蛋白在基因修飾真菌中的表達的製作方法

2023-06-11 15:25:06 2

專利名稱：蛋白在基因修飾真菌中的表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過真菌的基因修飾來提高目的蛋白的產量。此外，本發明還涉及新型的基因重組物，含有這些構建物的真菌，其蛋白產量明顯地增加。
背景技術：
真菌表達體系在生產目的蛋白中的應用在本領域是眾所周知的。例如，真菌表達體系中生產的外源蛋白已應用於生物量的轉化、洗滌劑、纖維素酶底物的去皮，以及其他工業酶。其他目的外源蛋白，例如食品添加劑或補充劑、藥物化合物、抗體、蛋白試劑等，以及工業用蛋白都可用真菌表達體系生產。
很多微生物產生水解纖維素的酶，包括腐木菌木黴屬(Trichoderma)，複合細菌嗜熱單孢屬(Thermomonospora)，桿菌屬(Bacillus)，和纖維單孢屬(Cellulomonas)；鏈黴菌屬(Streptomyces)，以及真菌腐質黴屬(Humicola)、麴黴屬(Aspergillus)和鐮刀黴屬(Fusarium)。這些微生物所產生的酶是蛋白混合物，並以三種作用方式參與纖維素向葡萄糖的轉化，例如葡聚糖內切酶(EG)、纖維二糖水解酶(CBH)，和β-葡萄糖苷酶。EG和CBH酶總稱為「纖維素酶」。EG酶在隨機位置切斷纖維素聚合物，直至可被CBH酶作用。舉例來說，木黴株產生至少四種不同的EG酶，已知為EGI、EGII、EGIII和EGV。CBH酶連續將纖維二糖分子從纖維素聚合物的末端釋放出來。纖維二糖是水溶性的β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。木黴中有兩種主要的CBH酶，CBHI和CBHII。β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。木黴產生一種葡萄糖苷酶。
上述β-葡萄糖苷酶催化的纖維素水解的最後一步是重要的一步，因為葡萄糖容易通過各種酵母發酵為乙醇，而纖維二糖不能發酵為乙醇。水解結束後殘留的纖維二糖表示損失的乙醇產量。更重要的是，纖維二糖是CBH和EG酶的很強的抑制劑。纖維二糖濃度僅為3.3g/L時，即可使木黴CBH和EG酶的水解速度降低50％。由於水解速度的降低，必須加入更多的纖維素酶，這樣反過來又影響了整個工藝的經濟性。因此，生產乙醇時，水解過程中的纖維二糖的蓄積是很不希望出現的。
因為木黴和其他產生纖維素酶的微生物只產生很少的β-葡萄糖苷酶，所以在酶催化的水解過程中纖維二糖的積蓄成為主要問題。β-葡萄糖苷酶佔木黴產生的總蛋白的1％以下。低水平的β-葡萄糖苷酶量導致缺乏將纖維二糖水解為葡萄糖的能力，並且在水解過程中，纖維二糖的積蓄量可達到10～20g/L。這種高水平的纖維二糖使纖維素酶的需要量比含有適當量的β-葡萄糖苷酶時增加了10倍。
現已提出了幾種方法來克服纖維素酶中β-葡萄糖苷酶的不足。
一種途徑是用產生少量纖維素的微生物來生產β-葡萄糖苷酶，並將這種外源的β-葡萄糖苷酶加入纖維素酶中，提高其水解能力。產生這種β-葡萄糖苷酶的微生物中最成功的是黑麴黴(Aspergillusniger)和海棗麴黴(Aspergillus phoenicis)。來源於這些微生物的β-葡萄糖苷酶市售品如Novo Nordisk生產的Novozym188，但是，作為乙醇生產過程的商業化生物質，所需量的成本太高。
克服β-葡萄糖苷酶不足的第二種途徑是纖維素的水解與葡萄糖的酵母發酵同時進行，即所謂的同時糖化和發酵(SSF)方法。在SSF系統中，葡萄糖的發酵可將其本身從溶液中除去。葡萄糖是強的β-葡萄糖苷酶的抑制劑，因此，SSF的目的是增加β-葡萄糖苷酶的效率。然而，SSF系統尚未實現商業化，因為纖維素酶要求的溫度條件為50℃，對此來說，酵母的作用溫度28℃太低了；採用折衷溫度37℃則效率很低，且容易造成微生物汙染。
克服β-葡萄糖苷酶不足的第三種途徑是採用基因工程的方法使該酶過表達，並增加木黴的β-葡萄糖苷酶的產量。這種方法已被Barnett、Berka和Fowler採用，例如「Trichoderma reesi胞外β-葡萄糖苷酶基因的克隆和擴增纖維質底物糖化方法的檢驗或改良評估」Bio/Technology，Vol.9，1991.6，p.562-567，在此稱為「Barrett等」；以及Fowler、Barnett和Shoemaker的WO92/10581「Trichoderma reeseiβ-葡萄糖苷酶基因的克隆和擴增，以及纖維素的改良糖化方法」，在此稱為「Fowler等」。
Barnett等和Fowler等都描述了將多拷貝的β-葡萄糖苷酶基因導入Trichoderma reesei(以下，也可略作T.reesei)株P40中。兩個研究小組均構建了質粒pSASβ-glu，該質粒為含有T.reesei基因組β-葡萄糖苷酶基因和amd S標記篩選的轉化載體。amd S基因來源於構巢麴黴(Aspergillus nidulans)，並編碼乙醯胺酶，它可使轉化細胞在以乙醯胺為唯一氮源的培養基上生長。T.reesei不具有與amd S基因等同的功能，因此不能利用乙醯胺作為氮源。該轉化細胞含有10-15個β-葡萄糖苷酶基因的拷貝，其產生的β-葡萄糖苷酶比未轉化的細胞高出5.5倍。
Barnett等和Fowler等所獲得的β-葡萄糖苷酶產量的提高並不能緩解其在纖維素水解中的不足。天然木黴株的β-葡萄糖苷酶產量，舉例來說，必須增加至少10倍才能滿足纖維素水解的需要。
在木黴中過表達蛋白時，一種策略是將目的基因直接與cbh1啟動子或cbh1分泌信號連接。因為CBH1是木黴在纖維素酶的誘導條件下產量最豐富的蛋白，所以認為cbh1啟動子和分泌信號在指導蛋白的轉錄和分泌中是非常有效的，該蛋白由基因重組物中位於上述啟動子和分泌信號之後的基因編碼。這種策略已成功地應用於過表達木黴和其他微生物蛋白(「在Trichoderma reesei中表達Trichoderma harzianum內切殼聚糖酶以及該內切殼聚糖酶的改良生產方法」Margolles-Clark，Hayes，Harman and Penttila，Appl.Environ.Microbiol.62(6)2145-2151，1996；「Trichoderma reesei和Hormoconis resinae葡糖澱粉酶P(gamP)基因的轉化異源葡糖澱粉酶在Trichoderma reesei中的生產」Joutsjouki，Torkkeli and Nevalainen，1993，Curr.Genet.24223-228；「Trichoderma reesei中高頻一步基因置換1.葡聚糖內切酶I的過剩生產」Karhunen，Mantyla，Nevalainen and Suominen，1993，Mol.Gen.Genet.241515-522)。
另一個用真菌表達系統生產的工業酶的例子是木聚糖酶。某些商業上最重要的木聚糖酶屬於木聚糖酶家族11。如果某種木聚糖酶具有家族11共有的胺基酸，包括兩個作為必要的催化殘基的谷基酸殘基，則可將這種木聚糖酶屬於家族11。按Trichoderma reesei的木聚糖酶II編號，這些殘基為86位和177位胺基酸。木聚糖酶家族11共有的胺基酸記載於Wakarchuck，et al，Protein Science 3467-475(1994)。
藥學上重要的外源蛋白的表達，例如對胰島素(Goeddel D.V.etal.，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.76 106-110)和凝血因子Xa(Smith D.B.1988，Gene 6731-40)用細菌表達體系的表達已有報導。與此類似，U.S.4,751,180公開了在酵母中表達外源蛋白，其中包括胰島素和IgF-2。
已有報導用絲狀真菌Trichoderma reesei生產外源的牛凝乳酶原(Harkki A.et al.，1989，Bio/Technol.7596-603)，其基因重組物包括cbh1(纖維二糖水解酶I基因)調控區和終止子、cbh1或凝乳酶信號序列，以及也可包括cbh1的間插區。Margolles-Clark E等(1996，App Environ Microbiol.，622152-2155)公開了用Trichoderma reesei的cbl1啟動子來表達T.haraianum的內切殼多糖酶。同樣，目的蛋白例如凝乳酶也已用絲狀真菌構巢麴黴和泡盛麴黴(A.awamori)生產，其所用的基因重組物包括glaA(葡糖糖化酶)基因的調控區和分泌信號、glaA或凝乳酶的信號序列，以及葡糖糖化酶(EP 215,594)的間插區。在後面的兩鍾情況中，蛋白產物在宿主中的轉錄不是外源蛋白生產的限制因素。但是，分泌到宿主體外的蛋白產物量低，從而造成胞外蛋白的收率很低。
在試圖增加絲狀真菌表達體系生產的外源蛋白在胞外的蓄蓄積量方面，Lawlis(1997，US 5,679,543)公開了採用多組分的融合多肽來增加目的蛋白的分泌和在胞外的蓄積。該基因重組物是編碼包括4個部分的融合蛋白的複合物，4個部分包括信號肽、分泌多肽或其部分(載體蛋白)、可斷裂的接頭多肽以及所需表達的目的多肽。蛋白分泌水平的提高歸結於將glaA信號序列與全長糖化酶(載體蛋白)的融合，或是與其他在宿主內分泌的蛋白融合，融合產物然後進一步與可斷裂的接頭以及目的蛋白(凝乳酶)融合。已發現在真菌構巢麴黴中進行表達時，這種基因重組物增加了融合多肽的分泌。
雖然在US 5,679,543中提到採用該4組分的融合蛋白可增加分泌水平，但這種表達載體的生產是複雜的。這種表達體系要求採用6部分的基因重組物，由此基因重組物來表達含有4-部分蛋白產物、表達蛋白和各種載體蛋白的複合物。此外，因為表達蛋白中包含了載體蛋白，所以目的表達產物中約有50％不能回收，同時，目的蛋白的表達後處理和純化還導致了成本增加。為了回收最終的目的蛋白產物，還需要進行重要的分泌後加工，其中包括接頭的去除和培養基的酸化。
在本領域需要有一種簡單的系統，該系統能使目的蛋白在宿主細胞中高水平地表達和分泌。該系統中所用的基因重組物中優選包含較少的組成部分，以便於製備嵌合結構。而且，採用這種基因重組物時表達和分泌水平必須要高，同時還優選在回收目的蛋白時不需要或少需要下遊操作。
本發明的目的是克服現有技術的缺點。
結合本發明的主要權利要求、從屬權利要求的特徵，以及由這些特徵引申出的本發明的實施方案，則可達到上述目的。
發明的概述本發明涉及通過真菌的基因修飾來提高目的蛋白的產量。此外，本發明還涉及新型的基因重組物，含有這些結構的真菌，其蛋白產量和分泌量都明顯地增加。本發明的基因重組物可在真菌表達體系中增強目的蛋白的生產。
能達到上述目的的基因重組物中包含以下DNA序列。該DNA序列包括一個以上的調控元件，以及與該調控元件相連並受該調控元件調控的編碼木聚糖酶分泌信號以及目的蛋白的核苷酸序列，此外還可含有編碼間插區的核苷酸序列。
本發明涉及的核苷酸序列包括調控區，以及與該調控區相連並受該調控區調控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產是非正常關聯。本發明的一個實施方案是針對於上述定義的核苷酸序列，其中的調控區選自cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2。
本發明也涉及上所定義的核苷酸序列，其中的目的基因選自編碼某種蛋白的基因，這種蛋白可用於醫藥、營養品、工業產品、動物飼料、食品添加劑或酶。優選該目的基因編碼某種酶，這種酶選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶、蛋白酶、果膠酶和過氧化物酶。
以上所定義的本發明的核苷酸序列，還可進一步包含間插序列。
本發明也涉及包含以上定義的核苷酸序列的載體，以及含有該載體的轉化絲狀真菌。本發明還涉及含有上述定義的核苷酸序列的絲狀真菌。優選的轉化絲狀真菌選自木黴屬(Trichoderma)、腐質黴屬(Humicola)、鐮刀黴屬(Fusarium)、麴黴屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、疣孢黴屬(Mycogone)、輪枝孢屬(Verticillium)、鏈黴屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢黴屬(Neurospora)、灰側耳菌屬(Pleurotus)、青黴屬(Penicilium)、頭孢屬(Cephalosporium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚黴屬(Papulospora)、綿黴屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內座殼屬(Endothia)、毛黴屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢黴屬(Pyricularia)、青黴屬(Penicillum)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、耙菌屬(Irpex)、葡萄穗黴屬(Stachybotrys)、帚黴屬(Scorpulariopsis)、毛殼黴屬(Chaetomium)、粘帚黴屬(Gilocladium)、頭孢黴屬(Cephalosporin)、支頂孢屬(Acremonium)。
本發明包含在絲狀真菌中生產目的蛋白的方法。該方法包括用一種核酸序列轉化絲狀真菌，該核酸序列包括調控區，與該調控區相連並受該調控區調控的木聚糖酶分泌序列以及目的基因，其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產是非正常關聯，以及其中的木聚糖酶分泌序列與該絲狀真菌是異源或同源；培養該絲狀真菌，並促使該絲狀真菌生產目的蛋白。此外，本方法還涉及目的蛋白的純化。
本發明的目的在於，提供在絲狀真菌中生產目的蛋白的方法。該方法包括，用一種核酸序列轉化絲狀真菌，該核酸序列包括調控區，與該調控區相連並受該調控區調控的木聚糖酶分泌信號、間插序列和目的基因，其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶的生產是非正常關聯，以及其中的木聚糖酶分泌序列與該絲狀真菌是異源或同源；培養該絲狀真菌，並促使該真菌生產目的蛋白。本方法還涉及目的蛋白的純化。此外，可以除去目的蛋白中由間插序列編碼的胺基酸序列。
本發明還涉及由上述方法生產的蛋白。
按照本發明的方法，採用木聚糖酶分泌信號使一些目的蛋白的表達和分泌水平高於採用現有技術中所用的分泌信號，例如cbh1分泌信號。因為木聚糖酶在木黴所產的總蛋白中所佔的比例比CBH1小得多(分別為5％和60％)，人們可能預計cbh1的分泌信號會更有效，然而，情況不是如此。而且，木聚糖酶分泌信號在數種宿主的表達體系中提高了蛋白的產量。
本發明的概述不必描述本發明所有的必需特徵，但將所述特徵的再組合後也可體現本發明的一些特點。
由以下詳述的優選實施方案及附圖會對本發明的其他方面更為了解，其優點也會更為明顯。
附圖的簡單說明


圖1載體pCBG1-TV的限制性酶圖譜，以及CBH1分泌信號/成熟β-葡萄糖苷酶接合點的胺基酸序列(參見實施例5)。
圖2載體pXBG1-TV的限制性酶圖譜，以及木聚糖酶II分泌信號/成熟β-葡萄糖苷酶接合點的胺基酸序列(參見實施例6)。
圖3載體pC/XBG(Xbal)-TV限制性酶圖譜，以及木聚糖酶II分泌信號/成熟β-葡萄糖苷酶接合點的胺基酸序列(參見實施例7)。
圖4由T.reesei株RutC30和M2C38分離的基因組DNA的Southern印跡結果，所用探針為含有M2C38木聚糖酶啟動子和分泌信號的、標記的DNA片段。
圖5由T.reesei株RutC30和M2C38分離的基因組DNA的Southern印跡結果，所用探針為含有M2C38的成熟β-葡萄糖苷酶編碼區的、標記的DNA片段。
圖6eg2表達載體pEG2-TV(圖6a)和pC/XREG2-TV(圖6b)的示意圖，如實施例23所述，該載體包含xln2分泌信號。
圖7實施例27所述的man1表達載體pCMAN-TV(圖7a)的示意圖，圖7b表示pXMAN-TV的示意圖；圖7c表示pC/XMAN-TV(圖7c)的示意圖，兩者均含有xln2分泌信號。後兩種載體描述於實施例28中。
圖8含有eg2的表達載體的示意圖，該eg2由Humicol ainsolens獲得。圖8a表示pChHE2-TV；圖8b表示pC/XhHE2-TV，含有xln2分泌信號，兩者均在實施例30中有所描述。
圖9漆酶I(lcc1)表達載體的示意圖。圖9a表示pCL1-TV；圖9b表示pC/XL1-TV，含有xln2分泌信號，兩者均在實施例32中有所描述。
圖10實施例34所述的含有木聚糖酶的表達載體(pC/XHTX4-TV)的示意圖。
優選實施方案的詳細說明本發明涉及通過真菌的基因修飾來提高目的蛋白的產量。此外，本發明涉及新型的基因重組物，含有該結構的真菌，其蛋白產量顯著增加。
以下僅以舉例的方式描述優選的實施方案，而不限制本發明所必需的特徵的組合。
本發明中所描述的真菌基因修飾是用新型基因重組物表達目的基因。該目的基因編碼在宿主內高水平表達的目的蛋白，並進而將其從該宿主中釋放出來。優選的表達宿主為絲狀真菌。絲狀真菌的特徵是營養菌絲體，營養菌絲體的細胞壁含有複雜的多糖，包括殼多糖和纖維素。營養體生長通常通過菌絲的伸長而進行。可用於本發明的絲狀真菌包括木黴屬(Trichoderma)、腐質黴屬(Humicola)、鐮刀黴屬(Fusarium)、麴黴屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、疣孢黴屬(Mycogone)、輪枝孢屬(Verticillium)、鏈黴屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢黴屬(Neurospora)、灰側耳菌屬(Pleurotus)、青黴屬(Penicillum)、頭孢屬(Cephalosporium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚黴屬(Papulospora)、綿黴屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內座殼屬(Endothia)、毛黴屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢黴屬(Pyricularia)、青黴屬(Penicillum)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、耙菌屬(Irpex)、葡萄穗黴屬(Stachybotrys)、帚黴屬(Scorpulariopsis)、毛殼黴屬(Chaetomium)、粘帚黴屬(Gilocladium)、頭孢黴屬(Cephalosporin)、支頂孢屬(Acremonium)，但不限於這些。
絲狀真菌的轉化方法在本領域是已知的(例如EP 870,835；U.S.5,863,783；Camels T.et al.Curr.Genet.，1991，20309-314；Lorito etal.，1993，Curr.Genet.24349-356；Goldman et al.，1990，Curr.Genet.17169-174；Penttila et al.，1987，Gene 6155-164；Yelton et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474；Bajar et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212；「鏈黴菌的基因操作實驗手冊」Hopwood et al.，1985，The John Innes Foundation，Norwich，UK；所有上述文獻在此均作為參考引入)。
本發明的基因重組物通常包含調控區，與該調控區相連並受該調控區調控的分泌信號和目的基因，以及包含其他需要加入的元件，例如終止子序列，篩選標記等。如果需要，在分泌信號和目的基因之間可插入間插序列。調控區
「調控區」或「調控元件」通常是指基因上遊的一部分核酸，這部分核酸通常由DNA組成，但也並非總是如此。調控元件包括啟動子元件、基本(核心)啟動子元件、可被外部刺激物誘導的元件、啟動子活性介導元件，例如負調控元件或轉錄增強子。此處所用的調控元件也包括轉錄活性調控元件，例如調整基因表達的調控元件，這其中包括翻譯和轉錄增強子、翻譯和轉錄阻遏子、上遊激活序列和mRNA不穩定效應物。後面的幾種元件可位於靠近編碼區的位置。本發明的上下文中，術語「調控元件」或「調控區」通常是指結構基因的編碼序列上遊(5′)的DNA序列，該序列通過提供被RNA聚合酶和/或其他轉錄起始所需的因子識別的某一特定位置，對編碼區的表達進行調整，但並非總是如此。但是，其他核酸序列，例如位於3′端的序列，但不僅限於此，也可能對目的編碼區的表達起調控作用。為RNA聚合酶或其他轉錄因子提供識別部位並保證轉錄在某一特定位置起始的調控元件的例子是啟動子元件。啟動子元件包括負責轉錄起始的基本啟動子元件，以及修飾基因表達的其他調控元件(如以上所列出的)。
本發明所用的調控元件包括發育調控的、可誘導的和組成型調控元件。發育調控或對受其調控的基因的差異表達進行調控的調控元件，在宿主的發育期間的特定時間內是活化的。可誘導的調控元件受誘導劑誘導時，能直接或間接地激活一種以上DNA序列或基因的轉錄。誘導劑不存在時，DNA序列或基因不能轉錄。通常，與可誘導的調控元件特異結合以激活轉錄的蛋白因子是以失活的形式而存在，然後直接或間接被誘導劑轉換為激活的狀態。誘導劑可以是化學試劑，例如蛋白、代謝物或其他化學試劑。組成型的調控元件在宿主體內以連續的方式指導基因的表達。
現已克隆了很多合適的調控元件，並對其特性作了鑑定，如本文所述，這些元件可用來驅動目的基因在真菌宿主中的表達。例如，不受任何形式的限制，現已克隆了幾種基因及其關聯的調控區。T.reesei的EGIII(Saloheimo M et a.，1988，Gene 6311-21)，木聚糖酶xln2(Saarelainen et al.，Mol.Gen.Genet.241497-503，1993)。其他用於目的外源基因表達的調控區在本領域也是已知的。例如，不受任何方式的限制，組成型啟動子pgk(磷酸甘油酸激酶；Vanhanen et al.，Gene 106129-133，1991)；T.reesei的組成型啟動子pki(Carmen LM et al.，1999，phytopathol.892554-261)；米黑毛黴(Mucor miehei)的羧基蛋白酶的調控區(U.S.5,679,543)；曲酶的gla A(澱粉葡萄糖苷酶)(Cullen D.et al.，1987，Bio/Technol.5713-719)、gpd(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)(Deane et al.，1999，Enzyme and Microbial Tech.Vol.24，pp.419-424；Pentilla et al.，1987，Gene Vol.61，pp.155-164)；構巢麴黴的tpiA(McKinight，G.L.et al.，1986，Cell 46143-147)；麴黴的alcA(Lockington，P.A.，et al.，1986，Gene 33137-149)、米麴黴的amy(α-澱粉酶)(Christensen T.et al.，1988，Bio/Technol.61419-1422)；T.reesei的Trl(Camels et al.，1991，Gurr Gent.Vol.20，pp.309-314)、T.reesei的cbh1(Harkki，A.et al.，1989，Bio/Technol.7596-603)；黑麴黴(Aspergillus niger)糖化酶的調控區(Nunberg J.H.et al.，1984，Mol.Cell.Bio.42306-2315；Boel E.et al.，1984，EMBO J.，31581-1585)；構巢麴黴的trpC(Yelton M.et al.，1984，Proc.Nat.Acad.Sci.811470-1474)、構巢麴黴的xln1或xln2(Torronen et al.，1992，Bio/Technol.101461-1465)或amdS(Hynes M.J.，et al.，1983 Mol.Cell.Genet.19937-45)。外源調控元件的應用在U.S.5,863,783中已有描述，包括xlnA、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶亞基9(oliC)、tpi(磷酸丙糖異構酶)、adh(乙醇脫氫酶)、amy、glaA、乳糖酶和gpd。
對基因重組物中調控元件的選擇並不限制本發明的實際應用。但是，優選的調控元件為cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2。T.reesei cbh1的DNA序列已存儲在基因庫中，登記號為D86235。
本領域的技術人員懂得，可通過置換、取代、附加或缺失一個或一個以上核苷酸對天然的調控元件進行修飾，而不改變其功能。本發明的實踐包含這種對啟動子的改變，但不會受其約束。分泌信號「分泌信號」亦可稱為「分泌序列」，用於促使宿主產生的目的蛋白定位在胞外。如本文所述，優選的分泌信號是來源於木聚糖酶的木聚糖酶分泌信號。木聚糖酶分泌信號是編碼木聚糖酶分泌信號肽的DNA序列。木聚糖酶分泌信號肽(或分泌肽)是存在於編碼的木聚糖酶氨基末端的肽序列，該序列隨後在將成熟的木聚糖酶運出宿主細胞期間被除去。該分泌信號可包含肽原、前肽或兩者。
在一個優選的實施方案中，木聚糖酶分泌信號包含11家族木聚糖酶基因的木聚糖酶分泌信號。在更優選的實施方案中，11家族木聚糖酶基因是木黴的木聚糖酶基因。在進一步優選的實施方案中，木聚糖酶分泌信號包含木黴木聚糖酶I(xln1)基因或木聚糖酶II(xln2)基因的木聚糖酶分泌信號。木黴xln1和xln2分泌信號的DNA序列分別見「T.reesei的兩種主要木聚糖酶酶和基因特性的鑑定」的圖3和2中(Torronen，Mach，Messner，Gonzalez，Kalkkinen，Harkki，and Kubicek，Bio/Technology 101461-1465，1992)(發表的圖例中，基因鑑定結果是顛倒的)。
本領域的技術人員懂得，通過置換、取代、附加或缺失天然分泌信號中的一個或更多個核酸，可對其進行修飾而不改變其功能。本發明的實踐包括這種對木聚糖酶分泌信號的改變，而又不受這種改變的約束。間插區在信號序列和目的基因之間的間插區，可以插入其他的核苷酸序列。插入這些序列的目的有很多，例如為了增加前導肽的長度，使目的基因易於插入基因重組物中，提高目的蛋白的表達水平，增加目的蛋白從宿主輸出的量(例如U.S.5,679,543)，或有助於目的蛋白的純化，例如用親合色譜或其他本領域中為大家所熟知的方法。前導序列的長度可以不同，由幾個胺基酸至該宿主分泌蛋白的胺基酸序列。此外，該前導序列也可編碼一些胺基酸，這些胺基酸有助於通過可斷裂的接頭分離目的蛋白。如果間插區含有影響目的蛋白活性的前導肽，含有用於蛋白純化的親合標記，或者如果該前導肽過長，則需要採用可斷裂的接頭。這種可斷裂的接頭在本領域是為大家所熟知的，例如可被溴化氰切斷的胺基酸，但不限於蛋氨酸；或者是已知可被蛋白酶切斷的胺基酸，例如可被胰蛋白酶、膠原酶、梭菌蛋白酶、酵母的KEX2蛋白酶、Xa因子、枯草蛋白酶(例如Martson F.A.O.1986，Biol.Chem J.2401-12)切斷的胺基酸，但不僅限於這些蛋白酶。但是，本發明的基因重組物也可不含有這種間插序列。
如
圖1-3和6-9所示，實施例5-7、23、27、28、30和32中所述的基因重組物中含有附加9個的鹼基對的DNA序列；前3個編碼T.reesei木聚糖酶II基因分泌信號之後的穀氨醯胺殘基，其餘6個鹼基對為插入和/或修飾的單一限制性內切酶位點，用於連接木聚糖酶分泌信號和編碼目的蛋白的核苷酸序列。這些DNA序列使木聚糖酶分泌信號肽和目的蛋白之間產生附加的胺基酸。相應於該基因重組物編碼的木聚糖酶分泌信號或用於連接木聚糖酶分泌信號序列與目的基因的限制性酶切位點，這些DNA序列可以是天然的或合成的，並編碼成熟木聚糖酶中一個或更多個胺基酸。如上所述，間插序列也可包含編碼被蛋白酶識別的胺基酸序列或前導序列。本發明的實踐包括在木聚糖分泌信號與成熟β-葡萄糖苷酶編碼區之間存在附加的DNA序列，但並不僅限於此。目的基因「目的基因」是指在轉化宿主中表達的任何基因。目的基因包含編碼目的蛋白的核酸序列。目的蛋白可以包括有藥學活性的蛋白，例如生長因子、生長調控劑、抗體、抗原、可用於免疫或疫苗接種等的抗原衍生物、白細胞介素、胰島素，G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它們的組合物，幹擾素α、幹擾素β、幹擾素τ等幹擾素，凝血因子如因子VIII、因子IX、tPA或它們的組合物，但不限於此。目的基因也可編碼工業酶，例如用於紙漿和紙、紡織品改良，或乙醇生產的酶。目的基因也可編碼蛋白添加劑、營養品，或用於動物飼料、食物，或飼料和食品兩者的加值產品。這類蛋白的例子包括酶、蛋白酶、氧化酶、肌醇六磷酸酶、殼多糖酶、甘露聚糖酶、漆酶、轉化酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶、果膠酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶等，但不限於此。目的蛋白的類似物也可用本發明的嵌合基因重組物表達。這些類似物的特徵通常是其胺基酸序列有改變，例如插入、缺失、或其他變異如等位變異等。
本發明進一步的目的是含有目的DNA的嵌合基因重組物，該目的DNA與本發明的調控元件和分泌序列連接並受調控元件的調控。按照本發明，任何目的基因都可採用並進行操作，以使該目的蛋白得到表達。其他元件本發明的基因重組物中，在緊接著編碼目的蛋白的核苷酸序列下遊可含有轉錄終止子。如本領域技術人員所知，任何合適的轉錄終止子都可採用。本發明的實踐對所用轉錄終止子沒有限制。轉錄終止子的例子不受任何限制，可以是任何目的基因下遊的終止子。本領域的技術人員很容易獲得合適的終止子，至少可從上述鑑定的基因獲得(參見「調控區」)。
對實施例5-7、23、27、28、30、32和34中所述的終止子並沒有任何限制，這些終止子由位於木黴cbh2基因終止密碼子3′端的1.9kb的DNA構成。T.reesei cbh2轉錄終止子的前553個鹼基對的DNA序列已公開，該序列緊接TAA終止密碼子的下遊(或3′端)(參見「T.reesei纖維二糖水解酶II的核苷酸序列及推測的一級結構」的圖2，Chen，Gritzali and Stafford，Bio/Technology 5274-278，1987)。此外，也可使用其他終止子序列，例如實施例23、27和28(圖6a和7a-c)所述的cbh1、xln2的終止子序列，但也不限於此。
本發明的基因重組物中含有篩選標記，該標記可位於同一質粒載體中基因重組物的上遊或下遊(例如，在該結構的5′端或3′端)，或位於與該基因重組物不同的質粒載體中並共轉化。篩選標記的選擇對本領域的技術人員來說是熟知的，篩選標記包括能給予轉化細胞利用不是此微生物正常代謝產生的代謝物的能力(例如，編碼乙醯胺酶的構巢曲酶amd S基因，它能使轉化細胞具有在乙醯胺為唯一氮源的培養基上生長的能力)的基因(合成或天然的)，或者是使轉化細胞具有抗生素抗性的基因(例如，編碼潮黴素β-磷酸轉移酶的大腸桿菌hph基因，它能使轉化細胞具有潮黴素抗性)。如果宿主菌缺少與篩選標記相應的功能基因，那麼該基因就可用作標記。這類標記的例子包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等，相應的宿主菌應沒有與此篩選標記相應的功能基因，即，trp、pyr、arg、leu等。實施例5-7、27和28中所述的用於基因重組物中的篩選標記是木黴磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子表達的大腸桿菌hph基因。在實施例23、30和32中(圖6b、8a、8b、9a和9b)記載了pyr4的應用。
大腸桿菌hph基因的DNA序列可參見文獻「質粒編碼的潮黴素B抗性潮黴素B磷酸轉移酶基因的序列及其在大腸桿菌和啤酒酵母中的表達」的圖4(Gritz and Davies，Gene 25179-188，1983)T.reesei的pgk啟動子的DNA序列可參見文獻「Trichoderma reesei的3-磷酸甘油酸激酶的編碼基因(pgk1)的啟動子結構和表達」的圖2(Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，Gene 106129-133 1991)。
因此，本發明的基因重組物包含調控區，以及與該調控區相連並受該調控區調控的木聚糖酶分泌序列和目的基因。其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產是非正常關聯。
迄今為止所描述的本發明的一個實施方案中包括β-葡萄糖苷酶基因重組物。本發明的實踐不受製備該重組物的方法所約束，該方法包括標準的分子生物學技術，例如用鹼裂解法從大腸桿菌中分離質粒DNA，用限制性內切酶消化質粒DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離和回收DNA片段，用T4 DNA連接酶連接DNA片段，通過聚合酶鏈反應或加入寡核苷酸接頭在DNA片段末端插入單一的限制性酶切位點，以及用T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段補平DNA片段末端，但不限於此。
實施例1-7描述了製備上述基因重組物的步驟。
本發明還公開了以下基因重組物(表達載體)的製備方法。例如T.reesei和H.insolens的葡聚糖內切酶II、eg2(實施例4和30)、甘露聚糖酶、man1(實施例27和28)、漆酶、lcc1(實施例34)和木聚糖酶(實施例38)。實施例25，29，31和33中描述了這些目的蛋白中的幾種在T.reesei中的表達。在實施例38中描述了目的蛋白在Humicola insolens中的表達。
在本發明的另一個實施方案中，在真菌宿主中導入編碼β-葡萄糖苷酶、葡聚糖內切酶II、甘露聚糖酶、漆酶或木聚糖酶的基因重組物並進行表達，進而製成基因修飾的微生物。相對於未轉化的微生物宿主，或者與含有表達基因固有內源分泌信號的轉化宿主比較，上述基因修飾的微生物提高了目的蛋白的生產水平。對所有檢測的目的蛋白和所有檢測的宿主來說，含有木聚糖酶分泌信號的嵌合基因重組物都能增加從宿主分離出來的目的蛋白量。例如，不受限制條件來考慮，相對於未轉化的微生物宿主來說，可看到β-葡萄糖苷酶提高的水平優選為至少約10倍，更優選為至少約40倍，最優選為至少約120倍。用其他目的蛋白也可觀察到表達水平的提高(分別參見實施例25、29、33和38的葡聚糖內切酶II、甘露聚糖酶、漆酶和木聚糖酶)。
本發明中包括將含有目的基因的基因重組物導入本領域技術人員熟知的微生物宿主的任何方法，這些方法包括用氯化鈣處理細菌細胞或真菌原生質體，使其細胞膜變得脆弱；加入聚乙二醇使細胞膜融合；用電穿孔法使細胞膜去極化；土壤桿菌介導的轉化；用粒子槍等通過微粒轟擊，使DNA穿過細胞壁和膜等；但不限於此。絲狀真菌的轉化方法已有文獻報導(如EP 870,835；U.S.5,863,783；Camels T.et al.，Curr Genet.，1991，20309-314；這些文獻都在此作為參考引入)。
實施例9、20和35描述了用粒子槍將β-葡萄糖苷酶基因重組物導入木黴或Humicola insolens孢子中的方法。
與未轉化的微生物宿主相比，β-葡萄糖苷酶的產量增加了10倍以上，這比天然變異的菌株高出很多並表明產量得到了顯著增加，並且在商業上具有重要的意義。採用這種方法，β-葡萄糖苷酶增加的程度可高達136倍，並能達到1000倍以上。如實施例11所述，測量β-葡萄糖苷酶產量增加程度的方法時使培養物生長，並測定β-葡萄糖苷酶的活性。
本領域的技術人員知道，酶混合物的β-葡萄糖苷酶比活性(IU/mg蛋白)可通過降低酶混合物中的纖維素酶和其他蛋白的量來提高。通過物理和機械方法將酶混合物分離，或通過基因重組方法使纖維素酶或其他基因缺失，則可達到上述目的。用微生物實際生產β-葡萄糖苷酶的過程中，這種方法效果很小或是無效。但是根據需要，本發明的實踐中可包括這些步驟。
實施例25、29和33描述了採用本發明的嵌合基因重組物過表達葡聚糖內切酶II、甘露聚糖酶和漆酶。在所有情況下都觀察到目的蛋白生產水平的提高，該提高的範圍為3-10倍或更多，並且活性超過未轉化的宿主。實施例30和31描述了H.insolens葡聚糖內切酶II在T.reesei中的生產，同樣也獲得葡聚糖內切酶II生產水平提高的結果。
實施例34-38描述了T.reesei木聚糖酶的生產，以及其在H.insolens中的表達。這些實施例表明，非天然的啟動子和分泌信號在異源絲狀真菌中是有活性的，同時也表明這些元件促進了在異源宿主內有活性的目的基因的表達。在這些實施例中，目的基因可從木黴獲得，並能編碼木聚糖酶，該目的基因與同樣來源於木黴的木聚糖酶分泌信號融合。此融合核酸序列受同樣也是來源於木黴的cbh1啟動子的調控。最終的重組物用來轉化腐質黴屬H.insolens。對目的基因在轉化的和未轉化H.insolens中的活性進行了測定(參見實施例38)，結果表明來源於木黴的cbh1啟動子和木聚糖酶分泌信號在H.insolens中具有活性。此外，與未轉化宿主表達的內源活性相比，轉化宿主產生的活性增加了2-2.5倍。該實驗結果表明，來源於一種絲狀真菌的非天然啟動子和分泌信號在另一種絲狀真菌中是有活性的。
因此，本發明的目的是用任一絲狀真菌表達目的基因，並生產目的蛋白。例如，不受任何方式的限制來考慮，宿主可選自木黴屬(Trichoderma)、腐質黴屬(Humicola)、鐮刀黴屬(Fusarium)、麴黴屬(Aspergillus)、鏈黴屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢黴屬(Neurospora)、灰側耳菌屬(Pleurotus)、青黴屬(Penicillum)、頭孢屬(Cephalosporium)、綿黴屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內座殼屬(Endothia)、毛黴屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢黴屬(Pyricularia)。適合宿主的選擇取決於所要生產的目的蛋白。將DNA重組物導入木黴中的方法有文獻報導(「Biolistic Transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladiumvirens using plasmid and genomic DNA」Lorito，Hayes，Dipietro andHarman，Curr.Genet.24349-356 1993；「用高壓電脈衝法轉化Trichoderma harsianum」Goldman，VanMontagu and Herrera-Estrella，Curr.Genet.17169-174 1990；「纖維素分解真菌Trichoderma reesei的通用轉化系統」Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen and Knowles，Gene6155-164 1987)，以及對DNA重組物導入麴黴(「用trpC質粒轉化構巢麴黴」Yelton，Hamer and Timberlake，Proc.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474 1984)、鐮刀黴(「可被磷酸化轉換因子介導的植物信號誘導的真菌角質酶及其鑑定」Bajar，Podila and Kolattukudy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212 1991)、Tolypocladium(Camels T.et al.，Curr.Genet.，1991，20309-314)的方法也均有報導。此外，EP 870,835公開了用土壤桿菌介導的基因轉移法轉化各種絲狀真菌的方法，這些絲狀真菌包括麴黴、毛盤孢、鐮刀黴、鏈孢黴、灰側耳菌和木黴。
在優選的實施方案中，微生物宿主為木黴。在更優選的實施方案中，微生物宿主為木黴屬的Trichoderma reesei。
上述這些發表的轉化方法中所用的基因重組物，與實施例5-7、23、27、28、30、32和34中所描述的基因重組物類似，其類似點在於它們都含有調控區，與調控區相連並受其調控的蛋白編碼區(該編碼區可編碼可篩選標記)，以及轉錄終止子。在大多數情況下，該基因重組物與可篩選標記基因相連。
在優選的實施方案中，木聚糖酶的分泌信號是微生物宿主天然的木聚糖酶分泌信號，而基因修飾的微生物是由此微生物宿主產生的(即，木聚糖酶分泌信號來源的微生物宿主，與產生所說的基因修飾的微生物的微生物宿主是同一類型)。但是，如本文所述，任何木聚糖酶分泌信號都可使用。
用本發明的方法和基因重組物產生的目的蛋白可以使用由宿主得到的粗提取物，或可用本領域熟知的方法將此目的蛋白部分或完全純化，所用的方法包括離心、鹽和pH沉澱、尺寸排阻、離子交換、親合層析等。採用含有親合標記的前導肽，然後用合適的親合基質分離標記的目的蛋白，可以提高目的蛋白的純化水平。這種親合標記及其相應的親合基質，在本領域也是為大家所熟知的。而且，間插序列編碼的前導肽可以在目的蛋白的加工之前、加工期間或加工之後，與該目的蛋白分開。
以上的描述不會以任何方式來限制本發明的範圍，此外，所討論的特徵組合對闡明本發明可能不是絕對必需的。
以下結合實施例對本發明作進一步的說明。這些實施例僅是用於說明本發明，而不以任何方式來限制本發明的範圍。
實施例實施例1描述了從木黴屬Trichoderma reesei株RutC30、M2C38、BTR48中分離基因組DNA，以及這些菌株的基因修飾衍生物。實施例2-7描述了基因組DNA文庫的構建，各種基因的克隆，以及來源於Trichoderma reesei株M2C38的幾種基因重組物。實施例9和11-15描述了β-葡萄糖苷酶基因重組物在Trichoderma reesei株M2C38、BTR48和RutC30中的轉化和表達。
Trichoderma reesei株M2C38和BTR48是Iogen公司有產權的菌株，並由Trichoderma reesei RutC30(ATCC 56765，「纖維素酶高產的T.reesei突變株的篩選分離」Montenecourt and Eveleigh，Adv.Chem.Ser.1979，181289-301)衍生而來，該菌株本身又來源於Trichoderma reeseiQm6A(ATCC 13631，「碳源和金屬對綠色木黴的纖維素酶的影響效應」Mandels and Reese，1957，J.Bacterial.73269-278)。
在實施例1及隨後的實施例中，限制性內切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和大腸桿菌DNA聚合酶1的Klenow片段購自Gibco/BRL、New England Biolabs、Boehringer Mannheim或Pharmacia，並按生產商推薦的方法使用。具有校對活性的Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)按照生產商所提供的方案，用於所有的聚合酶鏈反應中(PCR)。潮黴素B購自CalBiochem。
噬菌體文庫在載體λ-DASH(Stratagene，Inc)中構建，其構建方法如下。基因組DNA(3μg)用2、1、0.5和0.2單位/μg的BamHI在37℃下消化1小時，以產生9-23kb大小的片段。每份消化反應所得的DNA用1倍體積Tris飽和的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，隨後用10μl 3M醋酸鈉(pH5.2)和250μl 95％的乙醇(-20℃)沉澱。通過微量離心沉澱消化的DNA，用0.5ml冷的70％乙醇淋洗，空氣乾燥後重新懸浮於滅菌去離子水中。通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖，電泳液為含1mM EDTA的0.04M Tris-醋酸鹽)進行9-23kb大小DNA片段的富集。將消化的DNA(0.4μg)與1μg用BamHI(Stratagene)預先消化的λ-DASH臂連接，連接反應物中含有2單位T4 DNA連接酶和1mM ATP，總體積為5μl，在4℃下反應過夜。用GigapackII Goldpackaging extracts(Stratagene)並按照生產商的方案，將連接混合物包裝入噬菌體顆粒中。用大腸桿菌宿主菌株XL1-Blue MRA(P2)評估該文庫的規模，測得共含有3×105個獨立的克隆。
32P標記的探針製備方法如下。從富含Hind III、BamH1或EcoRI片段的庫中，用PCR法分別擴增bgl1、cbh1和cbh2編碼區的短片段(0.7-1.5kb)，標記反應物中含有10-50ng靶DNA、0.2mM的d(GCT)TP、0.5μM dATP，20-40μCiα-32P-dATP、10pmol寡核苷酸引物以及0.5單位Tag聚合酶，反應總體積為20μl。該擴增反應共進行6個循環(95℃2分鐘；56℃1.5分鐘；70℃5分鐘)。加入0.5ml 10％(w/v)的三氯乙酸和0.5mg酵母tRNA使擴增的32P-標記的DNA沉澱。然後通過微量離心收集DNA沉澱，用1ml 70％乙醇洗兩次，經空氣乾燥後重新懸浮於含1mM EDTA、pH7.5的1M Tris中。
將固定了重組pUC119質粒的尼龍膜放入加熱密封的袋中60-65℃下預雜交1小時，預雜交液含1M NaCl、1％SDS、50mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA，並含有100μg/ml變性並切斷的鮭魚精子DNA。雜交反應在加熱密封的袋中用同樣的緩衝液進行，緩衝液中含有50μg/ml變性並切斷的鮭魚精子DNA和5×106-5×107cpm變性的bgl1、cbh1或cbh2探針，反應在60-65℃進行16-20小時。膜用1M NaCl、0.5％SDS在60℃洗15分鐘，共洗一次；用0.3M NaCl、0.5％SDS在60℃洗15分鐘，共洗兩次；然後再用0.03M NaCl、0.5％SDS在55℃洗15分鐘，共洗一次。將膜再放入熱密封的袋內，並暴露於Kodak RP X光片，在-70℃下放置16-48小時。按生產商的方案使該X光片顯影。挑取給出強或弱信號的菌落，並在添加70μg/ml氨苄青黴素的2×YT培養基中培養。用鹼裂解法(Sambrook等，pp.1.25-1.28)從這些培養物中分離質粒DNA，再用限制性內切酶消化、Southern雜交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)和PCR分析(Sambrook等，pp.14.18-14.19)進行分析。
用1.0kb bgl1探針與pUC119-Hind III文庫(實施例2)進行菌落轉移雜交，以鑑定攜帶bgl1基因的克隆，bgl1探針採用寡核苷酸引物製備，該引物設計成可擴增已知bgl1序列中鹼基對462-1403的片段(Barrett等)。分離出的bgl1克隆pJEN200中含有的6.0kb的Hind III片段，該片段相當於啟動子、結構基因和終止子序列。用0.7kb的cbh1探針與pUC119-BamH1文庫進行菌落轉移雜交，以鑑定攜帶cbh1基因的克隆，cbh1探針用寡核苷酸引物製備，該引物設計成可擴增已知發表的cbh1序列中鹼基對597-1361的片段(「Trichoderma reesei菌株L27的外切纖維二糖水解酶1的分子克隆」Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo and Innis，Bio/Technology 1691-696，1983；以下稱為Shoemaker等)。分離出的cbh1克隆pCOR132中含有5.7kb的BamHI片段，該片段相當於啟動子(4.7kb)和1kb的cbh1結構基因。在上述結果的基礎上，將包含Cbh1啟動子(2.1kb)和cbh1編碼區的5′端(0.4kb)的2.5kb EcoRI片段亞克隆到pUC119中，構建pCB152。用1.5kb的cbh2探針與pUC119-EcoRI文庫進行菌落轉移雜交，以鑑定攜帶cbh2基因的克隆，cbh2探針用寡核苷酸引物製備，該引物設計成可擴增已知cbh2序列中鹼基對580-2114片段(「Trichoderma reesei纖維二糖水解酶的核苷酸序列以及推測的一級結構」Chen，Gritzali and Stafford，Bio/Technology 5274-278，1987；以下稱為Chen等)。分離出的cbh2克隆pZUK 600含有4.8kb的EcoRI片段，該片段相當於啟動子(600bp)、結構基因(2.3kb)和終止子(1.9kb)。實例例4T.reesei M2C38 cbh1終止子，木聚糖酶II(xln2)基因，磷酸甘油酸激酶(pgk p)的克隆地高辛-11-dUTP標記的探針製備過程為，PCR擴增cbh1、xln2和pgk基因的編碼區，引物是用DIG標記和檢測試劑盒(BoehringerMannheim)並按照生產商的方案標記的隨機引物。含有cbh1、xln2和pgk基因的基因組克隆通過λ-DASH文庫的噬菌斑轉移雜交來鑑定。對於每個目的基因，將1×104個克隆轉移至Nytran(Schleicher andSchull)尼龍膜上。膜上有噬菌斑的一面在用0.5M NaOH、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR238)覆蓋，放置5分鐘，使噬菌體顆粒裂解並使噬菌體DNA變性；然後將此膜上有噬菌斑的一面在用1.5MTris(pH7.5)、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR238)覆蓋，放置5分鐘，使膜中和。將該膜在空氣中乾燥30分鐘後，在80℃烘烤2小時，使DNA固定在膜上。將膜放入加熱密封的袋中，65℃預雜交2小時，預雜交液為6×SSPE、5×Denhardt′s、1％SDS，再加入100μg/ml變性並切斷的鮭魚精子DNA。然後再將此膜放入加熱密封的袋中雜交，雜交液與預雜交液的相同，但含有50μg/ml的變性並切斷的鮭魚精子DNA和0.5μg地高辛-dUTP標記的探針，在65℃反應過夜。雜交後的膜用2×SSPE、0.1％SDS，室溫下洗兩次，每次15分鐘；用0.2×SSPE、0.1％SDS，65℃洗兩次，每次15分鐘；以及用2×SSPE洗一次，洗15分鐘。陽性的雜交克隆按照生產商的方案，通過與抗-地高辛/鹼性磷酸酶抗體偶聯物的反應來鑑定，顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯和4-氮藍四唑氯(Boehringer Mannbeim)。用地高辛dUTP標記的探針進行第二輪的篩選，進一步將陽性的雜交克隆純化。單個克隆的分離以及噬菌體DNA的純化按Sambrook等(1989)pp.2.118-2.121中所述的方法進行，但其中的CsCl梯度離心步驟用1倍體積的酚∶氯仿∶異戍醇(25∶24∶1)和1倍體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提步驟所替代。用0.1倍體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積冷的95％乙醇沉澱DNA，用0.5ml冷的70％乙醇洗滌沉澱的噬菌體DNA，空氣乾燥後重懸於50μl含1mM EDTA、pH8.0的10mM Tris中。用限制性內切酶消化該純化的噬菌體DNA，以及用Southern印跡雜交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)鑑定含有目的基因的限制性片段。該Southern印跡雜交過程中，採用與篩選λ-DASH文庫相同的地高辛-dUTP標記的探針。採用與轉移噬菌斑時同樣的方法，將膜雜交並使陽性雜交片段顯影。一旦由每個λ-DASH克隆鑑定出所需的限制性片段，則重複上述限制性內切酶消化步驟。酶切的片段在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳液為TAE，並將所需的條帶切下。用Sephaglas BandPrep試劑盒(Pharmacia)並按照生產商的方案，將DNA從凝膠切片上洗脫下來。
用cbh1探針與λ-DASH文庫(實施例2)進行菌落轉移雜交，以鑑定攜帶cbh1基因的克隆，該cbh1探針含有已知的cbh1序列(Shoemaker等)中鹼基對45-2220的片段。用限制性內切酶消化由λ-DASH cbh1克隆純化的噬菌體DNA，分離出含有cbh1編碼區的3′端(0.5kb)和cbh1終止子(1.3kb)的1.8kb的BamHI片段。將此片段亞克隆到大腸桿菌質粒載體pUC 119的BamHI位點，製備質粒pCB1Ta。用xln2探針與λ-DASH文庫(實施例2)進行菌落轉移雜交，以鑑定攜帶xln2基因的克隆，該xln2探針含有已知的xln2序列(「Trichoderma reesei木聚糖內切酶II(pI9)基因xln2的克隆、序列分析和表達增強」Saarelainen，Paloheimo，Fagerstrom，Suominen andNevalainen，Mol.Gen.Genet.241497-503，1993；以下稱為Saarelainen等)中鹼基對100-783的片段。用限制性內切酶消化由λ-DASH xln2克隆純化的噬菌體DNA，分離出含有xln2基因的啟動子(2.3kb)、編碼區(0.8kb)和終止子(2.6kb)的5.7kb KpnI片段。將此片段亞克隆到pUC119的KpnI位點，製備質粒pXYN2K-2。用pgk1探針與λ-DASH文庫(實施例2)進行菌落轉移雜交，以鑑定攜帶pgk基因的克隆，該pgk1探針含有已知的pgk序列(「絲狀真菌Trichoderma reesei3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk)的分離和鑑定」Vanhanen，Penttila，Lehtovaara and Knowles，Curr.Genet.15181-186，1989)中鹼基對4-1586的片段。用限制性內切酶消化由λ-DASH pgk克隆純化的噬菌體DNA，分離出含有pgk基因的啟動子(2.9kb)、編碼區(1.6kb)和終止子(0.5kb)的5.0kb EcoRI片段。將此片段亞克隆到pUC119的EcoRI位點，製備質粒pGK5.0。
用Pwo聚合酶，以pJEN200為模板，PCR擴增含有bgl1編碼區並減去β-葡萄糖苷酶分泌信號(鹼基對474-2679)的DNA片段。擴增所用的引物與發表的bgl1序列同源，並可在編碼的β-葡萄糖苷酶32位纈氨酸5′端導入SphI位點或在bgl1終止密碼子的3′端導入KpnI位點。用SphI和KpnI消化此擴增的片段，並插入用SphI和KpnI消化的pCB219N中，製備pBgstrf。為了製備pCB219N，以pZUK600為模板，擴增出cbh2終止子片段。所用的一個引物與發表的cbh2基因3′端非翻譯區的鹼基對2226-2242(Chen等，1987)同源，並在5′端導入Kph1位點；所用的另一引物為PUC正向引物(Cat，NO.1224，NewEngland Biolabs)，該引物與pZUK600中cbh2 3′端的EcoRI位點的下遊配對。將此擴增的片段在構建的KpnI和EcoRI位點進行消化，然後插入pUC119的相應位點，製備pCB219。再將EcoRI-Not1接頭(Cat.NO.35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219的單一EcoRI位點，製備pCB219N。由pCB152，用cbh1特異引物(發表的cbh1序列中的鹼基對249-286，Shoemaker等，1983)和PUC正向引物(Cat.No.1224，New England Biolabs)擴增含有cbh1啟動子和分泌信號的片段。cbh1特異引物可在編碼的CBH1第19位絲氨酸3′端導入SphI位點，pUC正向引物與pCB152中cbh1 5′端EcoRI位點的上遊配對。然後用SphI和EcoRI消化上述包括cbh1啟動子和分泌信號PCR產物，並將其插入pBR322L(pBR322的衍生物，其中SphI和Sal1位點間的區域被SphI-NotI-SalI接頭所替代)的相應位點中，製備pBR322LCS。為了構建表達序列盒，從pBgstrf中分離出包含bgl1編碼區和cbh2終止子的4.1kb的SphI/NotI片段，並插入用SphI和NotI消化的pBR322LCS中。在接合cbh1分泌信號與成熟β-葡萄糖苷酶時，為了保持其閱讀框的正確性，將所得質粒pCBGstrf在單一SphI位點線性化，並用T4DNA聚合酶將SphI位點補平。然後將所得質粒pCBG1進一步修飾，即加入XhoI接頭(Cat.No.1073，New England Biolabs)使cbh2終止子3′端的唯一NotI位點轉換為唯一XhoI位點。最終的質粒pCBG1-Xho即為表達序列盒質粒。
由質粒pVU1005，用Pwo聚合酶擴增用作T.reesei篩選標記的大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶基因(hph)(「用作植物細胞篩選標記的嵌合潮黴素抗性基因」Van den Wizen，Townsend，Lee and Bedbrook，Plant Mol.Biol，5299-302，1989)。所用的引物設計成在hph的編碼區(發表的hph序列中鹼基對211-1236；「質粒編碼的潮黴素B抗性潮黴素B磷酸轉移酶基因的序列及其在大腸桿菌和啤酒酵母中的表達」Gritz and Davies，Gene 25179-188，1983)的5′端和3′端分別引入SphI和KpnI位點。用SphI和KpnI消化所得的PCR產物，並將消化產物插入pUC119多接頭區的相應位點。所產生的質粒pHPT100用作起始質粒以構建篩選序列盒。將兩個新的接頭區引入此質粒，以便於克隆啟動子和終止子片段。其中，HindIII-XbaI-XhoI-SphI接頭插入HindIII和SphI位點之間，以及KpnI-NotI-SacI接頭插入仍保留在pHPT100中的pUC119多接頭的KpnI和SacI位點之間。所產生的結構指定為pHPT102。用於擴增pgk啟動子(「T.reesei 3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk1)的啟動子結構和表達」Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，Gene 106129-133，1991)的引物設計成在啟動子的-970位和+1位分別引入XhoI位點和SphI位點。這些位點隨後用來將pgk啟動子插入pHPT102的XhoI和SphI位點，以製備pHPT115。由pCB1Ta，用Pwo聚合酶擴增1.3kb的cbh1終止子片段，所用的一個引物與cbh1的3′端非翻譯區(發表的cbh1序列中鹼基對1864-1899)配對，該非翻譯區在鹼基對1877-1882含有KpnI位點，所用的另一引物為PUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，該引物與pCB1Ta中cbh1終止子3′端EcoRI位點的下遊配對。用KpnI消化cbh1終止子的PCR產物，並將此消化產物插入pHPT115的唯一KpnI位點，製備篩選序列盒質粒pHPT136。
為了獲得轉化載體，由pCBG1-Xho分離出5.6kb XbaI/XhoI片段的表達序列盒，並將其插入pHPT136的篩選序列盒上遊的唯一XbaI/XhoI位點。最終的轉化載體pCBG1-TV如
圖1所示，以環狀質粒的形式，如以下實施例9所述，通過微粒轟擊導入T.reesei M2C38中。
由基因組bgl1克隆pJEN200，用Pwo聚合酶和引物擴增出β-葡萄糖苷酶編碼區(鹼基對474-2680)，以便在發表的bgl1序列(Barrett，等)中鹼基對474的正上遊插入XbaI位點，以及在鹼基對2680的正下遊插入KpnI位點。將平端的pCR產物插入PUC118的SmaI位點，製備的質粒指定為pBGm.s。由於XbaI位點是構建在成熟β-葡萄糖苷酶的起始32位纈氨酸的正上遊，所以克隆的片段不包括β-葡萄糖苷酶的分泌信號。用XbaI和KpnI消化質粒pBGm.s，分離出含有bgl1編碼區並減去分泌信號的2.2kb片段，將此片段插入質粒pCB219N(在以上實施例5中描述)中cbh2終止子上遊的XbaI和KphI位點，製備質粒pBG2X。由基因組xln2亞克隆pXYN2K-2，用Pwo聚合酶，並採用xln2特異的引物和pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)擴增2.3kb含有xln2基因(鹼基對-2150至+99，其中+1表示ATG起始密碼子)的啟動子和分泌信號的片段。xln2特異的引物含有已知的xln2序列(Saarelainen等)中鹼基對103正下遊的NheI位點，pUC反向引物與xln2基因5′端KpnI位點的上遊配對。用EcoRI(作為pUC119多接頭的一部分由pXYN2K-2i擴增而來)和NheI消化xln2 PCR產物，並將其產物插入質粒pBR322L(在以上實施例5中描述)中，製備pBR322LXN。然後用Klenow將pBR322LXN的EcoRI位點補平，再加入SpeI接頭(Cat.No.1086，New Englanol Biolabs)，製備pBR322SpXN。用XabI和NotI酶切pBG2X質粒，分離出含有bgl1編碼區以及隨後的cbh2終止子的4.2kb片段。將此片段插入用NheI和NotI酶切的質粒pBR322SpXN中(NheI和XbaI有相匹配的凸末端)。該克隆中木聚糖酶分泌信號直接與成熟β-葡萄糖苷酶融合，製成完整的表達序列盒pXBG-2。
將以上實施例5中所述的篩選序列盒質粒pHPT136中的cbh1終止子，用含有xln2轉錄終止子的2.6kb KpnI片段取代。用Pwo聚合酶和引物由基因組亞克隆pXYN2K-2擴增xln2終止子，所用的一個引物可引入發表的xln2序列(Saarelainen等)中鹼基對780正下遊的KpnI位點，另一引物為PUC正向引物(Cat.No.18431-015，Gibco/BRL)，該引物與pXYN2K-2中xln2基因3′端的下遊配對。用KpnI消化xln2終止子的PCR產物，並與含有pUC119中pgk啟動的hph基因的pHPT136的5.1kb KpnI片段連接，製成篩選序列盒質粒pHPT136X。
轉化載體的構建包括在篩選序列盒的pgk啟動子正上遊插入表達序列盒。用NotI消化表達序列盒質粒pXBG2，用Klenow將末端補平，然後用SpeI消化。篩選序列盒pHPT136X用同樣的方式製備，先用XhoI消化，隨後通過充填反應產生平末端，然後用XbaI消化。將pXBG2的6.5kb SpeI/平端NotI片段與pHPT136X的XbaI/平端XhoI片段(Spel和Xbal有相匹配的凸出末端)連接，進行上述兩片段進行平端一粘端連接。最終的轉化載體pXBG-TV如圖2所描述，在其唯一的NotI位點線性化，然後如以下實施例9所述，通過微粒轟擊轉化T.reeseiM2C38。
實施本實施例的目的是檢測cbh1啟動子和xln2分泌信號對bgl表達的聯合影響。用含有cbh1啟動子的質粒pBR322LCS(實施例5)作為模板，PCR擴增含有cbh1啟動子中鹼基對-1399至-204的1.2kb HindIII片段，以便在鹼基對-1393至-1388插入唯一的XbaI位點。此修飾的cbh1啟動子片段用Hind III消化後，用來取代pXBG1(實施例6)中xln2啟動子鹼基對-1400至-121的片段，製成新的表達序列盒質粒pC/XBG1。用NotI消化pC/XBG1，隨後用Klenow片段將NotI位點補平，再用SpeI消化，分離出6.4kb的表達序列盒。然後通過平端/粘端連接，將此片段插入已用XhoI消化的pHPT136X中hph篩選序列盒的上遊，並用Klenow將此XhoI補平後，再用XbaI消化。如圖3所示，最終的轉化載體pC/XBG(XbaI)-TV(保藏編號209613，保藏日期1998年2月3日，保藏單位是美國標準生物材料保藏所(American TypeCulture Collection)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA)，將此轉化載體中在cbh1啟動子5′端和xln2終止子3′端的單一XbaI和NotI位點線性化，然後如以下實施例9所述，通過微粒轟擊轉化T.reeseiM2C38。
孢子出現後，進行第二次篩選，以分離單個轉化子。用接種環收集孢子並重懸於無菌水中。然後將此懸浮物通過塞有玻璃微纖維的無菌注射器過濾，使孢子濾過，而留下不需要的菌絲體。測定懸浮物中孢子的濃度，然後進行稀釋，將稀釋物在添加0.75％Oxgall(Difco)和潮黴素B(40單位/ml)的PDA平板上塗板，每個平板得到20-50個孢子。Oxgall起到菌落限制劑的作用，從而在這些第二次篩選平板上分離出單個菌落。2-3天後可觀察到分離出來的菌落。
表1親本和重組T.reesei株中的bgl1拷貝數

實施例11在液體培養物中生產β-葡萄糖苷酶本實施例描述木黴株生產的β-葡萄糖苷酶酶量的測定方法將單個木黴菌落轉移到PDA平板上，用於繁殖各自的培養物。為了使搖瓶的接種均勻，要求菌落形成孢子，搖瓶接種後用於測定其培養物產生的β-葡萄糖苷酶和纖維素酶的能力。培養基的組成如下所示。組分 g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4·7H2O 2.02CaCl2·2H2O 0.53CSL(玉米漿) 6.25CaCO310.00碳源**5-10微量元素*1ml/L*微量元素溶液含有5g/l FeSO4·7H2O；1.6g/l MnSO4·H2O；1.4g/l ZnSO4·7H2O。**5g/l葡萄糖加10g/l Solka floc(採用cbh1或其他纖維素酶啟動子時)、10g/l木聚糖(採用xln2啟動子時)或其他與指導β-葡萄糖苷酶表達的啟動子相匹配的碳源。碳源可配製成pH2-7的水溶液，分裝後滅菌，然後加入到主培養基中。
液體的體積為每個1升的瓶中加入150ml，起始pH為5.5，每個瓶子都在121℃高壓滅菌30分鐘，然後接種。
對未轉化的(天然的)和轉化的細胞，按實施例9所述，從PDA平板分離孢子，每個搖瓶接種1-2×106個孢子。該搖瓶在28℃、以200rpm的速度振搖6天。通過GF/A玻璃微纖維過濾器(Whatman)過濾收集含分泌蛋白的濾液。用Bio-Rad Protein Assay(Cat.No.500-0001)，以木黴纖維素酶為標準，確定蛋白的濃度。β-葡萄糖苷酶活性按實施例16所述進行測定。
篩選產β-葡萄糖苷酶能力(IU/mg)比未轉化的宿主菌至少高10倍以上的轉化子，該產酶能力的測定方法是將培養物濾液的β-葡萄糖苷酶活性IU/ml除以該培養物濾液的蛋白濃度(mg/ml)。實施例12由T.reesei株RutC30、RC-300、和RC-302用Solka floc碳源生產β-葡萄糖苷酶基於前面所述的用cbh1啟動子和分泌信號在木黴中使蛋白過表達的成功結果，將成熟β-葡萄糖苷酶編碼區置於基因重組物中cbh1啟動子和分泌信號的下遊，該基因重組物如
圖1所示，並在實施例5中描述(pCBG1-TV)。通過微粒轟擊，將載體引入T.reesei RutC30中(實施例9)，所產生的轉化子RC-300能產生高出親本株7倍多的β-葡萄糖苷酶活性(表2)。此7倍增加量是由於轉化載體的一個拷貝摻入了宿主的染色體中(實施例10，表1)。β-葡萄糖苷酶活性較大的提高是由於某一基因結構的1個拷貝，在此基因結構中β-葡萄糖苷酶是用cbh1啟動子和分泌信號進行表達，這種策略優於Barnett等和Fowler等所採用的策略。在Barnett等和Fowler等所採用的方法中，基因結構的10-15個拷貝僅使β-葡萄糖苷酶的活性增加了5倍，在該基因結構中β-葡萄糖苷酶用其本身的啟動子和分泌信號進行表達。但是，β-葡萄糖苷酶活性增加7倍，仍不足以緩解纖維素水解過程中β-葡萄糖苷酶的不足。
通過微粒轟擊，將基因重組物導入未轉化的T.reesei株RutC30(實施例9)，該基因重組物來自編碼與T.reesei木聚糖酶II分泌信號相連的成熟β-葡萄糖苷酶的pC/XBG(XbaI)。
未轉化的T.reesei株RutC30及由此宿主產生的轉化株RC-302按實施例11的步驟，以10g/L Solka floc和5g/L葡萄糖為碳源進行培養。結果如表2所示。
未轉化株產生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性為0.14IU。
含有CBH1啟動子和木聚糖酶II分泌信號的轉化子RC-302產生的β-葡萄糖苷酶活性約為19IU/mg。這比未轉化株提高了約136倍，這對於纖維素-乙醇生產來說是很重要的。
含有CBH1啟動子和木聚糖酶II分泌信號的轉化子RC-302產生的β-葡萄糖苷酶活性比含有CBH1啟動子和CBH1分泌信號的最佳RC300轉化子高出19倍。
表2150ml搖瓶培養物中T.reesei株RutC30、RC-300和RC-302的β-葡萄糖苷酶產量

實施例13由M2C38和RM4-302株用Solka floc碳源生產β-葡萄糖苷酶將載體pCBG1-TV通過微粒轟擊導入T.reesei M2C38中(實施例9)，上述載體中β-葡萄糖苷酶依靠CBH1啟動子和分泌信號來表達(
圖1和實施例5)。所得轉化子RM4-300產生的β-葡萄糖苷酶活性約為親本株的7-12倍(表3)。
通過微粒轟擊，將基因重組物導入未轉化的T.reesei株M2C38(實施例9)，該基因重組物來源於編碼與T.reesei木聚糖酶II分泌信號相連的成熟T.reesei β-葡萄糖苷酶的載體pC/XBG(XbaI)-TV。
未轉化的M2C38株和由此宿主轉化的轉化株RM4-302，以10g/LSolka floc和5g/L葡萄糖為碳源，按實施例11的步驟進行培養。結果如表3所示。
未轉化株產生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性為0.35IU。
含有CBH1啟動子和木聚糖酶II分泌信號的轉化子RM4-302產生的β-葡萄糖苷酶活性約為14.1IU/mg。這比未轉化株提高了約40倍，這對纖維素-乙醇生產來說有很重要的意義。
含有CBH1啟動子和木聚糖酶II分泌信號的轉化子RM4-302所產生的β-葡萄糖苷酶活性約為含有CBH1啟動子和CBH1分泌信號的轉化子的3倍。該差別是很重要的，說明採用CBH1啟動子和分泌信號時不能產生足夠的β-葡萄糖苷酶，以完全抑制水解過程中纖維二糖的產生。
表3150ml搖瓶培養物中T.reesei株M2C28、RM4-300和RM4-302的β-葡萄糖苷酶產量

實施例14用T.reesei株M2C38和RM4-301由木聚糖碳源生產β-葡萄糖苷酶通過微粒轟擊，將基因重組物轉導入未轉化的T.reesei株M2C38(實施例9)，該基因重組物來源於編碼與木聚糖酶啟動子和分泌信號相連的成熟T.reesei β-葡萄糖苷酶的載體pXBG1-TV。
未轉化的M2C38株和由此宿主轉化的轉化株RM4-301，以5g/L葡萄糖和10g/L木聚糖為碳源，按實施例11的步驟培養。結果如表4所示。
未轉化株產生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性為0.16IU。含有木聚糖酶II啟動子和木聚糖酶II分泌信號的轉化子RM4-301產生的β-葡萄糖苷酶活性約為20.4IU/mg。此結果比未轉化的菌株提高了約127倍，這對纖維素-乙醇生產來說是非常有意義的。
表4用木聚糖為碳源，150ml搖瓶培養基物中T.reesei株M2C38和RM4-301的β-葡萄糖苷酶產量

實施例15用Solka floc碳源，由BTR-48和RB48-301株生產β-葡萄糖苷酶通過微粒轟擊，將基因重組物導入未轉化的T.reesei株BTR48，該基因重組來源於編碼與木聚糖酶啟動子和分泌信號相連的成熟T.reeseiβ-葡萄糖苷酶的載體pXBG1-TV。
未轉化的BTR-48株和由該宿主轉化的轉化株RB48-301，以5g/L葡萄糖和10g/L Solka floc為碳源，按實施例11的步驟進行培養。結果如表5所示。
未轉化株產生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷活性為0.16IU酶。含有木聚糖酶II啟動子和木聚糖酶II分泌信號的轉化子RB48-301產生的β-葡萄糖苷酶活性約為21.9IU/mg。此結果比未轉化株提高了約136倍，這對纖維素-乙醇生產來說是非常有意義的。
表5用Solka floc為碳源，150ml搖瓶培養基中T.reesei株BTR48和RB48-301的β-葡萄糖苷酶產量

實施例16酶混合物中的β-葡萄糖苷酶活性的測定按照Ghose的方法(「纖維素酶活性的測定」Pure and Appl.Chem.，59257-268，1987)，測定β-葡萄糖苷酶活性。活性測定步驟為用50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH4.8)將酶樣品稀釋成若干個濃度，系列系稀釋樣品的體積均為0.5ml。合適的稀釋倍數範圍是將樣品的估計活性稀釋3～24倍。例如，10U/ml的樣品的稀釋比為1∶30-1∶240。無論所用的稀釋倍數是多少，每支酶標管內均裝入0.5ml的檸檬酸緩衝液樣品。底物為15mM(5.13g/L)的纖維二糖。將稀釋的酶貯存液和底物分別在50℃預熱5分鐘，然後在裝有酶的每支管中加入一份0.5ml的底物。試管在50℃溫育30分鐘。然後將各試管浸入沸水浴中5分鐘，以終止反應。將試管旋轉混合，在YSI葡萄糖分析儀上測定每份酶樣品管中的糖量，此時需要考慮到由酶產生的少量背景。
1個單位β-葡萄糖苷酶活性的定義為每分鐘產生的葡萄糖微摩爾數。由每種稀釋度所得的平均值按公式1計算活性，該稀釋度條件下產生0.15-1.5mg/ml的葡萄糖。
A＝C×G×D (1)其中，A＝β-葡萄糖苷酶活性(U/ml)(或微摩爾葡萄糖/ml/分鐘)C＝16.7微摩爾/mg/分鐘G＝產生的葡萄糖(mg/ml)D＝酶的稀釋度(無單位)實施例17纖維素水解本實施例的目的是確認轉化木黴產生的β-葡萄糖苷酶對纖維素水解的促進效果用於此研究的酶為Iogen Cellulase，此酶為Iogen公司生產的纖維素酶市售品；以及按實施例11的方法，30L發酵罐內培養RM4-302的產物，所用的培養基濃度為實施例11中所列出的兩倍。通過Amicon10,000MWCO膜超濾濃縮，使酶濃度提高，並校正至與Iogen Cellulase相同的纖維素酶活性。這兩種酶的活性如表6所示。
表6用於纖維素水解研究的酶的活性

用於本研究中的纖維素是預處理的燕麥殼，按照Foody等的(「用於纖維素轉化為燃料乙醇的改進預處理工藝」U.S.5,916,780)實施例6的步驟製備。
將0.5g預處理的燕麥殼纖維素樣品加入到裝有49.5g的0.05mol檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.8)的25ml燒瓶中。
將酶加入到搖瓶中，每g纖維素的相應加入量為10FPU。最終的β-葡萄糖苷酶劑量列於表6中。
加入兩種酶的搖瓶都以250rpm振蕩，並保持在50℃共24小時。此時，取樣並過濾除去不溶的纖維素，然後用標準Dionex脈衝-電流HPLC糖類分析法分析葡萄糖和纖維二糖的濃度。結果列於表7中。
Iogen Cellulase是常用的木黴纖維素酶，但該酶僅將45％的纖維素轉化為葡萄糖。在乙醇生產中如此低的程度是不可接受的。纖維二糖的蓄積也很嚴重，佔纖維素的13％。
β-葡萄糖苷酶含量提高的纖維素酶對纖維素水解得較好，可將近84％的纖維素轉換為葡萄糖。其優良表現的原因是由於β-葡萄糖苷酶的含量豐富，導致纖維二糖的蓄積幾乎可忽略。
表7高含量的β-葡萄糖苷酶增加了纖維素的水解

實施例18RutC30和M2C38株中T.reesei xln2和bgl1基因的比較用六種不同的限制性內切酶消化M2C38和RutC30的DNA，這些內切酶酶切成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶分泌信號(實施例8)編碼區的內部和外部，然後對此消化的DNA進行Southern印跡分析，以確定該兩種菌株間是否存在多態性。如圖4和圖5所示，用編碼成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶II啟動子以及分泌信號的M2C38片段製備的標記探針雜交時，可發現相同的條帶，表明了該兩種菌株間的這些區域不存在多態性，而有高度的DNA序列同源性。
對於製備實施例5-7中所述的基因重組物時所必需的M2C38DNA序列來說，鑑定和克隆這些序列所用的探針和引物都是基於已發表的幾種不同T.reesei株的各種基因DNA序列製備的，這些菌株包括QM9414(pgk，Vanhanen等，1989；以及cbh2，Chen等)、QM9419衍生株VTT-D79125(xln2，Saarelaihen等)和L27(cbh1，Shoemaker等)，以及RL-P37株的衍生株P40(bgl1，Barnett等)。所有這些菌株，類似於M2C38，都來源於QM6a株(「T.reesei染色體和基因的電泳核型分析纖維素酶和木聚糖酶基因的圖譜」Carter，Allison，Reyand Dunn-Coleman，Molecular Microbiology 62167-2174，1992)。
RutC30由QM6a衍生而來，並且是M2C38的先祖。發明者確信實施例2-4所述的方法，即用於製備實施例5-7所述β-葡萄糖苷酶表達載體的基因序列的分離方法，同樣能用於分離M2C38和RutC30的相同基因序列。根據上述的菌株譜系和Southern印跡信息，發明者還高度地確信由RutC30 DNA製備的基因重組物與由M2C38 DNA製備的基因重組物將含有相同的DNA片段，該DNA片段為編碼成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶II分泌信號的序列。由於由M2C38 DNA製備的基因結構(實施例5-7)提高了β-葡萄糖苷酶在M2C38和RutC30中的表達(實施例12-14)，本發明者也確信由RutC30 DNA製備的基因重組物將會在RutC30和M2C38中使β-葡萄糖苷酶活性有同樣水平的提高。
實施例19描述了T.reesei株M2C38和BTR213營養缺陷型pyr4的分離。實施例20和21描述了目的酶(內源和外源的)通過基因重組物在T.reesei株M2C38和BTR213中的轉化和表達。實施例22、26和32分別描述了T.reesei eg2和man1基因的克隆。
實施例23、27、28、30和32描述了用於在T.reesei中表達目的酶的基因重組物的構建。實施例25、29、31和33描述了基因重組物在T.reesei株M2C38和BTR 213中的轉化和表達。
為了篩選這些突變體，將T.reesei的孢子在含有1.2g/ml FOA、2mg/ml尿苷的固體最小培養基上塗平板。最小培養基的組成如下10g/L的葡萄糖、10g/L KH2PO4、6g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4·7H2O、3g/L檸檬酸三鈉·2H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、1.6mg/L MnSO4·H2O、1.4mg/LZnSO4·7H2O、2mg/ml CaCl2·2H2O、pH5.5。在3-4天內出現自發的FOA抗性菌落。進一步篩選，鑑定其生長需要尿苷的突變體。鑑定明確含有缺失pyr4基因的突變體的方法是用質粒pNCP4hph轉化，該質粒含有潮黴素抗性基因和粗糙鏈孢黴pyr4基因。此載體的構建方法如下，從pFB6中分離出3.2kb的BglII片段(「通過在大腸桿菌中的表達，粗糙鏈孢黴乳清酸核苷-5′-一磷酸羧化酶結構基因的克隆」Buxton，F.P.and Radford，A.，Mol.Gen.Genet.190403-405，1983)，然後將其克隆到pHPT136(上述實施例5)的唯一BamHI位點，製備載體pNCP4hph。通過微粒轟擊法，用pNCP4hph轉化孢子，並在含潮黴素的Potato Dextrose瓊脂培養基上篩選。隨後用缺乏尿苷的培養基培養抗潮黴素的轉化子，鑑定出其缺失的pyr4基因被粗糙鏈孢黴的pyr4基因互補的轉化子。
用含有大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶(hph)基因作為篩選標記的載體進行轉化時，在Potato Dextrose瓊脂培養基(PDA)平板上塗布1×106個孢子。轟擊後的平板在28℃溫育。轟擊後4小時，將添加80U/ml潮黴素B的篩選PDA培養基覆蓋在平板上，對孢子進行初選。轟擊平板在28℃溫育，生長3-6天後，用無菌牙籤挑取單個轉化子，分別放在含40U/ml潮黴素B的各PDA平板上，並在28℃溫育3-6天。
用含有粗糙鏈孢黴pyr4基因作為篩選標記的載體進行轉化時，用1×106個孢子在最小培養基上製備平板(實施例19)。轟擊的平板在28℃溫育。生長3-6天後，用無菌牙籤挑取單個的轉化子，分別放在各最小培養基平板上，並在28℃溫育3-6天。
每個1升的搖瓶中加入150ml體積的液體，超始pH為5.5，每個搖瓶在接種前均在121℃高壓滅菌30分鐘。
用接種環從平板上收集天然的和轉化的細胞的孢子，並重新懸浮於無菌水中。然後將此懸浮液通過塞入玻璃微纖維的無菌注射器過濾。這樣可使孢子通過，而留下不需要的菌絲體。測定該懸浮液中孢子的濃度後，每個搖瓶接種1-2×106個孢子。將此搖瓶在28℃的溫度、200rpm振蕩培養6天。通過GF/A玻璃微纖維過濾器(Whatman)過濾，收集含有分泌蛋白的濾液。以木黴纖維素酶為標準，用Bio-Rad ProteinAssay(Cat.No.500-0001)測定蛋白的濃度。
用eg2亞克隆pEG2gen為模板，用Pwo聚合酶(Boehringer)和引物擴增編碼葡聚糖內切酶II蛋白連同其本身分泌信號(鹼基對bp262-1692)的DNA序列，該引物設計成可在鹼基對260-265引入SphI位點，以及在鹼基對1692的終止密碼子正下遊引入KpnI位點。將擴增的PCR產物以平端片段插入pUC119的SmaI位點，製備質粒pEG2-6，並測定其序列。對於可使該eg2基因通過cbh1啟動子而表達的表達序列盒來說，在其構建之前，先用Pwo聚合酶和引物，由cbh1基因組亞克隆pCB152(上述實施例3)擴增含有cbh1啟動子的2.2kb片段，其中一個引物與pUC119多接頭的EcoRI位點的上遊配對，另一反向引物設計成可在cbh1的起始密碼子引入SphI位點(發表的cbh1序列的鹼基對209-214；「T.reesei L27株外切纖維二糖水解酶1的分子克隆」Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo andInnis，Bio/Technology 1691-696，1983；以下稱為Shoemakar等)。用EcoRI和SphI消化此擴增的片段，並插入pBR322L(上述實施例5)中，製備質粒pBRC1pro，pBR322L是在pBR322原有的位點SphI和SalI間插入合成的SphI-NotI-SalI接頭而衍生出來的質粒。由pEG2-6分離出含eg2基因的1.4kb SphI/KpnI片段，並插入質粒pCB219N(上述實施例5)中cbh2轉錄終止子上遊唯一的SphI和KpnI位點之間。然後用SphI/NotI消化，分離出含eg2基因和cbh2轉錄終止子的3.3kb片段，並將其插入pBRC1pro中cbh1啟動子正下遊的SphI和NotI位點之間。所得表達序列盒質粒pCEG2含有與cbh1啟動子和cbh2終止子序列連接的eg2基因(編碼成熟的分泌葡聚糖內切酶II及其本身的分泌信號)。對此質粒作進一步的修飾，在唯一的NotI位點進行消化，用Klenow補平並加入XhoI接頭(Cat.No.1073，New England Biolabs)，從而在cbh2終止子的3′端插入了單一XhoI位點，由此製成新的表達序列盒質粒pEG2-Xho。為了構建最終的轉化載體pEG2-TV(圖6a)，pCEG2-Xho在cbh2終止子的3′端單一XhoI位點進行酶切，然後在cbh1啟動子中鹼基對-1392的單一XbaI位點進行酶切，以分離出包含在cbh1啟動子調控下的eg2基因的5.6kb表達序列盒。然後將此片段插入pHPT136(上述實施例5)中hph篩選序列盒的上遊，該pHPT136已在單一XhoI和XbaI位點預先酶切過。在轉化T.reesei M2C38株之前，用XbaI和NotI消化轉化載體pEG2-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離片段，純化含有eg2基因結構的大條帶。
為了構建與xln2分泌信號連接並受cbh1啟動子調控的成熟葡聚糖內切酶II表達序列盒，用Pwo聚合酶和引物，以及用基因組亞克隆pEG2gen為模板擴增發表的eg2序列(Saloheimo等)中鹼基對331-1692片段，所用的引物設計成可在鹼基對331的正上遊引入唯一的NheI位點，以及可在鹼基對1692的正下遊引入唯一的KpnI位點。將產生的平末端片段插入pUC119的SmaI位點，製備質粒pE1，並測定eg2基因的序列。用NheI/KpnI消化pE1，分離出1.3kb編碼成熟葡聚糖內切酶II的片段(不含分泌信號)，將此片段插入質粒pCB219N-HB中cbh2終止子的上遊，製備pCB219N-E1。pCB219N-HB是由pCB219N(上述實施例5)衍生的質粒，在pCB219N中原有的pCB219 cbh2終止子片段上遊的HindIII和BamI位點間插入合成的HindIII-SphI-NheI-BamHI接頭，即產生pCB219N-HB。用NheI/NotI消化pCB219N-E1，分離出含有eg2編碼區和cbh2終止子序列的3.2kb片段，將此片段插入質粒pBR322LXN(上述實施例6)中xln2啟動子和分泌信號正下遊的NheI和NotI位點之間，製成pXE2。將pXE2中包含xln2啟動子中鹼基對-1400至-121的1.3kb HindIII片段用修飾的1.2kb HindIII片段替換，後者含有cbh1啟動子中鹼基對-1399至-204的片段，但在-1393至-1388有一個新的XbaI位點，該片段是用含有cbh1啟動子的質粒pBR322LCS為模板，通過PCR擴增而製備的。由所得質粒pC/XRE2-Xba，分離出包含修飾的cbh1啟動子、xln2分泌信號、eg2編碼區和cbh2終止子的接近4.9kb的XbaI/NotI片段，並用來取代PCE2中包含cbh1啟動子和分泌信號、eg2編碼區和cbh2終止子的XbaI/NotI片段，從而製備表達序列盒質粒pC/XRE2。注意到pCE2的cbh1啟動子中XbaI位點是位於鹼基對-1497至-1492的內源位點。因此，在表達序列盒質粒pC/XRE2中，由於pCE2中天然cbh1啟動子的內源XbaI位點與pC/XE2-Xba中修飾的cbh1啟動子的構建XbaI位點的融合，丟失了cbh1啟動子的鹼基對-1496至-1393的片段。為了構建最終的轉化載體pC/XRE2-TV(圖6b)，由pCE2和pC/XRE2，通過EcoRI消化(該酶在cbh1啟動子的5′端和cbh2終止子的3′端酶切)分離出eg2表達序列盒。然後將這些片段插入粗糙鏈孢黴pyr4篩選序列盒質粒pNCBg1的唯一EcoRI位點。pNCBg1的構建方法是，將取自pFB6的、含有粗糙鏈孢黴pyr4基因的啟動子、編碼區和終止子的3.2kb BglII片段插入pUC19多接頭的BamHI位點。選擇插入的方向，使包含eg2表達序列盒和粗糙鏈孢黴pyr4篩選序列盒的完整基因重組物通過XbaI消化能夠由pUC序列分離出。在轉化T.reesei株BTR213之前，用XbaI消化轉化載體pC/XRE2-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段，並純化含有eg2基因結構的大條帶。
表8親本株和重組木黴屬T.reesei株中eg2的拷貝數

實施例25由天然和轉化T.reesei株生產葡聚糖內切酶II通過微粒轟擊，將基因重組物導入T.reesei株BTR213或其pyr4營養缺陷型(實施例20)，該基因重組物來源於載體pE2-TV和pC/XRE2-TV，並編碼與eg2或xln2分泌信號連接並受cbh1啟動子調控的葡聚糖內切酶II。用10g/L Solka floc和5g/l葡萄糖作為碳源，按照實施例21的步驟培養天然的BTR213株和所得轉化株。測定酶樣品的葡聚糖內切酶活性葡聚糖內切酶活性通過測量羧甲基纖維素(CMC)底物釋放的還原糖來確定。用50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH4.8)將酶樣品稀釋成若干個濃度，系列稀釋樣品的體積均為0.5ml。合適的稀釋度範圍是將樣品的估計活性稀釋2-20倍。例如，1000U/ml的樣品的稀釋比為1∶2000～1∶20,000。無論所用的稀釋度是多少，每支酶標管中檸檬酸緩衝液樣品的體積均為0.5ml。底物是用50mM檸檬酸鹽緩衝液(pH4.8)製備的1％CMC溶液。稀釋的酶貯存液和底物分別在50℃預熱5分鐘，然後將0.5ml等份的底物加入到裝有酶的各管中。將試管在50℃溫育30分鐘。加入3ml DNS試劑(1％二硝基水楊酸、1％氫氧化鈉、0.2％酚、0.05％偏亞硫酸氫鈉的水溶液)，並將試管浸入沸水中10分鐘，以終止反應。煮沸結束後，每支管內中加入1ml 40％的酒石酸鉀鈉水溶液。然後將管子旋轉振蕩。冷卻、並測定由底物釋放並與DNS試劑反應的可溶性還原糖量。測定的方法是測量其在550nm的吸光度，並與標準曲線對照，該標準曲線由含有0.18-0.5mg/ml葡萄糖(還原糖)的50mM檸檬酸鹽緩衝液(pH4.8)製作。培養物的活性用以下方法進行計算。即，在同樣條件下，比較產生0.5mg/ml還原糖所需的培養物濾液ml數與釋放0.5mg/ml還原糖所需的已知活性的對照葡聚糖內切酶溶液ml數。
按實施例21所述，收集培養物濾液，並分析其葡聚糖內切酶活性。結果如表9所示。
表9150ml搖瓶培養物中T.reesei株BTR213、201-2A、843-2和845-2的葡聚糖內切酶產量

未轉化株每mg蛋白葡的聚糖內切酶活性為9.9IU。含2個拷貝cbh1啟動子和eg2分泌信號的轉化子210-2A產生2倍以上的葡聚糖內切酶或活性接近22IU/mg，而含有cbh1啟動子和xln2分泌信號的轉化子843-2和845-2的葡聚糖內切酶活性為29-35IU/mg，這是天然菌株的3.3倍以上，或是含eg2分泌信號的轉化子的1.3-1.6倍。
用man1λDASH克隆為模板，用Pwo聚合酶(Boehringer)和引物擴增編碼分泌甘露聚糖酶蛋白(鹼基對88-1443)的DNA序列。所用的引物設計成可在鹼基對88-93引入NheI位點，以及在鹼基對1443的終止密碼子正下遊引入KpnI位點。所得PCR產物以平末端片段的形式插入到pUC118的SmaI位點，以製成質粒pManGNK，對該序列進行測序。用NheI和KpnI消化pManGNK，分離出man1片段，然後將此片段插入已用NheI和KpnI消化過的表達序列盒質粒pBR322LEC中，製成表達序列盒質粒pLECMAN。pBR322LCS含有2.3kb片段的包含啟動子和分泌信號的T.reesei cbh1基因(上述實施例5)，由pBR322LCS構建pBR322LEC的方法如下用SphI消化pBR322LCS，使其線性化，並用T4 DNA聚合酶(Gibco/BRL)使其末端成為平末端，然後連接NheI接頭；用NheI消化後，用T4 DNA連接酶使該質粒重新環化，從而產生質粒pBR322LCN。用NheI/NotI消化pCB219N-HB(上述實施例22)，分離出含有T.reesei cbh2基因轉錄終止子，以及終止子的5′和3′端的唯一KpnI和NotI位點的1.9kb NheI/NotI片段，然後將此片段插入pBR322LCN中唯一NheI和NotI位點間，以獲得pBR322LEC。為了獲得最終的轉化載體pCMAN-TV(圖7a)，用NotI消化pLECMAN中cbh2終止子3′端的唯一NotI位點，用Klenow補平，然後在鹼基對-1392的cbh1啟動子唯一XbaI位點消化，以分離出含有在cbh1啟動子和分泌信號調控下的man1基因的5.6kb表達序列盒。然後將此片段插入pHPT136(上述實施例5)中hph篩選序列盒的上遊，pHPT136的唯一XhoI位點已預先消化過並已用Klenow補齊，隨後已將鄰近的唯一XbaI位點消化。在轉化T.reesei株M2C38之前，先用XbaI和NotI消化pCMAN-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段，然後純化含有man1基因結構的大條帶。
用NheI/NotI消化pBR322LEC(上述實施例27)，分離出包含man1編碼區和cbh2轉錄終止子的3.3kb NheI/NotI片段，然後將此片段插入質粒pBR322SpXN(上述實施例6)中T.reesei xln2啟動子和分泌信號序列的下遊，產生表達序列盒質粒pXMAN。用Hind III消化pBR322LCS(上述實施例5)，分離出包含T.reesei cbh1啟動子的鹼基對-1399至-204的1.2kb Hind III片段，用此片段替換pXMAN中包含xln2啟動子的鹼基對-1400至-121的1.3kb HindIII片段，得到表達序列盒質粒pC/XMAN。為了獲得最終的轉化載體pXMAN-TV(圖7b)和pC/XMAN-TV(圖7c)，分別消化pXMAN和pC/XMAN中cbh2終止子3′末端的唯一NotI位點，用Klenow補平，然後在cbh1啟動子的鹼基對-1392的唯一XbaI位點消化，以分離出含有受xln2啟動子和分泌信號或cbh1啟動子和xln2分泌信號調控的man1基因的5.6kb表達序列盒。然後將這些片段分別插入pHPT136X(上述實施例6)中hph篩選序列盒的上遊，該pHPT 136X的唯一XhoI位點已預先消化過並已用Klenow補平後，隨後已將鄰近的XbaI位點消化。在轉化T.reesei株M2C38之前，用NotI消化轉化載體pXMAN-TV和pC/XMAN-TV，使其線性化。
按實施例21所述收集培養物濾液，並按上述方法分析甘露聚糖酶的活性。結果如表10所示。
表10150ml搖瓶培養物中T.reesei株M2C38、5D和82D的甘露聚糖酶產量

未轉化株的每mg蛋白甘露聚糖酶活性為3.58IU。含有cbh1啟動子和分泌信號的轉化子5D產生1.9倍以上甘露聚糖酶或酶活性為6.72IU/mg，而含有cbh1啟動子和xln2分泌信號的轉化子82D甘露聚糖酶活性為16.22IU/mg，這是天然株的4.5倍以上，或是含cbh1分泌信號的轉化子的2.4倍以上。
通過微粒轟擊，將載體pXMAX-TV的基因重組物導入T.reesei株M2C38(實施例20)，該基因重組物編碼與xln2分泌信號連接並受xln2啟動子調控的成熟甘露聚糖酶。以10g/l木聚糖和5g/l葡萄糖為碳源，按實施例21的步驟培養天然株M2C38和由其產生的轉化株。
按實施例21所述收集培養物濾液，並按上述方法分析其甘露聚糖酶活性。結果如表11所示。
表11150ml搖瓶培養物中T.reesei株M2C38和17D的甘露聚糖酶產量

以木聚糖為碳源時，未轉化株每mg蛋白的甘露聚糖酶活性為0.3IU。含有xln2啟動子和分泌信號的轉化子17D產生9.4倍以上的甘露聚糖酶，或酶活性為2.81IU/mg。
為了克隆成熟葡聚糖內切酶II基因(cmc3)的編碼區，用前面所述的方法(實施例8)，從H.insolens株ATCC 22080生物質中分離出H.insolens的基因組DNA，該生物質是在含24g/l玉米漿、24g/l葡萄糖和0.5g/l CaCO3、pH5.5的培養基中，37℃培養48小時後所得的(如在「清潔劑纖維素酶」中所述，Barbegaard，Jensen and Holm，U.S.Pat.No.4,435,307，1984)。然後用Pwo聚合酶和引物，用此H.insolens基因組DNA作為模板擴增成熟葡聚糖內切酶II的編碼區。所用的引物設計成可在H.insolens cmc3序列(Gene Bank登記號X76046)中鹼基對64的正上遊以及鹼基對1182的正下遊分別引入唯一的NheI和KpnI位點。擴增的片段用NheI和KpnI消化，並用來替換表達序列盒質粒pCMAN(實施例26)中的man1基因，該質粒pCMAN已預先用NheI和KpnI消化。在所得cmc3表達序列盒質粒pChHE2中，cmc3序列的表達將由cbh1啟動子和分泌信號驅動。為了構建cmc3基因與xln2分泌信號連接的表達序列盒pC/XhHE2，用經NheI和KpnI消化的cmc3PCR產物替換表達序列盒質粒pCE2(上述實施例22)中的eg2基因，質粒pCE2預先用NheI和KpnI消化。
為了得到轉化載體pChHE2-TV(圖8a)和pC/XhHE2-TV(圖8b)，通過EcoRI消化pChHE2和pC/XHE2(該酶在cbh1啟動子的5′端和cbh2終止子的3′端酶切)，分離出cmc3表達序列盒。然後將這些片段分別插入粗糙鏈孢黴pyr4篩選序列盒質粒pNCBgl(上述實施例23)中唯一的EcoRI位點。選擇插入的方向，使包含cmc3表達序列盒和粗糙鏈孢黴pyr4篩選序列盒的完整基因重組物通過XbaI的消化從pUC序列中分離出。在轉化T.reesei株M2C38之前，用XbaI消化轉化載體pChHE2-TV和pC/XhHE2-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段，並純化含有cmc3基因結構的大條帶。
按實施例21所述收集培養物的濾液，並按上述方法分析高pH葡聚糖內切酶的活性。結果如表12所示。
表1214升發酵物中T.reesei株M2C38、984A和998A的高pH葡聚糖內切酶產量

未轉化株每mg蛋白的高pH葡聚糖內切酶活性為0IU。含有cbh1啟動子和分泌信號的轉化子984A的高pH葡聚糖內切酶活性為0.097IU/mg，而含有cbh1啟動子和xln2分泌信號的轉化子998A的高pH葡聚糖內切酶活性為0.195IU/mg，該活性為含有cbh1分泌信號的轉化子的2倍以上。
T.versicolor漆酶I基因(lcc1)的cDNA克隆由Edgar Ong等人在噬菌粒載體pBK-CMV中獲得(「水解木質素的擔子菌Trametesversicolor的兩種漆酶互補DNA的克隆和序列分析」Ong，Pollock andSmith，Gene 196113-119，1997；以下稱為Ong等)。用Pwo聚合酶和引物擴增去除了天然分泌信號的成熟漆酶編碼區，該引物設計成可在發表的lcc1序列(Ong等)的鹼基對250的正上遊和鹼基對1750的終止密碼子正下遊分別引入唯一XbaI位點和唯一XhoI位點。該擴增序列以平端片段的形式插入pBR322的唯一EcoRI位點，製成質粒pBRLcc1，並對該lcc1片段的序列進行測定。為了獲得lcc1表達序列盒質粒pCL1和pC/XL1，用KpnI消化cmc3表達序列盒質粒pChHE2和pC/XhHE2，並用T4 DNA聚合酶使其切口變成平末端，隨後連接XhoI接頭(Cat.No.1073，New England Biolabs)，即可在兩個質粒的cbh2轉錄終止子的5′端插入唯一的XhoI位點，從而製成修飾的cmc3表達序列盒質粒pChHE2-Xho和pC/XhHE2-Xho。用XbaI/XhoI消化pBRLcc1，即可分離出1.5kb片段的lcc1基因，該片段用來替換表達序列盒質粒pChHE2-Xho和pC/XhHE2-Xho中的cmc3基因，pChHE2-Xho質粒和pC/XhHE2-Xho質粒已預先用NheI/XhoI消化(NheI和XbaI有相匹配的凸出末端)。所得lcc1表達序列盒質粒含有與cbh1(在pCL1中)或xln2(pC/XL1)分泌信號連接並受cbh1啟動子調控的lcc1基因。為了獲得最終的轉化載體pCL1-TV(圖9a)和pC/XL1-TV(圖9b)，用EcoRI消化pCL1和pC/XL1，分離出lcc1表達序列盒，並將其插入pyr4篩選序列盒質粒pNCBg1(上述實施例23)的唯一EcoRI位點。選擇插入的方向，使包含lcc1表達序列盒和粗糙鏈孢黴pyr4篩選序列盒的完整基因重組物在用XbaI消化時能從pVC序列分離。在轉化T.reesei株BTR213aux28之前，用XbaI消化轉化載體pCL1-TV和pC/XL1-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段，並純化包含lcc1基因結構的大條帶。
以10g/l Solka floc和5g/l葡萄糖為碳源，按實施例21的步驟培養天然株BTR213及由其產生的轉化株。酶樣品的漆酶活性測定通過ABTS在30℃的氧化來測定漆酶的活性。試驗混合物中含有0.5mM ABTS、0.1M醋酸鈉(pH5.0)以及適量的酶。通過測定其在420nm(ε420＝3.6×104M-1Cm-1)吸光度的增加來檢測ABTS的氧化。1單位的漆酶活性定義為每分鐘氧化1微摩爾ABTS所需的酶量。
按實施例21所述收集培養物濾液，並按上述方法分析漆酶的活性。結果表明，與未轉化的宿主(BTR213)相比或與用包含cbh1調控區和分泌信號的載體轉化的T.reesei相比，含有木聚糖酶分泌信號(pC/XL1-TV)的轉化子，其漆酶的產量有提高。實施例34-38描述了修飾的嗜熱木黴木聚糖酶用T.reesei cbh1啟動子和xln2分泌信號在Humicola insolens中的表達。
組分 g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4·7H2O 2.02CaCl2·2H2O 0.53CSL6.25CaCO310.00碳源**5-200微量元素*1ml/L*微量元素溶液中含有5g/l FeSO4·7H2O；1.6g/l MnSO4·H2O；1.4g/l ZnSO4·7H2O。**葡萄糖、Solka floc碳源可配製成pH2-7的水溶液，分裝後滅菌，然後在培養開始前加入到主培養基中，或在發酵過程中加入。
每個1升搖瓶中加入的液體體積為150ml，起始pH為5.5，每個搖瓶在接種前在121℃高壓滅菌30分鐘。
按前面所述(實施例9)，從YPSS瓊脂平板分別分離出天然的和轉化的細胞的孢子，每個搖瓶接種1-2×106個孢子。然後將搖瓶置於37℃，以200rpm的轉速振蕩培養3天。通過GF/A玻璃微纖維過濾器(Whatman)過濾，收集含分泌蛋白的濾液。用Bio-Rad protein Assay(Cat.No.500-0001)測定蛋白的濃度。
表14150ml搖瓶培養物中H.insolens 22082和22082-5A株的修飾嗜熱T.reesei木聚糖酶產量

未轉化株每mg蛋白在50℃時的木聚糖酶活性為15.9IU，以及每mg蛋白在65℃時的木聚糖酶活性為10.55IU。轉化子22082-5A在50℃時的木聚糖酶活性為29.8IU/mg，以及在65℃時的木聚糖酶活性為24.99IU/mg。由此結果可以看出，65℃時轉化株的木聚糖酶活性為未轉化株的2.4倍。
這些結果表明T.reesei cbh1啟動子和xln2分泌信號對目的基因在外源宿主中的表達，以及目的蛋白在外源宿主中的分泌是有效的。
所有引用的文獻都在此作為參考引入。
儘管本發明描述了有關目前認為是優選的實施方案，但本發明不受限於所公開的實施方案。相反，本發明力求覆蓋包括在附屬的權利要求的精神和範圍之內的各種修改和等同的方案。以下的權利要求的範圍給出了最寬範圍的說明，以致於可包含所有此類的修改和等同的配方以及用途。
權利要求
1.一種核苷酸序列，它包括調控區、與調控區相連並受調控區調控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產是非正常關聯。
2.權利要求1所述的核苷酸序列，其中，調控區選自cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1以及xln2。
3.權利要求1所述的核苷酸序列，其中，目的基因編碼的蛋白可用於醫藥、營養品、工業品、動物飼料、食品添加劑以及酶。
4.權利要求1所述的核苷酸序列，它進一步包含終止子序列。
5.權利要求1所述的核苷酸序列，它進一步包含標記基因。
6.權利要求1所述的核苷酸序列，它進一步包含間插序列。
7.一種載體，它包含權利要求1所述的分離核苷酸序列。
8.一種轉化絲狀真菌，它包含權利要求7所述的載體。
9.一種轉化絲狀真菌，它包含權利要求1所述的核苷酸序列。
10.權利要求9所述的轉化絲狀真菌，其中，絲狀真菌選自木黴屬(Trichoderma)、腐質黴屬(Humicola)、鐮刀黴屬(Fusarium)、麴黴屬(Aspergillus)、疣孢黴屬(Mycogone)、輪枝孢屬(Verticillium)、鏈黴屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢黴屬(Neurospora)、葡萄孢屬(Botrytis)、灰側耳菌屬(Pleurotus)、青黴屬(Penicillum)、頭孢屬(Cephalosporium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚黴屬(Papulospora)、綿黴屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內座殼屬(Endothia)、毛黴屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢黴屬(Pyricularia)、青黴屬(Penicillum)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、耙菌屬(Irpex)、葡萄穗黴屬(Stachybotrys)、帚黴屬(Scorpulariopsis)、毛殼黴屬(Chaetomium)、粘帚黴屬(Gilocladium)、頭孢黴屬(Cephalosporin)、支頂孢屬(Acremonium)。
11.權利要求10所述的轉化絲狀真菌，其中，絲狀真菌為木黴。
12.權利要求10所述的轉化的絲狀真菌，其中，絲狀真菌是腐質黴。
13.一種在絲狀真菌中生產目的蛋白的方法，該方法包括以下步驟(i)用核酸序列轉化絲狀真菌，該核酸序列包括調控區、與調控區相連並受調控區調控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產是非正常關聯；(ii)培養該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產目的蛋白。
14.一種在絲狀真菌中生產目的蛋白的方法，該方法包括以下步驟(i)用權利要求6所述的核酸序列轉化絲狀真菌；(ii)培養該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產目的蛋白。
15.權利要求13所述的方法，其中，轉化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對於該絲狀真菌而言是異源的。
16.權利要求13所述的方法，其中，轉化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對於該絲狀真菌而言是同源的。
17.權利要求14所述的方法，其中，轉化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對於該絲狀真菌而言是異源的。
18.權利要求14所述的方法，其中，轉化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對於該絲狀真菌而言是同源的。
19.權利要求13所述的方法，其中，促使該真菌生產的步驟進一步包括目的蛋白的純化過程。
20.權利要求14所述的方法，其中，促使該真菌生產的步驟進一步包括目的蛋白的純化過程。
21.權利要求14所述的方法，其中，促使該真菌生產目的蛋白的步驟進一步包括由目的蛋白中除去間插序列編碼的胺基酸序列的過程。
22.一種蛋白，它由權利要求14所述的方法生產。
23.一種蛋白，它由權利要求20所述的方法生產。
24.權利要求3所述的核苷酸序列，其中，蛋白選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶、果膠酶、蛋白酶以及過氧化物酶。
25.一種載體，它包含權利要求24所述的分離核苷酸序列。
26.一種轉化絲狀真菌，它包含權利要求25所述的載體。
27.一種轉化絲狀真菌，它包含權利要求24所述的核苷酸序列。
28.一種在絲狀真菌中生產目的蛋白的方法，其中，目的蛋白選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶、果膠酶、蛋白酶和過氧化物酶，目的蛋白的生產方法則包括以下步驟(i)用權利要求25所述的載體轉化絲狀真菌；(ii)培養該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產目的蛋白。
29.一種在絲狀真菌中生產目的蛋白的方法，其中，目的蛋白選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶、果膠酶、蛋白酶和過氧化物酶，目的蛋白的生產方法則包括以下步驟(i)用權利要求24所述的核酸序列轉化絲狀真菌；(ii)培養該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產目的蛋白。
30.一種生產目的蛋白的表達體系，該體系包括含有某種核苷酸序列的絲狀真菌，該核酸序列包含調控區、與調控區相連並受調控區調控的木聚糖酶分泌序列和編碼目的蛋白的目的基因，其中，該調控區或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產是非正常關聯。
全文摘要
本發明涉及提高真菌宿主的目的蛋白的產量。本發明公開了包含調控區、與調控區相連並受調控區調控的木聚糖酶分泌序列和目的基因的核苷酸序列。該目的基因編碼的蛋白可用於醫藥、營養品、工業品、動物飼料、食品添加劑以及酶。優選該目的基因編碼纖維素酶、半纖維素酶、木質素降解酶、果膠酶、蛋白酶或過氧化物酶。本發明還涉及含有這些核酸序列的載體和宿主,也涉及生產目的蛋白的方法。
文檔編號C12N15/80GK1390260SQ00815509
公開日2003年1月8日 申請日期2000年9月1日 優先權日1999年9月9日
發明者T·C·懷特, S·麥胡格, C·D·辛德勒 申請人:伊奧根生物產品公司