作性連接到一個報告基因的DMT1調控序列。該DMT1調控序列在應答雌激素信號時能增量調控該報告基因的表達。
DMT1是一個結構複雜的蛋白，其功能也顯得同樣複雜。已有的工作表明它涉及到黏膜保護和上皮分化。這些功能已經在不同種生物和不同組織中被詳細說明。例如在肺中DMBT1的表達伴隨著免疫應答(Holmskov et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1999，9610794-10799；Madsen et al，2003，Eur J Immunol.332327-2336；Bikker et al，2002，J Biol Chem 27732109-32115；Prakobphol et al，2000，J BiolChem.27539860-39866)；而在肝臟、腎臟和腸中其表達伴隨著細胞分化(Bisgaard et al，2002 Am J Pathol.1611187-1198；Vijayakumaret al.，1999，J Cell Biol.1441057-1067；Cheng et al，1996，AnatRecord 244327-343)。尚不清楚這兩種功能是否在同一組織中共存。本發明證明在子宮上皮中DMBT1的表達受到雌激素的控制，這個位置有進行中的細胞增殖和分化循環，並且具有黏膜分泌中刺激免疫活性過程中的重要角色。
本發明證明DMBT1的表達在猴子宮內膜細胞和大鼠子宮上皮細胞中受到雌激素的強增量調控(圖7和圖2)。在對大鼠進行雌激素處理一天後，體內DMBT1基因表達的誘導快速發生(圖3B)。在猴子宮內雌激素對DMBT1表達的誘導作用被米非司酮，一種黃體酮拮抗劑所抑制(圖7)。米非司酮在由雌激素支配的猴或大鼠子宮內抑制細胞增殖的活力與前述性質有關(Wolf et al.，1989，FertilSteril.521055 1060；Slayden et al，1993，Endocrinology 1321845 1856；Chwalisz et al，2000，Steroids 65741-751)。此外在大鼠子宮內雌激素對DMBT1表達的誘導作用被一種黃體酮劑量依賴性抑制。進一步，黃體酮的抗雌激素作用被與黃體酮拮抗劑共處理大鼠所逆轉(圖3B)。這些特性被通過其它雌激素依賴的標記基因而觀察到，例如那些用於補體成分3的基因(Lundeen et al.，2001，J Steroid BiochemMol Biol.78137-143)。在大鼠子宮內雌激素對DMBT1表達的誘導作用也被與ICI 182，780，一種雌激素拮抗劑共處理大鼠所抑制(圖3A)。
此外他莫昔芬(tamoxifen)，一種在子宮中增加上皮厚度的SERM(Nephew et al，2000，Proc Soc Exp Biol Med.223288-294)，也被視為在該組織中的雌激素拮抗劑，能在大鼠子宮內強烈激發DMBT1表達(圖2)，尤其是在子宮上皮細胞中(數據未顯示)。雷洛昔芬是一種大鼠子宮雌激素拮抗劑，但與他莫昔芬相反，它本身沒有對子宮上皮的強激發作用(Buelke-Sam et al.，1998，ReprodToxicol.12217-221；Fig.1)。
使用免疫組織化學方法，本發明證明DMBT1的表達僅限於大鼠子宮上皮細胞(數據未顯示)。這個發現與其它發現有關，即DMBT1被限制在不同組織的上皮細胞內(Holmskov et al，supra；Mollenhauer，2000，Cancer Res.601704-1710；Bisgaard et al，supra；Vijayakumar etal.，supra；Cheng et al supra；Mollenhauer et al.，2002，Cancer DetPrev.26266-274)。
本發明證明了DMBT1對鑑別具有雌激素活性、抗雌激素活性、孕酮活性或抗孕酮活性的化合物的有效性。
Ace和Okulicz(Ace et al.，1998，J Clin Endocrinol Metab.833569-3573)報導在未受損猴月經循環的孕酮支配期內，DMBT1表達受增量調控，而在雌激素支配期內在子宮內膜中只有很少或沒有可檢測的表達。他們通過原位雜交分析進一步表明DMBT1基因表達被限制在子宮內膜基質內。近來這個工作小組又發表了一篇新論文，表明猴DMBT1表達在孕酮支配期內降低(Ace and Okulicz，2004，Reprod Biol Endocrinol.254 http://www.rbej.com/content/2/1/54)。
在一個實施方案中，本發明提供了一種鑑別和/或篩選至少具有一種雌激素活性的化合物的方法。該方法步驟包括(a)使一種待測化合物與一種雌激素應答系統接觸；(b)在該雌激素應答系統中通過操作性連接在DMBT1調控序列上的基因，來檢測基因表達情況並以此作為雌激素活性的量度。
在某個實施方案中，步驟(b)可包括測量相對於對照的該基因表達，並進一步相對未用待測化合物的方法來鑑別待測化合物改變基因表達水平的結果。
在另一具體實施方案中，可獲得DMBT1調控序列控制的基因表達信息以確定待測化合物是不表現雌激素活性還是表現抗雌激素活性。為了這個目的，步驟(b)可進一步包括，將應答待測化合物時無可檢測的基因表達提高或基因表達的降低現象分別與無可檢測雌激素活性或具有抗雌激素活性聯繫起來。這個方法對鑑別具有選擇性雌激素活性的化合物(SERMs)尤其有效。例如，前文論述過的表現雌激素活性(如激發骨狀組織)的化合物可在另一不同雌激素應答系統中(例如子宮內膜組織或乳腺組織，或源自這些組織的組織)被檢驗以確定DMBT1調控序列控制下的基因表達是沒有變化還是在應答該待測化合物時受到減量調控。使用這些方法可能會鑑別出對特定組織具有雌激素活性的SERMs。下文將提供鑑別具有選擇性雌激素活性的化合物的其它方法。
如上文所示，本方法所用的雌激素應答系統可以是一個細胞、細胞群包括組織，和能應答雌激素的複雜生物體。如此處定義，典型的雌激素應答系統包含的細胞含有雌激素受體，以使細胞能夠應答雌激素。當一個雌激素受體的配體(如一個雌激素化合物)結合到該雌激素受體時，可起始一個細胞信號。這個信號可影響DMBT1調控序列從而導致連接於其上的基因受到增量調控。因此雌激素應答系統包含的細胞含有操作性連接到DMBT1調控序列上的基因。檢測該連接基因表達的方法是通過測量該特定基因的一種功能。當該基因是DMBT1時，可監測到雌激素作用。當該基因是報告基因時，細胞優選包含重組構建體，它含有操作性連接到DMBT1調控序列上的報告基因。另一選擇是這些細胞在內源性DMBT1調控序列控制下內源性表達DMBT1。下文將討論報告基因的例子和檢測內源性DMBT1基因表達變化的方法。在雌激素應答系統中，結合到雌激素受體上的待測化合物可能對DMBT1調控序列控制的基因表達產生增量或減量調控，或者無作用。
這裡定義的「雌激素受體」指任何可結合到雌激素並且這種結合可提高或降低雌激素信號途徑的活力的蛋白。優選的，一個雌激素受體是能結合雌激素的核受體基因家族中一個成員的產物，並且(1)它含有一個胺基酸序列，該序列與人雌激素受體1(α)(Greene et al.(1986)Science 2311150-4；GenBank蛋白檢索號NoNP_000116)或者人雌激素受體2(β)(Mosselman et al.(1996)FEBS Lett 39249-53；GenBank蛋白檢索號NoNP_001428)有高於約60％、65、70、75、80、85、90或95％的胺基酸序列同一性；或者(2)它能與源自抗雌激素受體的抗體如多克隆或單克隆抗體結合，例如這裡所述的人雌激素受體1或2。
這裡所用的雌激素受體包括人源受體和下文所述的來自非人哺乳動物的受體。這裡提到的人源雌激素受體包括所述的α和β異構體，和其它任何另外的本領域技術人員認識的異構體。這裡定義的「功能性雌激素受體」是一種能夠在轉錄水平調控基因表達的雌激素受體。
在一個具體實施方案中雌激素應答系統是一種動物。動物包括天然動物和遺傳修飾(轉基因)的動物。動物可以是人類動物如人，或者一種獸醫學動物。獸醫學動物包括(但不限於)任何種類的非人動物，例如家庭動物如狗和貓；牲畜如母牛、綿羊和豬；實驗室動物如小鼠、大鼠、猴、兔和豚鼠；和水生動物如魚和海龜。
轉基因動物也可用於本發明的方法。可使用以前構建的轉基因動物，或選擇構建可有助於本發明轉基因動物。可通過轉基因到一個動物體內構建有效的轉基因動物。其方法在相關領域已被認識，並可在如Pinkert，C.A.(Ed.)Transgenic Animal TechnologyALaboratory Handbook，2nd edition，Academic Press(2003)中找到。有用的表型改變可通過提供轉基因來產生，這包括改變雌激素或患提速受體的表達，或者由提供雌激素和/或孕酮受體變異體引起的變化。其它有效的轉基因提供了操作性連接到一個目的核酸序列上的DMBT1調控序列。將調控區域「操作性連接」到一個核酸序列上，如果它能夠控制該序列的轉錄。能夠操作性連接到DMBT1調控區域上的基因包括如這裡所需的可檢測序列和報告基因。
在給予動物待測化合物之前，也可通過手術、藥物或其它處理使得動物體產生所需狀態。這種處理可用於減少或除去體內的一種或多種天然體內物質。例如可處理動物以降低或除去對生殖器官和腺體有作用的激素。對生殖器官和生殖腺有作用的激素包括促性腺激素如促卵泡素，和黃體生成素、泌乳刺激素、雌激素等。在其它情況下可通過處理以提高體內的天然物質含量並可有效於在動物體內檢測待測化合物的作用。手術手段包括如摘除器官或腺體，它們產生激素或其它能在動物體內引起組織和細胞自分泌或旁分泌作用的物質。可產生這些效果手術方法包括如卵巢摘除術、腎上腺其除術和睪丸摘除術。在一些情況下某些藥物可在待測化合物操作之前或之中給予動物，以減少或除去一種或多種體內天然物。
因此在本發明首選的實施方案中，雌激素應答系統是經過處理以降低體內雌激素水平的動物。具體的有效降低體內雌激素水平的處理方法包括卵巢切除術，並可任意包括給予動物一種化合物以降低對生殖器官和腺體有作用的激素(如那法瑞林)的合成。
這裡所述方法典型的包括使雌激素應答系統如動物或分離的細胞群或組織與待測化合物接觸這一步驟。這些方法的此種目的可在體內或體外實現。當接觸步驟包括給予動物一種待測化合物時，待測化合物可通過任何適合的形式和方法給予。待測化合物可以多種形式準備，包括溶解、凝膠、凍幹、散布或固化。可預見其首選形式將基於待測化合物的物理特性。待測化合物可通過口腔、靜脈內、大腦內、肌肉內、腹膜腔內、皮內、皮下、鼻內或肺內給予動物。首選的給予方式基於動物和待測化合物類型，這對本領域技術人員來說將是明確的。待測化合物典型的給予劑量和時間須足以使該待測化合物完全發揮其對動物的作用。給予劑量和時間也基於動物和待測化合物類型。
待測化合物的作用可在動物體內使用多種方法進行測量。在一個複雜的生物體內例如哺乳動物體內，雌激素對多種組織均有活性，因此雌激素對一種組織的任何一種活性都可作為一種雌激素活性。響應雌激素的組織包括生殖組織(例如子宮組織，如子宮內膜和子宮肌層組織)、乳腺組織、類骨組織、神經組織、血管組織、腎臟組織、肝臟組織、肺臟組織、平滑肌和骨骼肌。具有雌激素活性的化合物可對這些組織中的一種、多種或全部產生作用。在首選的實施方案中，雌激素應答系統包括子宮組織或源自子宮部分的細胞。
可通過獲得已經接觸了待測化合物的雌激素應答系統的樣品並測量該已接觸樣品的一種或多種特性來確定一種雌激素作用。也可通過獲得包含產生自雌激素應答組織成分的樣品來確定一種雌激素作用。例如可在給予一個哺乳動物待測化合物後，測量血液樣品中的脂蛋白成分。來自生物體的這些種類的樣品可稱為「生物學樣品」。
一個生物學樣品可包括分離自試驗對象或存在於試驗對象中的組織、細胞和生物液。樣品也可以是源自病人的「臨床樣品」(clinicalsample)。這種樣品包括(但不僅限於)唾液、血液、血細胞(如白細胞)、羊膜液、血漿、精液、骨髓和組織或細針穿刺活檢樣品、尿、腹膜液、胸膜液或來自這些的細胞。生物學樣品可包括組織切片如冷凍切片以用於組織學目的。生物學樣品包括如取自子宮內膜的活組織切片。生物學樣品也可稱作「臨床樣品」。試驗生物學樣品是已經進行分析、監測或觀測了的生物學樣品。對照生物學樣品可以是試驗生物學樣品的陽性或陰性對照。對照生物學樣品通常包含與試驗生物學樣品相同類型的組織、細胞和生物液。
在本發明的另一實施方案中，在動物體內的從兩種或多種不同雌激素應答組織或細胞測得處於DMBT1調控序列控制下的基因表達的信息。獲得並分析這種信息可方便的確定一種待測化合物是否具有選擇性雌激素活性(例如化合物是否是一種SERM)。例如如果在一個樣品內待測化合物引起DMBT1調控序列控制下的基因表達的提高，而在另一樣品內該待測化合物沒有引起表達提高或引起表達減弱，則該化合物證明有選擇性雌激素活性。
因此根據這個實施方案，本發明提供了一種鑑別或篩選具有選擇性雌激素活性的化合物的方法，其步驟包括(a)使待測化合物與第一雌激素應答系統接觸；(b)使待測化合物與第二雌激素應答系統接觸；(c)從第一雌激素應答系統和第二雌激素應答系統獲得表示DMBT1調控序列控制下的基因表達的信息；和(d)將(i)第一雌激素應答系統中DMBT1調控序列控制下的基因表達提高和在第二雌激素應答組織中表達降低或無表達，或(ii)在第一雌激素應答系統中表達降低或無表達和在第二雌激素應答系統中表達提高，與選擇性雌激素活性聯繫起來。一方面這個實施方案的方法包括使待測化合物與動物接觸，檢測來自動物的第一雌激素應答組織中操作性連接到DMBT1調控序列上的基因表達，並檢測來自動物的第二雌激素應答組織中操作性連接到DMBT1調控序列上的基因表達，或者檢測第二動物中的相應表達，並將雌激素應答系統中的基因表達與選擇性雌激素活性聯繫起來。
在本發明的另一實施方案中，可從一個應答待測化合物的細胞或組織測量DMBT1的表達或DMBT1調控序列控制的基因表達，再從一個不同細胞或組織(或在其中)測量產生的另一雌激素作用，如此可確定選擇性雌激素活性。這中「另一雌激素作用」可以是由雌激素化合物產生的任何種類的作用，並且不是DMBT1表達或DMBT1調控序列控制的基因表達。該作用類型包括由雌激素受體活化引起的胞內作用，包括雌激素受體移動到胞核；雌激素應答基因表達的誘導；一氧化氮產生增強；細胞增殖，包括乳房內皮細胞和子宮內膜細胞；細胞分化和生長，包括神經突生長和分化的增強；組織生長，包括子宮內膜組織的生長；骨骼礦物密度提高；血液成分改變包括高密度脂蛋白(HDL)膽固醇和甘油三酯的增多，低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的減少，血液凝固作用增強；和炎症的增多。
在這個實施方案中，從不同雌激素應答組織或細胞中(也就是從不同雌激素應答系統)測量DMBT1或DMBT1調控序列控制的基因表達和其它雌激素作用。根據這個實施方案，不同的雌激素應答系統可以是如，來自同一動物，來自不同動物，來自動物和來自修飾細胞，來自兩種不同修飾細胞等。當待測化合物(a)提高一個雌激素應答系統的DMBT1表達或DMBT1調控序列控制的基因表達，並對另一雌激素應答組織有抗雌激素作用，或者(b)降低一個雌激素應答系統的DMBT1表達或DMBT1調控序列控制的基因表達，並對第二雌激素應答系統有雌激素作用的時候，即認為表現出選擇性雌激素活性。
因此根據這個實施方案，本發明提供了另一鑑別或篩選具有選擇性雌激素活性的方法，其步驟包括(a)使待測化合物與第一雌激素應答系統接觸；(b)使待測化合物與第二雌激素應答系統接觸；(c)測量第一雌激素應答系統中DMBT1調控序列控制下的基因表達；(d)測量第二雌激素應答系統中的其它雌激素作用；和(e)將(i)第一雌激素應答系統中表達的提高和在第二雌激素應答組織中無雌激素作用或抗雌激素作用，或(ii)在第一雌激素應答系統中表達的降低或無表達和在第二雌激素應答組織中存在雌激素作用，與選擇性雌激素活性聯繫起來。
根據這個實施方案，接觸步驟通常在測量同一雌激素應答系統步驟前面進行。除了這一限制，這些步驟可以按任何所需順序進行。在一些情況下首先確定待測化合物對DMBT1調控序列控制下的基因表達產生的作用；在其它情況下，首先確定待測化合物對不同雌激素應答化合物產生的其它雌激素作用。步驟順序可根據待鑑別化合物的種類或該方法其它相關因素來確定。
可使用任何適合的技術來從另一個雌激素應答系統測量雌激素作用。在一個具體實施方案中可直接從來自另一雌激素應答系統的樣品測量雌激素作用。例如可測量一個組織樣品在應答待測化合物時的尺度和重量增長，或者使用生化、免疫化學或顯微技術來分析如組織中的細胞增殖情況。在另一具體實施方案中，可通過確定另一雌激素應答系統在應答待測化合物時產生的成分情況來測量雌激素作用。例如一個雌激素應答系統如類骨組織在應答待測化合物時可產生出現於動物血液或其它體液中的成分，例如分泌的骨翻轉蛋白(secreted bone turnover)(例如骨鈣蛋白、鹼性磷酸酶和前膠原前肽)。可通過分析這些成分以確定待測化合物是否具有雌激素活性。由待測化合物的雌激素活性引起的變化可與合適的對照進行比較以量化該雌激素活性。
如上文所述，一個非常有效的實施方案包括測量待測化合物的引起細胞增殖的能力。可以在如乳腺、類骨、神經或血管組織中測量細胞增殖情況。如所述的，可通過測量相對於對照的組織的重量或大小的增加情況來衡量細胞增殖的程度。也可以通過顯微觀測細胞分裂來確定增殖情況，或者通過生化或免疫學技術來確定增殖標記物的出現，例如細胞表面蛋白或者胞內分子，來確定增殖情況。有效的細胞增殖標記物包括但不僅限於，細胞循環蛋白如細胞周期蛋白和增生細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen(PCNA))，信號中間物(signaling intermediates)例如增殖相關基因產物(proliferation-associated gene product(PAG))，核酸結合蛋白和轉錄因子例如mRNA結合蛋白HuR，等等。
在本發明的一些實施方案中，測量了DMT1核酸或DMBT1蛋白的表達。生物學樣品中的DMBT1 mRNA量可通過使該生物學樣品與一種能夠特異性檢測DMBT1 mRNA的化合物或試劑相接觸，來進行測量。有效技術包括使DMBT1 mRNA與能夠與其特異性雜交的標記核酸探針相接觸。特異於DMBT1 mRNA的核酸探針例如可以是一個本文所述的全長人DMBT cDNA或其部分序列，例如一個人DMBT1的至少長15、30、50、100、250或500核苷酸的寡核苷酸，它並且能購足以在嚴格條件下與DMBT1 mRNA雜交。特異於DMBT1 mRNA的核酸探針優選在嚴格條件下僅與特異於DMBT1mRNA發生雜交，而不與檢驗的生物學樣品中存在其它核酸發生雜交。
關於核酸探針或抗體的「標記」這一術語用以指對探針或抗體的直接標記，即通過偶聯(也就是物理法連接)上一個可檢測的物質，也指對探針或抗體的間接標記，即通過化學反應連接上一個被直接標記的另一分子。間接標記的例子包括使用被螢光標記的二級抗體檢測一個初級抗體，和用生物素末端標記DNA探針，這樣就可用被螢光標記的鏈黴抗生物素來檢測探針。
其它有效的在生物學樣品中確定DMBT1 mRNA量的技術包括進行反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)。可從用待測化合物處理過的樣品製備互補DNA(cDNA)，使用特異於DMBT1序列並能在嚴格PCR條件下與DMBT1 cDNA進行雜交的寡核苷酸引物擴增DMBT1cDNA。可使用商品試劑盒，它能方便的檢測包含可檢測標記物的PCR產物，例如SYBRTM Green PCR Core Reagents(Applied Biosystems，Foster City，CA)。
其它有效的在樣品中確定DMBT1 mRNA量的技術DNA微陣列分析技術和Northern雜交，如在實施例1和實施例2中分別所述。
可通過使生物學樣品與一個能特異性檢測DMBT1蛋白的化合物或試劑相接觸來測量生物學樣品中的DMBT1蛋白。檢測DMBT1蛋白的試劑優選為可與DMBT1蛋白某部分特異結合的抗體。在一種首選的方法中，一個DMBT1蛋白的特異抗體偶聯一個可檢測的標記物，並使用它來檢測DMBT1。DMBT1蛋白的特異抗體可以是多克隆或是單克隆。可使用能夠完整抗體分子或其片段(如Fab orF(ab』)2)。
檢測多肽例如DMBT1的技術包括酶聯免疫分析(ELISAs)、Western blots、免疫沉澱和免疫螢光技術。這些方法的細節可在如Sambrook et al(supra)中找到。
其它在體內檢測mRNA或蛋白的技術包括下文將要描述的融合表達DMBT1調控序列和一個報告基因、原位雜交和免疫組織化學技術(以在特異亞細胞空間和/或結構中固定信使RNA和蛋白)。
此外，定量方法例如正電子散射X射線斷層攝影(positronemission tomography(PET))成像術，使得以非侵入方式評估活人器官中DMBT1蛋白成為可能(Sedvall et al.，(1988)Psychopharmacol.Ser.，527-33)。例如通過靜脈將痕量的偶聯有放射性示蹤劑的DMBT1蛋白注射入試驗對象體內，就可得到放射性標記在試驗對象的子宮、乳房、骨骼、血管系統或大腦中分布的圖像。相關領域技術人員認識PET成像術和其它成像技術(參見review by Passchier et al.，(2002)Methods 27278)。
在其它實施方案中，一個報告基因被置於DMBT1調控區域的控制之下並測量其表達情況。這裡使用的「報告基因」是一段不同於DMBT1調控區域的核酸序列，並且其在胞內表達時編碼一個能提供可檢測信號的蛋白。預期可使用很多種不同核酸序列作為報告基因。有效的核酸序列包括天然序列、重組序列和合成序列，當它們在胞內表達時可使用如核酸探針的方法來進行檢測。報告基因能提供可檢測的信號，例如來自螢光蛋白的散射光。其它報告基因編碼的蛋白在某種物質存在時能催化一個特異反應，其反應產物提供一個可檢測的信號。還有一些報告基因編碼獨特的蛋白，可使用親和分析方法如免疫親和分析來檢測該該蛋白。
在首選的實施方案中，將一個報告基因置於DMBT1調控序列的控制之下，並且將這個異源序列導入到雌激素應答細胞內。可用在這個方法和本發明成分中的報告基因包括(但不僅限於)，綠色螢光蛋白(GFP)編碼基因、β-半乳糖編碼基因(lacZ)，螢光素酶編碼基因(luc)、氯黴素乙醯轉移酶編碼基因(cat)、β-葡糖醛酸糖苷酶編碼基因、新黴素轉磷酸酶編碼基因和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶編碼基因。
在本發明另一實施方案中，雌激素應答系統是能表達功能性雌激素受體的細胞。這種細胞表達的功能性雌激素受體也至少包含DMBT1調控序列的部分序列，從而在該雌激素受體與雌激素化合物結合時，該序列能增量調控操作性連接於其上的基因表達。
因此根據本發明可通過以下步驟鑑別或篩選化合物雌激素活性(a)使細胞與待測化合物接觸，該細胞具有(i)功能性雌激素受體和(ii)一個核酸，包含在DMBT1調控序列控制下的基因；(b)獲取該基因的表達信息；和(c)使用步驟(b)的信息確定雌激素活性。
從而，使DMBT1調控序列控制下的基因表達提高的待測化合物具有雌激素活性；反之在雌激素存在時降低該基因表達的化合物可與抗雌激素活性聯繫起來。
在這個方法中可使用天然細胞或修飾細胞。天然細胞包括分離自雌激素應答組織中分離的細胞，例如分離自子宮組織如子宮內膜和子宮肌層組織、乳腺組織、類骨組織、神經組織和血管組織。可使用活組織切片或其它相關領域認識的技術來分離這些細胞。
「修飾細胞」指已被通過人工操作改變了某種遺傳或生化特性的細胞。修飾細胞包括如含有異源核酸的轉染和轉基因細胞。因此在另一實施方案中，本發明也提供了應答雌激素的修飾細胞，該細胞同時含有一個異源核酸，其中包含操作性連接到報告基因序列上的DMBT1調控序列。這種細胞對篩選化合物雌激素活性尤其有效。
根據本發明，可使用任何類型的細胞，只要它能表達功能性受體並產生能夠驅動DMBT1調控序列控制下的基因表達的雌激素信號。可使用內源性表達雌激素受體的細胞，用異源核酸轉染該細胞，該核酸包含操作性連接到如報告基因上的DMBT1調控序列。首選使用真核細胞。在一個首選的實施方案中，宿主細胞源自子宮，例如類似Ishikawa細胞的子宮內膜基質細胞。在另一首選實施方案中，宿主細胞源自乳房，例如MCF-7細胞。在另一首選實施方案中，宿主細胞源自骨骼，例如MG63細胞。在另一首選實施方案中，宿主細胞源自血管系統，例如HUVEC細胞。在另一首選實施方案中，宿主細胞是腦細胞，例如SK-N-MC細胞。此外預期可使用簡單真核細胞例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)構建雌激素應答系統(Jungbauer，A.，and Beck，V.J.，(2002)Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci，777167)。
如本文所述可使用能夠表達雌激素受體的核酸轉染細胞。可使用穩定轉染或瞬時轉染到胞內的載體表達雌激素受體。適合於表達雌激素受體載體在相關領域被認識並有商品供應，例如Promega公司產品(Madison，WI)。在一些情況下可能在胞內需要表達雌激素受體的變異體。某些雌激素受體變異體可能會表達出其活性相關的不同表型，例如組成性活力、敏感度提高和降低。雌激素受體變異體的一些例子參見Chambraud et al.(1990)J.Biol.Chem.26520686-91。
也可使用一個異源核酸轉染細胞，此核酸含有處於DMBT1調控序列轉錄水平控制下的報告基因序列。處於DMBT1調控序列控制下核酸序列可以是任意種類的序列，只要它能被本文所述方法檢測到。有效的核酸酸序列可編碼本文所述的蛋白或酶，當基因表達時這些蛋白使得細胞可被檢測。尤其有效的報告基因所編碼的報告蛋白如螢光素酶(luc)也在本文中進行了描述。為了確定如特異性和背景，可使用第二融合基因作為提高檢測特異性的對照，該融合基因含有相同的報告基因和不同的調控序列(例如，報告基因的調控序列不應答雌激素信號)。
在一個實施方案中，可製備一個核酸結構並將其導入到胞內。此核酸至少含有DMBT1調控序列(SEQ ID NO1，見表2)的部分序列，此部分序列足以在應答雌激素信號時驅動操作性連接基因的表達。
根據本發明，DMBT1調控序列(SEQ ID NO1的840-872部分)中從-2766到-2734位的部分序列能夠在應答雌激素信號時驅動操作性連接於其上的基因的表達。因此在本發明的一個實施方案中，包含SEQ ID NO1840-872部分或其變異體的核酸可被操作性連接到一個基因上並被導入到雌激素應答細胞，並可在一種方法中用以鑑別具有雌激素活性的化合物。這段DMBT1調控序列的變異可包括核苷取代和/或刪除，這些變異不足以降低它在應答雌激素信號時的驅動操作性連接的基因表達的能力。SEQ ID NO1840-872部分的變異體可使用合成或重組技術方便的製備。例如變異體序列相比SEQID NO1840-872部分具有約60％的核苷序列同一性，優選約為65、70、75、80、85、90、或者95％序列同一性。本發明的DMBT1調控序列優選可在高嚴格條件下與SEQ ID NO1雜交，或者與SEQ IDNO1內任何30mer連續序列相比至少有85％的序列同一性。
此外也發現DMBT1調控序列上遊-1347處(SEQ ID NO12259核苷酸的上遊)部分可提供改進的應答雌激素信號作用。因此在本發明的一個首選實施方案中，一個包含SEQ ID NO1 1-2259序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-2259序列中部分序列(包括SEQ ID NO1840-872序列)的核酸，或是包含這些序列變異體的核酸，可被操作性連接到一個基因上並導入雌激素應答細胞，並在一個方法中用以鑑別具有雌激素活性的化合物。更具體的，包含-2734位上遊序列的DMBT1調控序列可提供改進的應答雌激素的作用。因此在本發明的另一首選實施方案中，一個包含SEQ ID NO1 1-872序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-872序列中部分序列(包括SEQ ID NO1 840-872序列)的核酸，或是包含這些序列變異體的核酸，可被操作性連接到一個基因上並導入雌激素應答細胞，並在一個方法中用以鑑別具有雌激素活性的化合物。
在另一實施方案中，本發明提供了分離的核酸序列，它包含操作性連接到一個報告基因上的DMBT1調控序列。DMBT1調控序列在應答雌激素化合物時能增量調控DMBT1的表達。在一個實施方案中，DMBT1調控序列包含SEQ ID NO1 840-872序列，或者包含這段序列的變異體(如本文所述)，這個調控序列本操作性連接到一個報告基因上。
在一個更首選的實施方案中，一個包含SEQ ID NO1 1-2259序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-2259序列中部分序列(包括SEQ IDNO1 840-872序列)的核酸，或是包含這些序列變異體的核酸，被操作性連接到一個報告基因上。在另一優選實施方案中，一個包含SEQ ID NO1 1-2259序列的核酸，包含SEQ ID NO1 1-872序列中部分序列(包括SEQ ID NO1 840-872序列)的核酸，或是包含這些序列變異體的核酸，被操作性連接到一個報告基因上。
如這裡所述，本發明闡明了將具有孕酮活性或抗孕酮活性的化合物與雌激素化合物伴隨給予時，能夠降低雌激素介導的對DMBT1調控序列控制下基因表達的增量調控作用。這方面本發明為篩選、監測和/或鑑別具有孕酮活性或抗孕酮活性化合物的方法建立了基出。
孕酮受體調節劑(PRM)可包括在一些組織中有孕酮活性而在另一些組織中有抗孕酮活性的化合物，和可用本文所述方法鑑別出的化合物。一個有效的臨床PRM的例子是米非司酮，它可在子宮內膜中抑制雌激素的促增殖作用，同時不誘導分泌狀態(如同孕酮一樣)。已經設想將PRM用於含有雌激素的激素替代療法，它們將阻礙雌激素的刺激性作用，同時當用它們單獨處理子宮內膜時，其表現症狀是雌激素依賴性的。
在一個實施方案中這裡所述的方法可鑑別出新型的具有孕酮或抗孕酮活性的化合物，例如PRM。可通過確定DMBT1調控序列控制下的基因表達情況來鑑別PRM。例如當一個待測化合物能夠降低雌激素誘導的對DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用時，可認為該化合物具有抗孕酮活性，是一種PRM。
因此在另一實施方案中，本發明提供了鑑別或篩選具有孕酮或抗孕酮活性的化合物。該方法步驟包括因此根據這個實施方案，本發明提供了另一鑑別或篩選具有選擇性雌激素活性的方法，其步驟包括(a)使雌激素化合物與雌激素和孕酮應答系統接觸；(b)使待測化合物與雌激素和孕酮應答系統接觸；(c)獲取雌激素和孕酮應答系統中DMBT1調控序列控制下的基因表達信息；和(d)使用步驟(c)得到的信息來確定孕酮或抗孕酮活性。
在一個實施方案中步驟(c)可包括相對對照來測量基因表達情況，步驟(d)可包括將應答待測化合物時基因表達的降低與孕酮活性或抗孕酮活性聯繫起來。具體來說，當一個待測化合物能夠降低雌激素介導的對DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用時，它可能有孕酮活性或者有抗孕酮活性，這取決於所用的雌激素和孕酮應答系統。例如一個具有孕酮活性的化合物在大鼠子宮內能夠降低雌激素介導的對DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用；而一個具有抗孕酮活性的化合物在猴子宮內能夠降低雌激素介導的對DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用。
此外有可能在一些雌激素和孕酮應答系統中，孕酮激動劑和孕酮拮抗劑對DMBT1表達的作用將不能區分，也就是說兩者都會降低雌激素介導的對DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用。優選的，本發明的方法進一步包含測量孕酮應答作用的步驟，此應答作用不同於DMBT1調控序列控制下的基因表達。例如在靈長類動物體內，孕酮激動劑和拮抗劑對子宮內膜組織學有截然不同的作用，也就是說前者通過分化誘導分泌表型，而後者通過抑制細胞分裂誘導無增殖、無分泌表型。因此在一些實施方案中，本發明的方法進一步包括測量子宮內膜組織學變化或測量子宮內膜分泌標記物的步驟，或者通過在乳腺中測量特異的孕酮依賴基因標記物。在齧齒動物體內，第二種孕酮作用可通過蛻膜化，一個依賴孕酮的衡量子宮接受胚胎準備情況的分析，來進行測量。
雌激素和孕酮應答系統可以是能夠應答雌激素和孕酮的單個細胞、組織或複雜的多細胞生物體。典型的雌激素和孕酮應答系統包含的細胞同時含有雌激素受體和孕酮受體。雌激素和孕酮應答系統也包含DMBT1調控序列控制下的基因，該基因的表達是可測量的。在雌激素和孕酮應答系統中，可利用抗孕酮活性抑制雌激素信號引起的對DMBT1調控序列控制下的基因表達的增量調控作用，例如利用孕酮拮抗劑對孕酮受體的作用。
這裡定義的「孕酮受體」指任何能夠結合到孕酮並且該結合能夠提高和降低孕酮信號途徑活性的蛋白。優選的，孕酮受體是能結合孕酮的核受體基因家族中一個成員的產物，並且(1)它含有一個胺基酸序列，該序列與人孕酮受體B(Kastner et al.(1990)EMBO J91603-14；GenBank protein accession NoNP_000917)有高於約60％、65、70、75、80、85、90或95％的胺基酸序列同一性；或者(2)它能與源自抗孕酮受體的抗體如多克隆或單克隆抗體結合，例如這裡所述的人孕酮受體B。這裡所用的孕酮受體包括人源受體和來自非人哺乳動物的受體(例如獸醫學動物如馬、牛、綿羊和豬，家庭寵物如狗和貓，實驗室動物如小鼠、大鼠、猴、兔和豚鼠。)這裡提到的人孕酮受體包括所述的B型異構體，A型異構體缺少B型異構體中的N-末端的第一164個胺基酸殘基，和其它任何另外的本領域技術人員認識的異構體。這裡定義的「功能性孕酮受體」是一種能夠在轉錄水平調控基因表達的孕酮受體。
在一個具體實施方案中，雌激素和孕酮應答系統是動物體，包括這裡所述的天然和遺傳修飾(轉基因)動物。如本文所述這些動物也可在給予待測化合物之前，用手術或藥物方法進行處理以使其產生所需狀態。
所用方法包括使待測化合物與雌激素和孕酮應答系統接觸的步驟。這一步可在使雌激素化合物與應答系統接觸之前、同時或之後進行。接觸時間或待測化合物給予時間長度依賴於多個因素，這包括待測化合物本身的性質，雌激素化合物，待測化合物和雌激素化合物劑量，等等。如本文所述雌激素化合物和待測化合物可以接任何適合的形式和方法進行給予。
可用多種方法來在動物體內測量待測化合物的作用。在複雜生物體內例如不如動物體內，雌激素和孕酮當然對不同種類組織都有作用。因此根據該方法，需要使用這樣的雌激素和孕酮應答系統，a)它響應雌激素化合物並且在應答雌激素化合物時產生可測量的雌激素作用，和b)它響應孕酮化合物。按這種方法，可評估待測化合物的孕酮或抗孕酮活性。
在本發明的另一實施方案中，使動物與雌激素化合物和待測化合物接觸，並在來自該動物的組織中測量DMBT1的表達或者DMBT1調控序列控制下的基因表達。在一些情況下，確定一個組織中(例如子宮內膜組織)DMBT1的表達或者DMBT1調控序列控制下的基因表達，可能已足以確定待測化合物是夠具有孕酮或抗孕酮活性。
在本發明的另一實施方案中，在動物的兩各或多個組織中測量DMBT1的表達或者DMBT1調控序列控制下的基因表達。典型的，這兩個或多個組織不同並且都響應雌激素和孕酮。在這個實施方案中，測量可確定待測化合物是否具有選擇性孕酮活性(例如化合物是否是一種PRM/SPRM)。該待測化合物至少在一個組織中將表現抗孕酮活性，例如在雌激素化合物存在時降低DMBT1的表達，同時在其它組中該待測化合物將沒有作用或表現出孕酮作用。
在另一實施方案中，通過在一個組織中測量DMBT1的表達或者DMBT1調控序列控制下的基因表達，並且在另一個組織測量待測化合物的另外孕酮作用，這兩個組織均已與雌激素化合物和待測化合物接觸，來確定選擇性孕酮活性。另外的孕酮作用可以是任何種類的作用，只要它是由孕酮化合物產生並且不是DMBT1的表達或者DMBT1調控序列控制下的基因表達。作用種類包括孕酮受體活化引起的胞內作用，包括孕酮受體移動到胞核；誘導的孕酮應答基因的表達；子宮內膜上皮細胞的刺激和分化；黃體的發展和黃體結構-功能的保持。
如本文所述可用任何技術來從被雌激素和待測化合物處理過的雌激素和孕酮應答組織中測量DMBT1基因的表達。此外DMBT1調控序列控制下的基因表達也可如本文所述進行測量。
在本發明的另一實施方案中，雌激素和孕酮應答系統是表達功能性雌激素受體和功能性孕酮受體的細胞。表達這些受體的細胞也至少包含DMBT1調控序列的一部分，以在雌激素受體結合雌激素化合物時驅動操作性連接於其上的基因的表達。因此根據本發明，可通過以下步驟來鑑別或篩選孕酮或抗孕酮化合物，(a)使雌激素化合物與細胞接觸，該細胞(i)含有功能性雌激素受體，(ii)含有功能性孕酮受體，(iii)含有一個核酸，包含DMBT1調控序列控制下的基因；(b)使待測化合物與細胞接觸；(c)測量相對於對照的基因表達情況；和(d)將在應答待測化合物時該基因表達的降低與孕酮或抗孕酮活性聯繫起來。
在這個方法中可使用天然細胞或修飾細胞。天然細胞包括分離自雌激素和孕酮應答組織的細胞，例如子宮組織如子宮內膜和子宮肌層組織，乳腺組織和神經組織。
在另一實施方案中，本發明也提供了修飾細胞，它可應答雌激素和孕酮並含有一個核酸，包含操作性連接到一個報告基因上的DMBT1調控序列。這種細胞對篩選抗孕酮活性化合物尤其有效。
根據本發明可使用任何種類的細胞，只要它可表達功能性受體並可產生作用於DMBT1調控序列的雌激素信號。可使用內源性表達雌激素受體和孕酮受體的細胞型，並用一個核酸進行轉染，該核酸包含操作性連接到一個報告基因上的DMBT1調控序列。內源性表達雌激素受體和孕酮受體的細胞包括T47D和ZR75-1細胞。首選使用真核細胞。此外如本文所述預期可使用簡單真核細胞例如釀酒酵母來作為雌激素和孕酮應答細胞系統的基礎。可通過用一個核酸來轉染細胞，該核酸包含操作性連接到一個報告基因上的DMBT1調控序列，或者通過從含有雌激素受體的細胞或組織中測量雌激素作用來檢測細胞通過DMBT1調控序列的激發蛋白表達的能力。
在另一實施方案中，可用表達雌激素受體、孕酮受體或同時表達兩者的核酸來轉染細胞。這裡已經描述了雌激素受體和孕酮受體以及可啟動兩者表達的載體。預期可表達雌激素受體變異體和孕酮受體變異體。如本文所述也可用一個包含DMBT1調控序列控制下的基因的核酸來轉染細胞。這裡也描述了首選的DMBT1調控序列。
接受激素替代療法的對象患子宮癌的風險增大，這是因為對子宮內膜的刺激作用沒有受到抑制。在一個首選的實施方案中，本發明的方法可用於監測對象子宮內的雌激素、SERM或PRM活性，這裡本文所述的生物學樣品來自對象的子宮，例如子宮內膜活組織切片樣品。也可監測懷疑具有這些活性的待測化合物。本領域技術人員認識如何從對象獲得子宮內膜活組織切片樣品的方法。例如在月經周期的限定時期內使用活組織切片鉗，通過穿子宮頸管從子宮頭蓋形體(cranial uterine body)收集子宮內膜活組織切片樣品。也可使用Tao Brush法(Wu et al.(2000)Am.J.Clin.Pathol.，114412-418)、碎片刮除術或手術切開來收集子宮內膜活組織切片樣品。
雌激素和孕酮的刺激作用也會引起起治療對象患乳癌的風險增加。在另一首選實施方案中，本發明的方法可用於監測對象乳腺內的雌激素、SERM、PRM活性，這裡本文所述的生物學樣品來自對象的乳腺。也可監測懷疑具有這些活性的待測化合物。本領域技術人員認識如何從對象乳腺獲得生物學樣品的方法。例如可用管內吸引術(intraductal aspiration)或者常規擠榨收集法(conventionalsqueezing collection method)來收集乳腺流出液。其它可用的從對象乳房收集生物學樣品的方法包括(但不僅限於)體外細針抽吸穿刺術(ex vivo fine-needle aspiration(FNA)(Eliasen et al.(1991)，Mod.Pathol.，4196-200))、乳房穿刺活檢(breast core needle biopsies(Ellis etal.(2002)Clin.Cancer Res.，81155-1166))和手術切開。
本發明的方法可任意用於監測試驗對象骨骼組織或血管組織中的雌激素、SERM、PRM活性，優選用於實驗室動物，例如猴、兔或大鼠，其中本文所述的生物學樣品來自對象的骨骼或血管系統。也可監測懷疑具有這些活性的待測化合物。本領域技術人員認識如何從對象的骨骼或血管系統獲得生物學樣品的方法。
除了影響視丘下部和大腦中其它涉及生殖的區域，卵巢類固醇激素對大腦有廣泛作用，包括作用於5-羥色胺能通路(serotoninpathways)、兒茶酚胺能神經元(catecholaminergic neurons)、基底前腦膽鹼能系統(basal forebrain cholinergic system)和海馬結構(hippocampal formation)，一個涉及空間和提取(declarative)記憶的大腦區域(McEwen(2002)Recent Prog Horm Res.57357-84)。特別的，雌激素被認為對大腦衰老有保護作用，但對這個保護機制所知甚少。
在另一個首選實施方案中，本發明的方法可用於監測對象大腦中的雌激素、SERM、PRM活性，其中本文所述的生物學樣品來自對象大腦。也可監測懷疑具有這些活性的待測化合物。本領域技術人員認識如何從對象的大腦獲得生物學樣品的方法。例如使用活體解剖針，並通過成像引導活檢術(imaging-guided biopsy)引導，如CT或MR引導活體解剖來從大腦得到生物學樣品。當然，也可在屍體解剖時分析大腦組織。
實施例1鑑別猴子宮內膜中雌激素處理引起的基因表達增量調控以下實施例證明在切除卵巢後隨之用雌激素處理的猴的子宮內膜中鑑別出一個特定基因，在受到增量調控的一組基因中，該基因的表達模式為受到強烈的增量調控作用。
簡要來說，從切除卵巢猴和對照猴取得組織樣品，從該樣品中製備標記cDNA，然後用微陣與cDNA雜交。微陣結果顯示許多基因較之於對照樣品受到增量調控或減量調控。一個在雌激素存在時受到強烈增量調控的基因被鑑別為推定的激素抑制基因DMBT1。
I.動物和給藥所有涉及到動物的方法均在美國實驗動物科學協會(AmericanAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare，AAALAC)認可的動物實驗設備中進行，並符合實驗動物飼養管理及使用規範(The Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals，NIH)。處理方案經東維吉尼亞醫學院動物管理及使用委員會(Eastern Virginia Medical School Internal Animal Care and UseCommittee，IACUC)核准。
從Covance Research Products公司獲得成年母獼猴(Macacafascicularis)。經歷一個完整的月經周期後，在下一周期的卵泡期使用中腹剖腹術(mid-ventral laparotomy)將動物的卵巢摘除。手術四周後用雌激素處理摘除卵巢(OVX)的動物。
為了研究雌激素對基因表達的影響，以三隻OVX猴為一組，對各組在19天處理周期的第一天給予雌激素或安慰劑植入物(載體對照)。植入後穩態血漿雌二醇水平達到100-200pg/ml。
此時期後對OVX猴實施安樂死，並從經雌激素和安慰劑處理過的猴子宮內膜取得活組織切片。(OVX猴和OVX並經雌激素處理猴子宮內膜特徵的細節在實施例4中描述)。將活組織切片置於無菌容器內並立即用液氮速凍，在後續處理前保存於-80℃。如下文所述從每個子宮內膜活組織切片製備總RNA。
II.從活組織切片製備總RNA如下步驟使用RNAzolTM(Tel-Test，Friendswood，TX)從子宮內膜活組織切片(每個約50mg)製備總RNA。每100mg組織使用2mlRNAzolTM。用Tissue Tearor homogenizer(Model No.985 370；BioSpecProducts，Bartlesville，OK)勻漿化處理組織2-3min，然後轉移到玻璃研缽中。組織研磨過程中至少用研棒搗10下直至得到清澈的懸浮液。將勻漿轉移到一個聚丙烯錐形燒瓶中，按每1ml勻漿0.1ml加入氯仿。劇烈振蕩混合物1min。然後將該懸浮液轉移到一個2ml微離心管中，再用Biofuge 17R離心機(Baxter，Deerfield，IL)在一個固定角度的轉子中，4℃下12000g離心15min。將水相小心轉移到一個新微離心管中，並加入等體積的異丙醇，輕微混勻後4℃下孵育15min。如上文所述4℃下12000g離心混合物15min得到RNA沉澱，除去上清，用75％(v/v)乙醇(Pharmco Products，Brookfield，CT)洗滌RNA沉澱。再4℃7500g離心8min，除去上清，將RNA沉澱粗略吹乾並用無RNase水(Promega，Madison，WI)重懸浮。然後用Amplification Grade無RNase DNase I處理以除去任何殘餘DNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。具體的，每20mgRNA在0.1ml反應液中處理，反應液含有1X Dnase I反應緩衝液和10UDNase I，室溫反應15min。消化完畢後，加入0.35ml RNeasy Mini Kit試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)的Buffer RLT並充分混勻，再加入0.25ml100％(v/v)乙醇。將混合物轉到RNeasy Mini Kit試劑盒柱子中，在ALC 4214微離心機中10,000rpm離心15秒。丟棄洗出液，RNA保留在柱子上。用Buffer RPE洗滌兩次，每次在ALC 4214微離心機中10,000rpm離心15秒。用30μl無RNase水將RNA洗脫到收集管中。如上述進行異丙醇沉澱、乙醇洗滌和離心。從每個組織樣品製備100-200mg RNA。
III.探針製品和DNA微陣雜交每種RNA製品各取一份製備與第一種晶片雜交的探針，該晶片含有來自4475個單獨基因標識的人互補DNA序列。該基因的冗餘約為25％；也就是產生印跡的DNA中有3400個代表單拷貝基因(或基因簇)。人與猴的編碼序列平均有95％以上的保守性；因此不能預測晶片上由於猴RNA和人基因間低互補性造成的複雜性。
晶片的產生通過使用GenIII Array Spotter(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，將純化的5M硫氰酸鈉中的PCR擴增DNA點到玻片(Corning GAPS slides(Corning，NY))上，再用500mJ紫外照射以發生交聯。
然後用子宮內膜RNA樣品製備標記cDNA探針。熱變性RNA，在三磷酸Cy3-脫氧胞苷(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)存在下用反轉錄製備標記cDNA探針。用RNase A(AmershamPharmacia Biotech)消化除去RNA，然後用PCR產物純化試劑盒(QIAquick 96 PCR purification kit(QIAGEN))進行純化。所有探針在Cytofluor(Applied Biosystems，San Diego，CA)上測量時根據螢光進行標準化。探針製品乾燥後，重懸在含有50％(v/v)甲醯胺(JT Baker，Phillipsburg，NJ)和10％(v/v)Cot-1 DNA(Invitrogen)的Version 2 Hyb緩衝液(Amersham Pharmacia Biotech)中。95℃加熱混合物2min，冷卻後取50μl置於兩個晶片上。用蓋玻片蓋住晶片並用DPX(Fluka，Milwaukee，WI)密封，42℃溫育14h。開始用含0.2％(w/v)十二烷基硫酸鈉的1X SSC 42℃洗滌，然後用含0.2％(w/v)十二烷基硫酸鈉的0.1X SSC 55℃洗滌，每次洗滌5min。乾燥晶片並用GenIII ArrayScanner(Molecular Dynamics)掃描晶片。同一實驗的原始亮度數據標準化為所有晶片的75％。每個基因標識在每個晶片上點兩次，同時副本晶片再與標記樣品進行雜交。因此每個基因標識產生了四組數據點(n＝4)。
IV.晶片雜交數據分析使用OrnniViz ProTM軟體包(Version 1.611；OnmiViz，Maynard，MA)分析標準化的微陣點強度。從DNA Chip 2.1資料庫(La JollaBioInformatics Database，RWJPRI，La Jolla，CA)提取數據。根據實驗所用晶片類型下載平均亮度，變異係數和注釋。亮度數據閾值設定為35單位；也就是在比率構建以前將低於35單位的值提高到35單位。用實驗閾值除以合適的對照閾值建立比值(ratios)。使用相關度量由k-means歸類法(k-means clustering(Quackenbush，Nat Rev Genet.(2001)2418-27))處理數據，類數(cluster number)設定為65。隨後過濾數據，以除去比值等於或低於2倍的數據(相對於參考樣品之一)，和與四個點密度中任一個的變異係數超過50％的任一基因標識。最後，過濾後的數據用平均等級歸類法(average hierarchical clustering)處理，使用的相關度量所得樹形圖產生50類(50clusters)。
V.在經雌激素處理的猴子宮內膜中誘導出推定的激素抑制基因DMBT1較之於空白對照處理(Ovx/安慰劑)的摘除卵巢的動物，在用雌激素處理(Ovx/E2)動物中共有237個基因標識被增量調控或減量調控了2倍以上。這其中包括已知的受雌激素調控的基因，例如PR(Touitou et al.(1989)Mol.Cell.Endocrinol.，66231 238)，它被增量調控了3倍，和胰島素樣生長因子結合蛋白3(insulin-like growth factorbinding protein 3)(Liu et al.，(1997)，Mol.Hum.Reprod.，321 26)，它被減量調控了10倍。其它出現的基因都不是先前已知的受雌激素調控的基因。推定的腫瘤抑制劑基因DMBT1(Deleted in Malignant BrainTumors 1)是一個令人尤其感興趣的基因，它被鑑別出受到雌激素的強烈誘導。發現DMBT1的表達被雌激素增量調控了37倍。使用相同的RNA樣品和第二種晶片進行第二輪雜交實驗，確認了這些包括DMBT1增量調控數據在內的基因表達數據結果。第二種晶片含有約5600個單一基因標識，包括第一種晶片上的所有標識。
根據這些數據，在子宮內膜中DMBT1基因表達在應答雌激素時受到強烈的增量調控，因此DMBT1調控的基因表達的提高與雌激素激動劑活性相關。
為了證實這些結果，使用一些RNA樣品進行定量RT-PCR。發現在被雌激素處理後DMBT1表達被提高了3000-9000倍。在所有三隻猴子中米非司酮阻礙DMBT1 mRNA水平的提高，與微陣分析和PCR(實施例6)評估結果相同。在用促性腺激素處理的猴子宮內膜中沒有檢測到DMBT1表達。
實施例2選擇性雌激素受體調節劑他莫昔芬和雷洛昔芬提高大鼠子宮內膜中DMBT1的表達以下實施例證明在大鼠子宮內膜中DMBT1表達在應答兩種化合物他莫昔芬和雷洛昔芬時受增量調控，這兩者在體內具有選擇性雌激素活性。本例也證明在大鼠子宮內膜中DMBT1表達在應答有雌激素拮抗劑活性的化合物時不受增量調控。因此這些數據表明DMBT1調控的基因表達可用作標記，以將具有雌激素激動劑活性的化合物和(尤其是)具有選擇性雌激素活性的化合物，與沒有任何雌激素活性的化合物例如雌激素拮抗劑區分開來。他莫昔芬和雷洛昔芬是SERMs，它們在骨骼中表現為雌激素激動劑活性而在子宮內膜中則表現為弱雌激素激動劑活性(MILLER(2002)CURR.PHARM.DES，.82089-2111)。ICI 182780為雌激素拮抗劑，對許多具雌激素受體的組織有活性。
I.動物模型和藥物處理使用10組22天齡的雌Sprague Dawley大鼠(每組三隻)來評估雌激素、他莫昔芬、雷洛昔芬和ICI 182780在子宮中對DMBT1的作用。下列組中大鼠按下文所述處理3天組處理(1)無處理(對照)(2)70μg/kg/天雌激素(3)1mg/kg/天他莫昔芬(4)1mg/kg/天雷洛昔芬(5)1mg/kg/天ICI 182780(6)70μg/kg/天雌激素+1mg/kg/天他莫昔芬(7)70μg/kg/天雌激素+1mg/kg/天雷洛昔芬(8)70μg/kg/天雌激素+1mg/kg/天ICI 182780所有處理均在0.5％甲基纖維素口服給藥。處理後無痛處死動物並收集子宮，稱重並用液氮冷凍，-20℃下保存。使用1.0ml TRIzolReagent(Invitrogen)和PowerGen 25組織勻漿機(Fisher Scientific)按使用說明書從冷凍子宮中純化RNA。
屍檢時稱量子宮重量，數據列於圖1。在大鼠體內，子宮尺寸在雌激素增殖影響作用下增加，這種增加可通過稱量組織重量來測量。如圖示，用雌激素(E)處理的子宮重增加1倍，而他莫昔芬(T)處理僅中等增加子宮重，雷洛昔芬(R)處理沒有顯著影響子宮重，無論是增是減(對照子宮重與雷洛昔芬處理子宮重在計算誤差範圍內相等)。雌激素拮抗劑ICI 182780(I)處理則顯著減小了子宮重。
用雌激素和他莫昔芬(E+T)共處理與用雌激素和雷洛昔芬(E+R)共處理較之於雌激素(E)處理的子宮重要低，而與他莫昔芬(T)處理和雷洛昔芬(R)處理子宮重相似。用雌激素和ICI 182780(E+I)共處理得到的平均子宮重，約在單獨用雌激素(E)處理和ICI 182780(I)處理的子宮重之間。這些數據顯示雷洛昔芬和ICI 182780是雌激素誘導子宮重提高的拮抗劑，同時他莫昔芬是一個弱子宮重刺激物，也就是說它是一個弱雌激素激動劑。
II.基因表達分析A.樣品分離和印跡使用Northern分析來確認對照組和處理組子宮內的基因表達，包括DMBT1表達。將含有2μg總RNA的2μL水加到6ml甲醛上樣染色液(Ambion)中，並在65℃下孵育20min用以凝膠電泳。每個樣品中加入1ml 0.1mg/ml的溴化乙錠溶液。將樣品加到凝膠(1XMOPS，1.25％SeaKem Gold Agarose Reliant(BioWhittaker MolecularApplications))上，在緩衝液(1X NorthernMax 10X MOPS Gel RunningBuffer(Ambion))中電泳分離，電壓為70v。直到染料穿過凝膠移動到約1/3處(二甲苯胺)和2/3處(溴苯酚藍)時為止。使用毛細管轉印(capillary transfer blotting)和10X SSC(0.15M檸檬酸鈉，pH7.0，1.5M NaCl)將RNA轉印到膜上(Hybond-N membrane(Amersham))，持續7d。然後用溴化乙錠染色，再用水使膜退色，並拍照用以進行泳道上樣比對。吹乾膜後，在雜交前保存於室溫。
B.DMBT1探針製備從Incyte Genomics獲得細菌克隆(ID#0000101155000011)的甘油原種，它含有的一個質粒(pINCY)包含大鼠ebnerin(DMBT1)基因。將甘油原種劃線培養於LB瓊脂糖平板上(含有100μg/ml氨苄)(KD Medical)上並在37℃下培養過夜。選擇單克隆並接種到200ml含有50μg/ml氨苄(Sigma)的Lennox L Broth(Sigma)培養基中。在37℃下將液體培養物培養過夜，並離心收集細菌。使用試劑盒(QIAfilterplasmid maxi kit(QIAgen))按照使用說明書純化質粒。
純化的pINCY/DMBT1質粒用限制性酶EcoRI和NotI(Promega)處理以製備並純化一個1,174bp DNA片段，該片段包含有ebnerin探針(DMBT1)。酶消化產物用電泳分離，使用1％SeaKem GoldAgarose Reliant凝膠，在1X TAE中進行，然後切下相應於該1,174bpDNA片段的條帶。使用試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit(QIAgen))按照使用說明書從切下的膠中純化ebnerin DNA探針。吸附在QIAgen柱子上的DNA用50μl洗脫緩衝液洗脫下來。凝膠電泳後通過比較洗脫液中的ebnerin DNA探針條帶DNA標準品條帶對比得到其含量。ebnerin DNA探針然後被稀釋到終濃度25ng/μl。
使用試劑盒(DECAprime II kit(Ambion))和Redivue-32P dATP(10mCi/ml)(Amersham)，從25ng ebnerin DNA製備隨機引物探針，除了反應在37℃孵育30min外，所有操作按照使用說明書進行。在加入EDTA停止反應後，使用試劑盒(QIAquick Nucleotide RemovalKit(QIAgen))按照使用說明書純化被標記的探針，最終洗出的探針溶液為50μl。取2μl在閃爍計數器中測量以保證標記達到最優的放射性強度(＞2×106cpm/μl)。
C.探針雜交與分析A節所述的印跡膜在2X SSC緩衝液(Sigma)中浸溼15min，然後在10ml RapidHyb液(Amersham)中65℃下預雜交20min。將探針溶液煮沸10min，取25μl加入到10ml RapidHyb液中並預熱到65℃。將印跡膜加入到稀釋的探針溶液中，在雜交培養箱中旋轉孵育雜交約10h。
從探針溶液中取出膜，並用含0.5％SDS和0.5％焦磷酸的2XSSPE液漂洗兩次，然後再用該液室溫下洗滌30min，其間輕輕攪拌。隨之用含0.5％SDS和0.5％焦磷酸的0.5X SSPE液65℃下洗滌兩次，每次30min。洗滌完成後，將膜印在紙巾上，用Saran Wrap包裹起來，並暴露在磷光成像屏(phosphor-imaging screen)上5h。然後用STORM 840(Molecular Dynamics)和IQ Tools 2.2(MolecularDynamics)軟體進行磷光成像屏掃描，再用Image Quant 5.2(MolecularDynamics)使探針成像並進行量化分析。
各種處理對DMBT1表達的影響見圖2和圖3。圖2表明在雌激素處理(E)子宮組織中(～5倍)、他莫昔芬處理(T)(～5倍)和雷洛昔芬(R)處理子宮組織中(～6.5倍)DMBT1表達被顯著提高。但是用ICI 182780處理(I)的結果為子宮中DMBT1的表達檢測檢測不到。圖3A表明他莫昔芬和雌激素共處理(E+T)使得DMBT1表達些微提高，雌激素和雷洛昔芬共處理(E+R)使DMBT1表達額外提高。使用雌激素和ICI 182780共處理(E+I)使得表達中度降低。
這些結果表明DMBT1表達可被具有雌激素活性的化合物提高，例如雌激素(E)。令人吃驚的是，具有選擇性雌激素活性的化合物例如他莫昔芬(T)和雷洛昔芬(R)也可強烈刺激DMBT1表達，儘管它們至多對子宮生長只有中等的作用。這些結果表明DMBT1可被用於鑑別具有雌激素活性的化合物，包括具有選擇性雌激素活性的化合物例如SERMs，特別可以鑑別那些對子宮生長有促進作用的化合物。
這個例子也表明根據DMBT1表達的差異，可將具有雌激素活性或者選擇性雌激素活性的化合物與具有雌激素相反活性例如拮抗劑活性的化合物區別開來。總體來說，這些數據表明DMBT1表達或者DMBT1序列調控表達可與雌激素活性獲選擇性雌激素活性聯繫起來。
此外本實施例中的數據也表明本發明在大鼠模型系統中的可操作性，實施例1的數據詳述了本發明在猴模型系統中的可操作性，二者共同支持了前文假定，即總體上在哺乳動物中，DMBT1表達或者DMBT1調控序列控制的基因表達可與雌激素激動劑活性和選擇性雌激素活性聯繫起來。
實施例3改進的選擇性雌激素受體調控劑在大鼠子宮內膜中提高DMBT1的表達本例證明在大鼠子宮內膜中，DMBT1表達在應答化合物5SA-DCC時受到增量調控。5SA-DCC是一種新近發現的化合物，具有體內選擇性雌激素活性。本例也證明一種在子宮內膜組織中具有陰性雌激素活性和阻礙雌激素活性，但對血液和骨骼標記有雌激素活性的化合物，不能在大鼠子宮內膜中增量調控DMBT1表達。
因此類似實施例2，這些數據表明DMBT1調控的基因表達可作為標記，用以區別具有雌激素化合物尤其是具有選擇性雌激素活性化合物，與具有陰性雌激素活性的化合物，尤其是對子宮內膜組織有陰性雌激素活性的化合物。
I.動物模型和藥物處理用類似實施例2的方法，使用6組22天齡的Sprague Dawley雌鼠(每組3隻)來評估雌激素、SERMs 5RA-DCC(5R-芳基-5，11-二氫-苯並吡喃並(4，3-c)苯並吡喃)和5SA-DCC(5S-芳基-5，11-二氫-苯並吡喃並(4，3-c)苯並吡喃)對DMBT1表達的作用。5RA-DCC和5SA-DCC在共同轉讓的(commonly assigned)美國專利申請No.60/341957《作為選擇性雌激素受體調節劑的新型含雜原子四環衍生物》(Novel Heteroatom Containing Tetracyclic Derivatives as SelectiveEstrogen Receptor Modulators，Kanojia，R.et al)。動物處理按下表處理3天組處理(1)對照(2)70μg/kg/天雌激素(3)1.4mg/kg/天5RA-DCC(4)1.4mg/kg/天5SA-DCC(5)70μg/kg/天雌激素+1.4mg/kg/天5RA-DCC(6)70μg/kg/天雌激素+1.4mg/kg/天5SA-DCC用實施例2中描述的方法進行藥物處理，組織樣品收集，RNA純化和印跡，及雜交到放射性標記的大鼠ebnerin cDNA上。
雌激素、SERM 5RA-DCC和5SA-DCC處理對大鼠子宮重量的影響，折算為體重，見於圖4。如同實施例2(圖1)，本例再次(圖4)表明，雌激素處理(E)使子宮重量提高到2倍以上，反映出它對該組織的激動劑活性。5RA-DCC本身微弱刺激了子宮重量，而當與雌激素共同出現時，它表現出對子宮重量提高的拮抗作用。這方面5SA-DCC與他莫昔芬作用類似(圖1)。
與其它增量調控DMBT1表達的雌激素化合物或選擇性雌激素化合物相反，5RA-DCC證明有陰性雌激素活性，並且對子宮生長表現出雌激素阻礙活性。
II.DMBT1表達雌激素、5RA-DCC和5SA-DCC處理對大鼠子宮內膜中DMBT1mRNA水平的影響見圖5。雌激素對DMBT1 mRNA表達的作用類似實施例2中所述(圖2)。5SA-DCC在大鼠子宮內膜中強烈刺激DMBT1表達(高於4倍)。有趣的是，5SA-DCC與雌激素的聯合使用得到一個對DMBT1表達互相促進的結果，提高它高於8倍。這些結果與他莫昔芬對DMBT1表達的作用類似，尤其與雷洛昔芬類似。
相反的，5RA-DCC本身並不刺激DMBT1基因的表達。有趣的是5RA-DCC強烈阻礙了雌激素對DMBT1表達的增量調控，降低DMBT1表達水平約6倍。
實施例4基於DMBT1序列調控細胞的實驗可有效鑑別雌激素激動劑本例說明了雌激素應答細胞的構建，它含有的核酸包含連接到報告基因上的DMBT1調控序列。在應答雌激素時，細胞啟動該報告基因的轉錄，使用實驗反應物可檢測到這種轉錄。本例表明這個細胞系統可有效檢測對DMBT1調控序列控制下的基因表達增量調控的化合物，以及雌激素激動劑相關化合物和具有選擇性雌激素激動劑活性的化合物。表2列出包含DMBT1調控序列的DMBT1基因5′區域和用以製備包含DMBT1調控序列的載體的引物。
I.構建DMBT1調控序列/螢光素酶報告核酸A.pDMBT1/1將人DMBT1基因的一個上遊區域-1347-+41核苷酸(SEQID No1 2259-3647)克隆到pGL3basic質粒中(Promega)，以構建包含DMBT1調控序列的質粒載體。所得質粒命名為pDMBT1-1/luc。
首先使用人基因組DNA(Clontech)PCR擴增DMBT1基因的一個5′區域-1347-+41核苷酸。使用1X VENT DNA聚合酶緩衝液，引物各40pm，40nM dATP、40nM dGTP、40nM dCTP、40nM dTTP，1ng DNA模板，和4 U VENT DNA聚合酶(New England Biolabs)，反應體系總體積100μl。模板94℃變性5min，然後是5套5循環遞減PCR，參數為第一步，94℃變性30s；第二步，退火1min，溫度從60℃到70℃，每5個循環上升2度；第三步，72℃延伸2min。30個循環後，最後72℃延伸5min。使用寡核苷酸oDMBT1-15』-GAATTCACGCGTGATCCCAGACCCAGCTGCATTATCATTCTC-3』(SEQ ID No2)和oDMBT1-25』-GAATTCAAGCTTGGTGTGTCCTCTAGGGTGGTATATT TCTGC-3』(SEQ ID No3)作為引物。為方便克隆，將限制性位點MluI和HindIII(下劃線部分)分別包括進SEQ IDs No2和3。
使用試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN))按照使用說明書將1.4kb的DMBT1 PCR產物從反應混合物中純化。純化的片段用乙醇沉澱並連接到pGEM-T Easy(Promega)以構建pDMBT1-1/GEM-T。連接反應物轉化到JM109感受態細胞，並在含100μg/ml氨苄，X-gal和IPTG(Sigma)的LB瓊脂糖培養基(KD Medical)上培養。白色表示陽性轉化子，挑取接種到3ml含100μg/ml氨苄的Lennox L broth培養基中(Sigma)進行培養。使用試劑盒(QIAGENDNA minipreparation kit)按照使用說明書從細胞中純化質粒，然後用限制性酶消化以鑑別出含有DMBT1 PCR產物的質粒。
B.pDMBT1-1/luc如下文所述將1.4kb的DMBT1啟動子片段-，-1347-+41核苷酸(SEQ ID No1 2259-3647)亞克隆到pGL3basic(Promega)中，這是一個缺乏真核啟動子或增強子序列的螢光素酶報告載體；所得質粒命名為pDMBT1-1/luc。使用試劑盒(QIA filter maxi kit(QIAGEN))按照使用說明書從200ml培養液中純化質粒pDMBT1-1/GEM-T。用限制性酶消化除去1.4kb的HindIII-MluI DMBT1片段，並電泳分離(使用1X TAE，1％SeaKem Gold Agarose Reliant凝膠)，然後用試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)從凝膠中純化。該DNA被用50μl洗脫緩衝液洗脫到QIAGEN柱子上，然後用乙醇沉澱。純化的DNA片段隨即連接到已被HindIII和MluI消化並純化的質粒pGL3basic上。連接反應產物DNA轉化大腸桿菌，所得克隆如上文所述進行分析。對pDMBT1/1-luc克隆測序(Lark Technologies)，貫穿其整個PCR得來的區域，以核實克隆的序列。
C.pDMBT1-2/luc通過將人DMBT1基因的一個上遊區域-2921-+41核苷酸(SEQ ID No1 685-3647)克隆到pGL3basic質粒中(Promega)中，得到另一個攜帶有DMBT1基因調控序列的一個較大部分的質粒載體，所得質粒命名為pDMBT1-2/luc。首先PCR擴增DMBT1基因的一個5′區域-，-2921--926核苷酸(SEQ ID No1 685-2680)。所用引物為oDMBT1-35′-GAATTCGGTACCGCATTCCACTGGCCTGTTTTATGTTTTGGG-3′(SEQ ID NO4)，和oDMBT1-45′-GCTTCTTTGCCATGCACTGTTCATCAGTAG-3′(SEQ ID NO5)。如上文所述將2kb的PCR產物連接到pGEM-T Easy(Promega)上以構建pDMBT1-2/GEM-T。
如上文所述，用KpnI消化pGEM-T載體將PCR產物切下，並亞克隆到經KpnI消化的pDMBT1-1/luc中。所得亞克隆用NdeI消化以篩選按正確方向插入的2kb片段。所得pDMBT1-2/luc構建體含有的調控區域由DMBT1基因的-2921-+41核苷酸組成。
D.pDMBT1-3/luc通過將人DMBT1基因的一個上遊區域-2766至-2734核苷酸(SEQ ID No1 840-872)克隆到質粒中pTA-luc plasmid(BDBiosciences Clontech)中，得到另一個攜帶有DMBT1基因調控序列的一個小部分的質粒載體。這個啟動子區域，5′-CAAGGTCAAGAGATCGACACCATCCTGGCCAAC-3′(SEQ IDNO6)，是Alu重複序列的一部分。合成(Sigma Genosys)SEQ ID NO5所示序列的寡核苷酸和其補足物5′-GTTGGCCAGGATGGTGTCGATCTCTTGACCTTG-3′(SEQ ID NO7)。兩者的互補序列分別與其退火，步驟為加熱到96℃3min，然後緩慢冷卻。退火後的核酸用3％BIO-gel瓊脂糖凝膠(BIO101)純化，然後按使用說明書用試劑盒(MERmaid kit(BIO101))將其從凝膠中提取出來。如上文對pGL3basic操作，將該寡核苷酸平端連接到經SmaI處理過的pGL3啟動子載體上(Promega)。連接產物轉化大腸桿菌JM109，然後對發現的含有合適大小插入體的質粒進行測序。選出一個含有正確序列的克隆以備進一步使用。使用試劑盒(QIAfilter Plasmid Maxi Kit)純化這個質粒，然後用BglII和MluI消化切下插入體，並連接到也經BglII和MluI消化的pTA-luc(BD Biosciences Clontech)上。所得質粒命名為pDMBT1-3/luc，用試劑盒(QIAfilter Plasmid Maxi Kit)純化。
E.pERE-luc將前後各有一個來自雞卵黃原蛋白基因(Klein-Hitpass et al.，(1986)Cell 461053-1061)的雌激素受體元件(EREs)的調控區域連接到螢光素酶報告基因上，構建得到一個陽性對照載體。當將這個載體轉化到雌激素應答細胞中後，它也能夠在應答雌激素起源信號時驅動螢光素酶基因的表達。這個載體命名為pERE-luc。
克隆方法與pDMBT1-3/luc相似，只是要進行定向克隆。寡核苷酸oERE-15′-GGAGCTAGCTAGAGGTCACAGTGACCTACGAGTCCCTAGAGGTCACAGTGACCTACGAGATCTGGA-3′(SEQ ID NO8)，兩端有限制性位點NheI和-BglII(下劃線部分)，它與寡核苷酸oERE-2TCCAGATCTCGTAGGTCACTGTGACCTCTAGGGACTCGTAGGTCACTGTGACCTCTAGCTAGCTCC(SEQ ID NO9)進行退火，然後用NheI和BglII進行消化，所得片段克隆到經NheI和BglII消化的pTA-luc中。
pERE-luc用作對雌激素誘導的報告物螢光素酶表達的陽性對照。pTAbasic，pGL3basic和空載體用作陰性對照。
II.構建表達人雌激素受體的載體構建編碼一個人雌激素受體蛋白的載體以製備表達功能性雌激素受體的轉染細胞。從睪丸RNA RT-PCR得到全長(2.0kb)人雌激素受體αcDNA，所用引物為oER-15′-ACGGACCATGACCATGACCCT-3′(SEQ ID NO10)和oER-25′-AGCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAA-3′(SEQ ID NO11)。將擴增的cDNA克隆到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中。核實序列後，將其亞克隆到經EcoRI消化的pCI-neo(Promega，Madison，WI)中，pCI-neo包含一個巨細胞病毒調控區域，一個SV40 poly(A)區域和一個新黴素選擇標記。pCI-ERα-neo序列用序列分析證實。
III.構建表達功能性雌激素受體並含有DMBT1-螢光素酶報告物的宿主細胞將HEK293人胚胎腎細胞(ATCC)接種於96孔培養板上，每孔20,000個細胞，檢測培養基含DMEM-F12[Sigma]、10％熱失活活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清[Hyclone]、青黴素/氨苄。24到30小時後，與上文I.A.到I.E.節所述的報告構建體(每孔10ng)，在有或無pCI-ERα-neo(對照)(每孔55ng)存在下--，使用1μl Lipofectamine2000(GibcoBRL)進行共轉染。轉染約18h後，用溶有不同濃度的17β-雌二醇的新鮮檢測培養基處理24h。
IV.螢光素酶檢測使用Steady-Glo Luciferase試劑(Promega)按照使用說明書檢測報告細胞的螢光素酶活性。用17β-雌二醇處理24h後，向每孔轉染的細胞(III節所述)-直接加入100μl Steady-Glo Luciferase試劑。孵育1h後，將整個上清液轉移到白色96孔板上，用MLX MicrotiterPlate Luminometer或者Luminoskan Ascent Luminometer確定螢光素酶活性，每孔讀數時間為2秒。經雌激素處理並被報告構建體和pCI-ERα-neo共轉染的細胞的螢光素酶活性標準化為1)用多個報告構建體轉染而非用一個報告構建體轉染細胞的螢光素酶活性，和2)用報告構建體和pCI-ERα-neo共轉染但未用17β-雌二醇處理的細胞的螢光素酶活性。
共轉染實驗的結果見圖6。用pCI-ERα-neo和列於圖右側的載體對細胞進行共轉染。分別用對照載體pTA和pGL3(沒有連接調控區域)和pCI-ERα-neo共轉染的細胞，在用寬範圍濃度雌二醇處理時產生很低的信號。用pCI-ERα-neo和pERE-luc共轉染的細胞產生一個強信號，依賴與所用雌二醇濃度。這些對照轉染提供的數據確認了基於細胞的報告系統的有效性。
用不同DMBT1調控區域/螢光素酶載體共轉染的細胞產生以下結果。首先，用pCI-ERα-neo和pDMBT1-1/luc(它含有DMBT1調控區域的-1347-+41核苷酸(SEQ ID No1 2259-3647))共轉染的細胞對任何濃度的雌二醇處理均不表現被雌激素誘導。用pCI-ERα-neo和pDMBT1-2/luc(它含有DMBT1調控區域的-2921-+41核苷酸(SEQ ID No1 685-3647))共轉染的細胞對試驗所用濃度的雌二醇濃度表現出稍微被雌激素誘導。最後用pCI-ERα-neo和pDMBT1/3-luc(它含有DMBT1調控區域的最小部分(33bp)，-2766--2734核苷酸(SEQ ID No1 840-872))共轉染的細胞，表現出劑量依賴性的雌激素強烈誘導(最高濃度雌激素下，達到5倍以上)。
這些結果證明DMBT1調控區域的上遊部分，特別是-2766--2734的區域，對雌激素應答作用是非常重要的。令人驚訝的是，pDMBT1-2/luc載體(含有-2921-+41核苷酸，這包括-2766--2734的區域)幾乎不與pDMBT1-3/luc載體(僅包括-2766--2734的區域)表現出相同的雌激素應答活性。儘管不希望被理論束縛，但在DMBT1調控區域上遊-2766和/或下遊-2734，可能存在多個元件，它們至少在這種基於細胞的系統中通過Alu序列幹涉了雌激素應答活性。
本例闡述了構建一種新型基於細胞的系統，它表達功能性雌激素受體和含有操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列的載體，以及該系統的有效性。更為特別的是，本例證明了新型基於細胞的系統，它含有一個編碼功能性雌激素受體的載體和一個包含操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列的載體。
本例也闡述了構建一種新型分離的核酸分子，它包含操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列，並可在細胞系統中應答雌激素誘導的信號，以及這種核酸分子的有效性。有效的核酸包含DMBT1調控序列的-2766--2734區域(SEQ ID No1 840-872)。其它有效的核酸分子包含DMBT1調控序列的-2734上遊序列和-1347上遊序列(包括-2766--2734區域(SEQ ID No1 840-872))，同時這些序列被操作性連接到一個報告基因序列上。
實施例5孕酮受體調節劑(PRM)對猴子宮內膜組織的作用在探索PRM對DMBT1表達的作用時，第一步是研究經雌激素和PRM共處理過的OVX猴子宮內膜組織的基因表達。OVX猴經雌激素和PRM共處理相對於單獨用雌激素處理，在處理一段時間後總體上表現出顯著的子宮內膜變薄。
I.動物和給藥除了以下內容，動物和藥物處理措施與例1相同。為了研究PRM對子宮內膜和基因表達的作用，給摘除卵巢猴(OVX)組(每組3隻)注射雌激素植入物(E2)，附加如下每日口服給藥PRM 19天，米非司酮10mg/kg/d；17N11-DE(17β-N-取代-11β-二甲基氨基苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮)1.0，3.0，或者10mg/kg/d；17N-11-PE(17β-N-取代-11β-哌啶苯基-雌甾-4，9-二烯-3-酮)1.0，3.0，或者10mg/kg/d。使用0.5％甲基纖維素作為對照給予安慰劑。17N11-DE和17N11-PE是兩種已經在PCT公布說明書No.WO 99/62928中描述過的PRM。從子宮內膜和子宮基層取得組織樣品用以組織學分析。
如實施例5所述也從子宮內膜取得組織樣品用以後續基因表達研究。將活組織切片置於無菌容器中並立即用液氮速凍，然後轉移到-80℃冰箱保存直到取用。
II.結果表1中列出經處理和對照OVX猴的平均子宮內膜厚度。在由於摘除卵巢或接受亮丙瑞林(leuprolide)40天而缺乏雌激素的動物中，子宮內膜萎縮，同時基質層也薄或者不存在。參考表1，摘除卵巢組(A)的子宮內膜厚度約低於亮丙瑞林處理組(B)三倍。這個結果可用兩組的血漿殘留激素水平不同來解釋，整個研究中亮丙瑞林處理組的殘留激素濃度高於摘除卵巢組2到3倍，前者是20-30pg/ml，後者約10pg/ml。在用雌激素處理19天後，觀察到典型的激素的過度增殖作用(hyper-proliferative)基質層急劇變厚，同時形成新生的分泌腺體。每組中三隻猴的數據平均後，雌激素刺激的子宮內膜(C)厚度高於摘除卵巢對照組(A)7到8倍，高於化學閹割組(B)2.5倍。
當用PRM(例如米非司酮、17N11-DE或17N11-PE)大劑量(最大有效濃度)共處理動物時，子宮內膜收縮至亮丙瑞林處理組的厚度(表1)。有一些分泌腺體形成，但是這些腺體表現出扁平和紊亂。當用較小劑量共處理時，17N11-DE處理的子宮內膜厚度減小幅度高於17N11-PE(表1)。
表1經處理猴子宮內膜平均厚度*
*表示除特別說明外均為三隻猴的平均厚度兩隻猴的平均厚度。第三隻中未出現子宮內膜。
實施例6在雌激素/PRM處理猴子宮內膜中PRM抑制DMBT1基因表達如實施例5所述分別從用雌激素和PRM或雌激素與安慰劑共處理的切除卵巢猴取得組織樣品。以下按照例1所述方法，從這些樣品製備總RNA，製備探針，進行DNA晶片雜交。
使用增量調控2倍作為整個實驗標識的數據分割點(cut-offpoint)，相比單獨用雌激素處理，與米非司酮(10mg/kg/d)共處理有164個基因標識發生改變，與17N11-PE(10mg/kg/d)共處理有163個基因標識發生改變，與17N11-DE(10mg/kg/d)共處理有467個基因標識發生改變。17N11-DE另外改變的大多數基因增量調控低於2.5倍。
PRM劑量依賴性的抑制由雌激素誘導的DMBT1基因表達。參考圖7，微陣分析揭示由雌激素誘導的DMBT1 mRNA水平被10mg/kg的米非司酮抑制了約20倍，被1mg/kg的17N11-DE抑制了約5倍，被3mg/kg的17N11-DE抑制了約25倍，被1mg/kg的17N11-PE抑制了約2倍，被3mg/kg的17N11-PE抑制了約4倍。
根據這些數據當用PRM和雌激素共處理時，在子宮內膜中DMBT1基因表達在應答PRM時受到減量調控。
實施例7一個基於DMBT1調控細胞的檢測可有效鑑別孕酮激動劑(和PRM)構建孕酮和雌激素應答細胞，它並且含有一個包含連接於報告序列的DMBT1調控序列的核酸，並將該細胞用於篩選出具有孕酮激動劑活性的待測化合物，例如PRM。如實施例4所述，用ER和DMBT1載體共轉染的細胞能夠在雌激素的作用下產生一個信號。用一個表達功能性孕酮受體的載體轉染這些細胞，並用以鑑別出通過孕酮受體來調控ER起始信號的待測化合物。
I.DBMT1/螢光素酶報告載體如實施例4所述將載體導入到合適類型的細胞中用以檢測。特別有用的報告載體例如pDMBT1-3/luc，包含了DMBT1調控序列的Alu序列，並且該序列融合在螢光素酶基因中。其它可用的報告載體可使用包含操作性連接到其它報告基因(例如氯黴素乙醯轉移酶或半乳糖苷酶)的DMBT1調控序列(或其部分序列)的載體來構建。
II.雌激素和孕酮受體載體使用表達功能性雌激素和孕酮受體的細胞來評估PRM的活性。編碼功能性雌激素受體的載體，例如實施例4描述過的pCI-ERα-neo，被導入到合適類型的細胞中用以檢測。
與此類似，構建編碼功能性孕酮受體(PR)的載體並導入到與ER載體宿主相同的細胞中。先前構建表達PR受體的載體的例子如Conneely et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.149493-501。將PR受體克隆到一個可在真核細胞例如哺乳動物細胞中表達的載體中。PR載體可包含驅動PR表達的增強子和啟動子序列，Poly(A)信號序列和胞內維持選擇信號例如新黴素基因。包含這些元件的載體有商品供應，例如Promega(Madison，WI)，同時已知的技術可將PR基因按任何所需方式克隆到合適的表達載體中。
在一些情況下將ER和PR基因同時置於同一表達載體中，並導入細胞進行表達。
另一導入含ER和PR基因的載體的選擇是，將一個單獨含ER或PR基因的載體分別導入可內源性表達PR或ER的細胞中。下文將詳述合適的細胞類型。
III.表達內源性ER或PR的細胞將DMBT1/螢光素酶報告載體與PR-或與ER-表達載體分別導入到可內源性表達ER或PR的細胞系中。報告載體和ER載體被導入到乳房細胞系T47D(Horwitz，K.B.et al.(1982)Cell 28633)中，它表達PR(和低水平的ER)，或者將報告載體和ER載體導入到乳房細胞系MCF7(Shupnik M A et al.(1989)Mol.Endocrinol.3660)中，它表達ER。另一選擇是，如上文所述將報告載體、ER和PR基因都導入到同一個合適的細胞系中。
用本領域技術人員已知的技術將載體導入細胞。這些方法包括但不僅限於磷酸鈣沉澱和電穿孔。用於這些技術的商品試劑盒和設備例如有CellPhectTransfection kit(Pharmacia(Piscataway NJ))，Cellporator和Lipofectin(Invitrogen Life Technologies(Gaithersburg，MD))。用任何這些方法將載體導入細胞後，可根據以下因素來選擇細胞選擇性標記，組成型報告物產生，雌激素誘導報告基因表達的情況，PRM對雌激素的抑制，細胞與所用高通量篩選微量滴定板的滿意結合，多倍數雌激素誘導報告基因表達檢測所需的標準偏差(standard deviation)。選出滿足高通量篩選必須標準的克隆備用。
另一得到穩定克隆的途徑的選擇是使用瞬時轉染，12到14h後檢測轉染細胞。
IV.生物發光檢測為檢測轉染細胞的螢光素酶表達，在懷疑有抗孕激素活性的待測化合物存在下(或不存在)，將細胞與不同濃度的雌激素孵育。然後按實施例4所述方法檢測處理過的細胞。具體來說，細胞溶解於含有溶胞試劑和螢光素酶底物(例如Steady-GloTM(Promega，Madison，WI)和LucLiteTM Plus(Packard，Meriden CT))的緩衝液中。溶胞產物在室溫下孵育，測量在2h的溶胞過程中進行。使用光敏儀器檢測光子，例如照度計(如Luminoscan Ascent(ThermoLab Systems，Franklin，MA))和閃爍計數器(如TopCount(Packard))。典型的，每孔讀數時間為0.1-2秒。
V.高通量篩選根據Sigma Chemical Company，St.Louis，MO提供的方法，首先用PBS洗滌螢光素酶報告細胞(克隆細胞或者瞬時轉染細胞)，收集後按錐蟲藍排除法(Trypan Blue exclusion method)和血球計進行計數。然後用培養基稀釋細胞，使用本領域技術人員已知的方法將0.2ml細胞懸浮液加入到96孔微滴定板的每個孔中。12-24h後，向微滴定板上的細胞中加入雌激素到其終濃度為0.1-10nM。同時也加入待測化合物，或者加入與待測化合物溶液同體積的溶劑。因此，檢測板上的每個試驗孔含有螢光素酶報告細胞、雌激素和待測化合物，而檢測板上的每個對照孔含有螢光素酶報告細胞、雌激素和溶劑對照。另外的對照孔設置僅含有報告細胞和溶劑對照。檢測板在37℃和5％CO2下孵育12-48h。然後如上文所述溶解細胞並檢測螢光素酶，處理數據。
試驗空中檢測到的生物發光信號與雌激素-對照孔檢測到的信號進行對比。一個具有抗孕酮活性的待測化合物與後者對照相比將降低生物發光信號。
儘管前文詳述講述了本發明的原理，並描述了用以說明的實施例，但顯然本發明的實踐可在下文權利要求及其等價物的範圍內包含常規變化、修改和/或改變。
實施例8孕酮對大鼠子宮內膜組織的作用使用切除卵巢的6周齡Wistar大鼠(Charles River，Wilmington，MA)，給予空白對照或待測化合物，持續1天或6周。所有給藥均通過口服給藥，每天一次，藥物溶於0.5％甲基纖維素或芝麻油中。處理後切除子宮，使用TRIzol reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照使用說明書從組織中純化總RNA。
以大鼠RNA樣品為模板進行一步反轉錄PCR(RT-PCR)得到DMBT1，使用試劑盒(One-Step RT-PCR Master Mix Kit(AppliedBiosystems，Foster City，CA))和ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems)，按照說明書進行。從Applied Biosystems(Foster City，CA)得到商品化的人和大鼠DMBT1(目錄號分別為Hs00244827_ml和Rn00575705_ml)引物和FAM標記的MGB探針。信使RNA水平相對18S核糖體RNA水平進行標準化，使用來自同一賣主的引物和由VIC和TAMRA標記的探針確定18S核糖體RNA水平。
定量PCR評估得到結果見圖3B。用乙炔基雌二醇處理1天(在單次給藥後約24h製備RNA)結果DMBT1 mRNA水平顯著提高。在雌二醇劑量為0.3mg/kg誘導作用達到最大值6倍。同時使用孕酮(醋酸甲羥孕酮)共處理時，它劑量依賴性的阻礙mRNA水平的提高，而這種阻礙作用又能被10mg/kg的孕酮拮抗劑米非司酮所阻礙。
實施例9子宮表達的免疫組化分析使用成熟的6周齡切除卵巢或假處理的Wistar大鼠(CharlesRiver)，給予乙炔雌二醇、他莫昔芬或雷洛昔芬6周。然後切除子宮並切片，使用山羊抗人蛋白多克隆抗體對DMBT1表達進行免疫組化分析。
使用常規方法整理組織並埋入石蠟中。切下5微米的切片，置於顯微載玻片(SuperFrost Plus+(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA))上並乾燥過夜。進行常規單一免疫組織化學(single immunohistochemistry(IHC))分析的方法已有描述(D』Andrea et al.，2001，BiotechnicHistochem.7697-106)。簡要來說，顯微載玻片上的組織切片進行脫蠟並重新與水結合。將載玻片置於Target緩衝液(Dako，Carpenturia，CA)中用微波處理5min，冷卻後置於磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4)中，然後用3％(v/v)雙氧水室溫下處理10min。孵育30min後室溫下洗滌。將常規兔封閉血清(Vector Labs，Burlingame，CA)加到載玻片上10min。在用PBS簡單漂洗，再用山羊多克隆DMBT1初級抗體(1∶25，Hypromatrix，Worcester，MA)處理切片。再用PBS洗滌切片，然後用生物素醯化的兔抗山羊二級抗體(Vector Labs)處理切片。用PBS洗滌後，加入抗生物素-生物素-辣根過氧化物酶複合物(HRP，VectorLabs)。然後洗滌所有玻片並用3，3′-二氨基聯苯胺(DAB，Biomeda，Foster City，CA)處理兩次，每次5min。用蒸餾水洗滌後，用蘇木精復染色。
二重IHC(double IHC)的方法已有描述(D』Andrea et al.，2001，supra)。使用與單免疫組化相同的方法(除了使用SG色原體(VectorLabs))和HRPSG檢測系統檢測兔多克隆PCNA(增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen))抗體(1∶4000；Sigma，St.Louis，MO)。第二種對DMBT1特異的初級抗體，與上文相似在組織上進行孵育。洗滌後，將生物素醯化的二級山羊抗山羊抗體(Vector Labs)加到玻片上，室溫下保持30min。隨後，用鹼性磷酸酶ABC試劑(AP-ABC，Vector Labs)處理玻片30min。然後用Fast Red色原體(Sigma，St.Louis，MO)檢測DMBT1。再將玻片浸蘸蘇木精，並蓋上有水基封固劑(water-based mounting medium(Dako))的蓋玻片。陰性對照包含1)將每種初級抗體用無免疫活性的血清代替，2)每種初級抗體的省略部分(omission)，3)雙重陰性對照。
結果發現相比假處理(泳道A)和切除卵巢對照，用雌激素處理產生了意料中的腔上皮增厚，這種現象在用他莫昔芬處理結果中甚至更加顯著，但是用雷洛昔芬處理則不這樣(數據未列出)。這種對子宮內膜的作用與對子宮重量的總作用相關(圖1)。DMBT1染色嚴格限制在腔上皮中，在腺上皮或基質細胞中只有少許或沒有染色。但是在腔上皮中的染色情況有變化，一些細胞染色深，另一些染色淺，還有一些根本沒有染色。雷洛昔芬和(尤其是)他莫昔芬比雌激素產生更高細胞水平的DMBT1。所有情況下染色均發生在核外。在假處理和切除卵巢動物中，用雌激素處理的子宮上皮染色主要發生在細胞腔面。相反，在用SERM處理的子宮中，染色均一的分布在上皮的整個陽性細胞中。
為了區分那些表達DMBT1蛋白的細胞和那些不在它們增殖狀態的細胞，用DMBT1抗體和PCNA抗體對玻片進行共染色。雖然很多表達DMBT1的細胞也發生了PCNA染色，但兩者沒有絕對的重疊(數據未顯示)，這表明DMBT1表達有可變性的原因不只是由於細胞處於增殖狀態。
表2SEQ ID NO.1gggggagtga gtgaaggang gtaggaaggg gtccccttat aacccaattg ggaagaccgg 60ctctctgagc aacaaaaatg agcgacatta taaatatcan acatacaatg tcaaaagatt 120
gttacaacag taacaatgac cggcaattat ggtgtgctac tcaatgaggg taaaattaga 180gtttggggtc agactgacac ctgaagggga gccctggtca cacagattac nggattcagg 240gactggaagg caaacagcag cagccggaag gtgctacagc cccgaccctt cccaccaggc 300tccccgtcct tctgtccccc tcgtctgtca ggtcacaggg ctcctggctc agaaatcaga 360gacccctcag aggtgggagg tgggaggggc cctgggctgc ctccctgatc tccgtcttcc 420tctggcttcc cagggcactg gtctgtgggt agaaagaatc tttagaagaa ggagaacaac 480gggctgtttt gggaagtctg cctgggaccc cagctcagct tcgtggcagg gatgtgtgcc 540tggcagcccc aggggccctg ctgggcctct cagtgccctg tcttatgaag ggaggtcttg 600gcttcccaca ggtaatcctc agctctgacg gcaggtggcc ctaggggagg ggcctggaag 660aggactccct caccacagtc aggagcattc cactggcctg ttttatgttt tggggcttcc 720ccatgaattc caatttagga aaggattctg tagctttaaa aaaaaaagcc atacatggcc 780gggcgtggtg actcatgcct gtaatctcag aactttgaga ggccgaggca ggcagatcgc 840aaggtcaaga gatcgacacc atcctggccg acatggtgaa accctgtctc tactaaaaat 900acaaaagtta gctgggtgtg gtgatgcacg cctgtagttc cagctactcg ggaggctgag 960gcaggagaat cgcttgaact cgggaggcgg aggttgtagt gagccgagattgcaccactg 1020cactccagcc tgggcgacag aacaagactc cgtcttaaaa taaataagta aataaataaa 1080taaatggcca catatgatcc agggggctct tccccataac gaccagtcct ctggtgctgg 1140gatttagggg cttggtccca cctcctggag tgtgctgtgg gggtgccgct ggcttaattg 1200cctggggaag gtgctttgca aatggggccc gggcgccgag tctctgagct ttaatgggct 1260tatcttgctt cctgttgttc ttcatggcag ttctggggtg aataaaatgg aactttgtgg 1320ttgtggtctt ccaacccctg ctgtttaagc agatgcttct aaccagtnng aaggggaaga 1380tgagggtcct ctggcagggg ctgctgctgg agaaggttgt ccccctgaac ccttctcttc 1440gtccaaggaa agacctccct aaatggtgtc ttatgagcca caaaatggcc ttgggacaag 1500atgaggcacc tgacggtgaa ggctgaggtc ccacacggtg ttggcaggtg gccctcaagc 1560ccattgtctt ctgcccgcat gcccaggacc gccacatcct tcctgttcca ctgacgtcac 1620ccatttccca cctgggatgc ctacctgggc tggctttgaa atgacagcta ggcttcacca 1680cttccttctt cctggtgtct cctgaacaaa aagctcacaa acccttattg tctcaggatc 1740ttttctgcta actaccatgg gcaaaagatg cagtcaaaac aacaaaaacg gggaggttac 1800
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tgtcagtgcg tttgcagttg ggcaacagcc agattgttca tatggcaatc aatcaaacac 3540acctaagttt tttccacata ttagccatcg actgttagca aaagccctca cttcctttat 3600attgatttat agcagcagca gaaatatacc accctagagg acacacctcc ttttagctag 3660gtacctataa atgtccagga ttttctattc aattgagaag aacccagcaa aatgg 3715SEQ ID NO.2gaattcacgc gtgatcccag acccagctgc attatcattc tcSEQ ID NO.3gaattcaagc ttggtgtgtc ctctagggtg gtatatttct gcSEQ ID NO.4gaattcggta ccgcattcca ctggcctgtt ttatgttttg ggSEQ ID NO.5gcttctttgc catgcactgt tcatcagtagSEQ ID NO.6caaggtcaag agatcgacac catcctggcc aacSEQ ID NO.7gttggccagg atggtgtcga tctcttgacc ttgSEQ ID NO.8ggagctagct agaggtcaca gtgacctacg agtccctaga ggtcacagtg acctacgagaSEQ ID NO.9tccagatctc gtaggtcact gtgacctcta gggactcgta ggtcactgtg acctctagct agctcc
SEQ ID NO.10acggaccatg accatgaccc tSEQ ID NO.11agctctcaga ctgtggcagg gaaa
序列表110詹森藥業有限公司120作為臨床標記的DMBT1及其用途130PRD 210216011170PatentIn version 3.321012113715212DNA213人(Homo sapiens)220
221misc_feature222(19)..(19)223n為a、c、g或t220
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ccattgtctt ctgcccgcat gcccaggacc gccacatcct tcctgttcca ctgacgtcac1620ccatttccca cctgggatgc ctacctgggc tggctttgaa atgacagcta ggcttcacca1680cttccttctt cctggtgtct cctgaacaaa aagctcacaa acccttattg tctcaggatc1740ttttctgcta actaccatgg gcaaaagatg cagtcaaaac aacaaaaacg gggaggttac1800gcagttcaga aaatcccaca cattctcaag aagggtgtcc ccgccaagct gagagatacc1860tgggacatca tgctttcctg gaggggaagg ctccctgccc ccattcctgt acagccggga1920gagtcgctcc tgttcgtcat cccatcttct cgctctcatt tgctgggctg acctctgctg1980gtatttcaag actgtttggt gccaccctct ctgagagatg gcctccctca tctgatttag2040atgcttttct ttaccttctc atagcagctt gtactaatac ttgctacccc ctgttgaaat2100tgtcaccagg caggtctgtc tctaagacca gacagtctgc ttttgtcttg gaaggacact2160tattacccna ncntgttcac aggtatttag tattcttacc atcatctttc cctgctgtgc2220tcccggcaga caattctaat ctgtcatgac actctgatga tcccagaccc agctgcatta2280tcattctcag tccaacactc caggaaccaa gggatcacaa tccccttcta agaggaatcc2340agcatgtgcc tggtcttggg cattccctgg tangtgagta accctgttct ctcgtcaccc2400agtgcttatc agttgctgat ctggcagtag gaggatgaaa cacagtgagc ctattctgtg2460ttcctattct actcaagggg tgaagaggca cctggaaaca acaggaagag ttgtaggatt2520aaaaaggaca tccaagattg aatgtaactt tcatctggat gaagccaaag gcagacttcc2580agccctaaat tctgactggt ggctgacaca ggacatgggt tcatggtacc cttctagaat2640gcagcataga ctactgatga acagtgcatg gcaaagaagc caagtgtcat ttcatggcct2700cagcctctca gctgagaagc agggcacagc tcacccaggc taggaaaaac agaggcaagt2760cctggaaagc tgtctgcttt taaccaagag ttactggcca tcaagtgtct tggttaaaaa2820ataagtgtca ggcaaccttc ttggtagata gagtgtgttg ggggcgatta tcagagtctg2880gtaatgactt ctgagggtcc caaagagtga agtgatattt acatagcaaa tccaaggang2940gggattgtgt gcaatatang tggangtggg ggcaggtttt gtgggtttgc caagctccaa3000ggtcatacaa tgtgcatgtc aaggacaaga aatcaaagcc atgtgaaatg gttggaggtg3060gttcagtttg aggtcatgtg tttctcagct cctgttgtgg aattagtgtg agacccagaa3120gactgtggcc aaagctatta tggacccatg gtctctgtgg actcatccct catgccttct3180gctctctgat cacatccaca ctcatgtcat cctcgttctt ccaaggtgag gttactagca3240ctgcacaggg gctgatgaga gcatgtcctg ccaggaaaaa ccatcccaaa gagatgcttt3300cccccttggc actgtgtcct gtatttgctc agcagcccac atcctgttct gccccaaacc3360ttggggcaga cttcccacag gtgaatttga actccccaag attaaaatca agcctgtatt3420caggaaacac ttgggagtcc tcgaggttca ccgagaggga agttggaaat ttttcactta3480
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21082160212DNA213引物4008ggagctagct agaggtcaca gtgacctacg agtccctaga ggtcacagtg acctacgaga60210921166212DNA213引物4009tccagatctc gtaggtcact gtgacctcta gggactcgta ggtcactgtg acctctagct60agctcc 6621010211..21212DNA213引物40010acggaccatg accatgaccc t 212101121124212DNA213引物40011agctctcaga ctgtggcagg gaaa 2權利要求
1.一種方法，包括以下步驟(a)使雌激素應答系統與待測化合物接觸；(b)確定雌激素應答系統中操作性連接到DMBT1調控序列上的基因的基因表達；和(c)檢測待測化合物產生的雌激素活性。
2.權利要求1的方法，其中步驟(c)包括測量相對於對照的基因表達，並鑑別提高基因表達因而具有雌激素活性的化合物。
3.權利要求1的方法，其中所述基因是DMBT1。
4.權利要求3的方法，其中所述確定步驟包括測量DMBT1核酸的量。
5.權利要求3的方法，其中所述測量步驟包括測量DMBT1蛋白。
6.權利要求1的方法，其中所述雌激素應答系統包含子宮組織。
7.權利要求1的方法，其中所述雌激素應答系統包含乳腺組織。
8.權利要求1的方法，其中所述雌激素應答系統包含類骨質組織。
9.權利要求1的方法，其中所述雌激素應答系統是動物。
10.權利要求9的方法，其中所述動物是靈長類動物。
11.權利要求10的方法，其中所述靈長類動物是猴。
12.權利要求9的方法，其中所述動物是嚙齒類動物。
13.權利要求9的方法，其中所述動物經過處理以降低雌激素的系統水平。
14.權利要求1的方法，其中所述雌激素應答系統包含細胞。
15.權利要求14的方法，其中所述細胞含有雌激素受體。
16.權利要求15的方法，其中所述細胞含有操作性連接到DMBT1調控序列的報告基因。
17.權利要求16的方法，其中所述報告基因編碼的蛋白選自綠色螢光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、螢光素酶(luc)、氯黴素乙醯轉移酶(cat)、β-葡糖醛酸糖苷酶、新黴素磷酸轉移酶和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶。
18.權利要求2的方法，其中所述對照是沒有與待測化合物接觸的雌激素應答系統。
19.權利要求2的方法，其中所述對照包含不應答雌激素的細胞和組織。
20.權利要求1的方法，其中步驟(c)包括檢測不激發雌激素活性或激發抗雌激素活性的化合物。
21.一種方法，包括以下步驟(a)使第一雌激素應答系統與待測化合物接觸；(b)使第二雌激素應答系統與該待測化合物接觸；(c)測量第一雌激素應答系統中DMBT1調控序列控制的基因表達，並測量第二雌激素應答系統中DMBT1調控序列控制的基因表達；和(d)將(i)第一雌激素應答系統中表達提高而第二雌激素應答系統中表達降低或表達檢測不到，或者(ii)第一雌激素應答系統中表達降低或表達檢測不到而第二雌激素應答系統中表達提高，與選擇性雌激素活性相互關聯。
22.一種方法，包括以下步驟(a)使第一雌激素應答系統與待測化合物接觸；(b)使第二雌激素應答系統與該待測化合物接觸；(c)測量第一雌激素應答系統中包含DMBT1調控序列控制的基因表達的第一雌激素作用；(d)測量第二雌激素應答系統中第二雌激素作用；和(e)將(i)第一雌激素應答系統中表達提高而第二雌激素應答系統中沒有雌激素作用或者有抗雌激素作用，或者(ii)第一雌激素應答系統中表達降低或無表達而第二雌激素應答系統中有雌激素作用，與選擇性雌激素活性相互關聯。
23.權利要求22的方法，其中所述第一雌激素應答系統是來自動物的雌激素應答組織或細胞，所述第二雌激素應答系統則不同於第一雌激素應答系統。
24.權利要求22的方法，其中所述第一雌激素應答系統包含的細胞中有一段核酸具有操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列，所述第二雌激素應答系統包含來自動物的雌激素應答組織或細胞。
25.權利要求22的方法，其中測量第二雌激素應答系統中另一雌激素作用包括測量細胞增殖或組織大小。
26.權利要求22的方法，其中測量第二雌激素應答系統中另一雌激素作用包括測量第二雌激素應答系統中產生的成分的量。
27.一種方法，包括以下步驟(a)使雌激素和孕酮應答系統與雌激素化合物接觸；(b)使雌激素和孕酮應答系統與待測化合物接觸；(c)得到相對於對照的顯示雌激素和孕酮應答系統中DMBT1調控序列控制的基因表達的信息；和(d)使用步驟(c)中得到的信息確定孕激素活性或者抗孕激素活性。
28.權利要求27的方法，其中步驟(c)包括測量相對於對照的該基因的表達，步驟(d)包括將表達下降與孕激素活性或抗孕激素活性相互關聯。
29.權利要求27的方法，其中所述雌激素和孕酮應答系統含有功能性雌激素受體和功能性孕酮受體。
30.權利要求27的方法，其中所述具有抗孕激素活性的待測化合物是孕酮受體調節劑。
31.權利要求27的方法，進一步包括測量不同於DMBT1調控序列控制的基因表達的孕酮應答作用的步驟。
32.一種方法，包括以下步驟(a)用能刺激受試者表達的DMBT1表達的化合物處理該受試者；(b)檢測受試者中DMBT1表達，以此作為雌激素作用的標記。
32.權利要求32的方法，其中步驟(b)包括測量相對於對照的受試者的DMBT1的表達。
33.權利要求32的方法，其中步驟(b)包括從受試者得到生物樣品並測量生物樣品中的DMBT1的表達。
34.一種雌激素應答系統，其中包含的核酸具有操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列。
35.權利要求34的系統，其中所述雌激素應答系統包含的細胞具有雌激素受體。
36.權利要求35的系統，其中所述細胞選自Ishikawa、MCF-7、MG63、HUVEC和SK-N-MC細胞。
37.權利要求36的系統，其中所述報告基因編碼的蛋白選自綠色螢光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、螢光素酶(luc)、氯黴素乙醯轉移酶(cat)、β-葡糖醛酸糖苷酶、新黴素磷酸轉移酶和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶。
38.權利要求37的系統，其中所述報告基因編碼螢光素酶。
39.權利要求34的系統，其中所述DMBT1調控序列包含SEQ IDNO.1的核苷酸840-872。
40.權利要求39的系統，其中所述DMBT1調控序列由來自SEQID NO.1的核苷酸1-2259的至少50個連續核苷酸組成。
41.一段分離的核酸，包含操作性連接到報告基因的DMBT1調控序列，其中所述DMBT1調控序列包含SEQ ID NO.1的核苷酸840-872。
42.權利要求41的分離的核酸序列，其中所述DMBT1調控序列能夠指導操作性連接於其上的基因的表達，並且與SEQ ID NO1中任何連續30-mer有至少85％的序列同一性。
43.權利要求41的分離的核酸序列，其中所述DMBT1調控序列由SEQ ID NO.1的核苷酸1-2259組成。
44.權利要求41的分離的核酸序列，其中所述DMBT1調控序列由SEQ ID NO.1的核苷酸840-872組成。
45.一種降低DMBT1的增量調控的方法，包括給予具有抗孕酮活性化合物和具有雌激素活性化合物的步驟。
46.一種鑑別具有雌激素活性化合物的方法，包括篩選DMBT1基因表達的增量調控。
47.一種鑑別具有抗孕酮活性化合物的方法，包括篩選降低DMBT1表達的化合物。
全文摘要
本發明提供了確定一種化合物所具有的雌激素活性的方法，包括使含有在DMBT1調控序列控制下的基因的雌激素應答系統，與待測化合物接觸，並確定該待測化合物如何影響該基因的表達。本發明進一步提供了確定一種化合物所具有的孕酮活性的方法，包括使含有在DMBT1調控序列控制下的基因的雌激素和孕酮應答系統，與雌激素活性化合物和待測化合物接觸，並確定該待測化合物如何影響該基因的表達。也提供了可有效用於這些方法的核酸和基於細胞的系統，該系統包含DMBT1調控序列的一部分。
文檔編號A61K31/56GK101072590SQ200480035474
公開日2007年11月14日 申請日期2004年10月1日 優先權日2003年10月3日
發明者G·阿倫, S·H·泰南, J·－Z·郭, E·帕西亞, S·倫迪恩 申請人:詹森藥業有限公司