與肝細胞癌相關的B型肝炎病毒基因組標誌物的製作方法

2023-06-12 00:17:21

專利名稱：與肝細胞癌相關的B型肝炎病毒基因組標誌物的製作方法
背景技術：
在世界範圍內，有超過3億人感染B肝病毒(HBV)。對那些具有高度病毒複製水平的個體來說，由慢性活動型肝炎發展為肝硬化，肝衰竭和肝細胞癌(HCC)是常見的。
慢性HBV感染超過10至20年的自然進程導致20％至50％的患者出現肝硬化，並已證明HBV感染能夠發展為肝細胞癌。目前沒有關於確定究竟何種B肝病毒亞型最易誘發肝細胞癌的任何研究，因此至今認為所有的B肝病毒都具有相同的肝細胞癌形成危險。
值得注意的是，從初次診斷算起，診斷患有肝細胞癌的患者存活期僅有0.9至12.8個月(Takahashi et al.，American Journal of Gastroenterology88240-243(1993))。採用化療的方法對肝細胞癌進行治療的收效甚微，由於在肝中腫瘤的廣泛擴散(Trinchet et al.，Presse Medicine 23831-833(1994))，僅有10％的患者可從手術中獲益。因原發肝細胞癌的侵入特性，手術治療中唯一可行的選擇是肝移植(Pichlmayr et al.，Hepatology2033S-40S(1994))。

發明內容
本發明提供了確定感染B型肝炎病毒(HBV)個體發展成為肝細胞癌(HCC)遺傳素因的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)確定分離自所述個體的HBV基因組中對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位的核苷酸；及(b)將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中所述HCC遺傳素因相關的核苷酸包括31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A和/或2712G。
在一些實施方案中，所述方法包括(a)確定分離自所述個體的B基因型HBV基因組中對應於SEQ IDNO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525或2712位的核苷酸；及(b)將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中HCC遺傳素因相關的核苷酸包括1165T，1762T，1764A，2525C，2712C，2712A或2712G。
在一些實施方案中，所述方法包括(a)確定分離自個體的B基因型HBV基因組中對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；及(b)將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中在B基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T。
在一些實施方案中，所述方法包括確定來自所述個體HBV的基因型。
在一些實施方案中，所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ IDNO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。
在一些實施方案中，所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包括有對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位核苷酸的擴增產物。在一些實施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或
1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T。
在一些實施方案中，所述雜交是通過線性探針進行的。
在一些實施方案中，所述方法包括(a)確定分離自所述個體的C基因型HBV基因組中對應於核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170或2441位的核苷酸；及(b)對確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中該HCC遺傳素因相關的核苷酸包括31C，53C，312C，799G，961G，1499G，1613A，1899A，2170C，2170G或2441C。
在一些實施方案中，所述方法包括a)確定來自所述個體C基因型HBV的亞型，其中C1亞型包括核苷酸2733A，1856C，1009T和2892T，C2亞型包括核苷酸2733C，1856T，1009T和2892T，和C3亞型包括核苷酸2733C，1856C，1009C和2892T；b1)如果HBV的基因型為C1，則確定對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸；或b2)如果HBV的基因型為C2，則確定對應於SEQ ID NO1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸；及b3)如果HBV的基因型為C3，則確定對應於SEQ ID NO1中核苷酸第312，961，1613，1899位的核苷酸；及c)將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關位置上的核苷酸進行比較，其中在C1亞型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括31C；和/或53C；和/或1499G；及在C2亞型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或
799G；及在C3亞型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
在一些實施方案中，所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ IDNO1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。在一些實施方案中，所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ IDNO1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。在一些實施方案中，所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包含有對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸的擴增產物。在一些實施方案中，所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ ID NO1中核苷酸第312，961，1613和1899位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。
在一些實施方案中，所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包含有對應於SEQ ID NO1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸擴增產物。在一些實施方案中，所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包含有對應於SEQ ID NO1中核苷酸第312，961，1613和1899位的核苷酸擴增產物。
在一些實施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為31C；和/或53C；和/或1499G。
在一些實施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述多種探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為2170G；和/或2441C；和/或799G。
在一些實施方案中，所述雜交是通過線性分析法進行的。
在一些實施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述多種探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
在一些實施方案中，所述雜交是通過線性分析法進行的。
在一些實施方案中，所述方法還包括確定所述個體HBV的基因型。
在一些實施方案中，所述方法包括確定HBV的基因型，其中B基因型包括2733C、1856C、1009T和2892T，其中C1基因型包括2733A、1856C、1099T和2892T，C2基因型包括2733C、1856T、1009T和2892T，C3基因型包括2733C、1856C、1009C和2892T；如果HBV的基因型為B，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C1，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31和/或53和/或1499位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C2，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第2170和/或2441和/或799位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C3，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第312和/或961和/或1613和/或1899位的核苷酸；和/或將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較，
其中在B基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T；其中在C1基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括31C；和/或53C；和/或1499G；和其中在C2基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G；其中在C3基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A；由此確定所述個體發展成為HCC的遺傳素因。
本發明還提供了確定與肝細胞癌(HCC)發展有關的HBV分離物的試劑盒。
在一些實施方案中，所述試劑盒包括一種或更多種探針，當其與HBV基因組接觸時，如果所述基因組包括至少一種下列對應於SEQ ID NO1中核苷酸位置的核苷酸時選擇性地與所述基因組雜交，所述核苷酸有31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1764G，1899A，2441C，2170C，2170G，2712A，2712C，2712G或2525C。
在一些實施方案中，所述探針與固體支持物相連。
在一些實施方案中，所述探針選擇性地雜交於1762T和1764A和2712A；和/或1762T和1764A和2712C；和/或；1762T和1764A和2712G；和/或1762T和1764A和2712T和2525C；和/或1762A和1764G和1165T。
在一些實施方案中，所述探針選擇性地雜交於31C；和53C；和1499G。
在一些實施方案中，所述探針選擇性地雜交於2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G。
在一些實施方案中，所述探針選擇性地雜交於312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
在一些實施方案中，所述試劑盒還包括用於擴增至少HBV基因組的部分的引物。
本發明還提供了計算機可讀的介質，該介質用於鑑定HBV序列是否有可能導致HCC發生。在一些實施方案中，所述計算機可讀介質包括a)接收信息的編碼，該信息描述對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525或2712位的核苷酸；b)將在a)中接收的核苷酸和HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較的編碼；及
c)提供確定導致HCC的HBV遺傳素因的編碼，其中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C、2712C，2712A或2712G。
定義當存在所述特定核苷酸(在特定位置)時，當所述探針與所述基因組雜交時，探針與包含特定核苷酸的病毒基因組「選擇性地雜交」，但在特定位置上的核苷酸是不同的核苷酸或缺失時則不發生雜交。只有特定的靶DNA中有互補核苷酸時，允許探針和特定DNA分子發生雜交的條件通常是「嚴謹雜交條件」。
「嚴謹雜交條件」是這樣一種條件，在該條件下探針通常在核酸的複雜的混合物中與其靶標子序列雜交，而不與其他序列雜交，或至少不與在其特定位置不是一種特定核苷酸而是其它核苷酸的其他序列雜交。嚴謹條件是序列依賴的且在不同情況下情況各異。在較高溫度下進行較長序列的特異性雜交。關於核酸雜交的廣泛指導參見Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays」(1993)。一般地，在給定離子強度、pH下對特異序列嚴謹條件的選擇通常比熱熔溫度(Tm)低5℃至10℃。Tm是指在該溫度下(給定離子強度、pH和核酸濃度)，50％與靶序列互補的探針和靶序列的雜交達到平衡(當靶序列過量時，在Tm，平衡時有50％的探針被結合)的溫度。對於Southern雜交的嚴謹條件一般是在pH 7.0-9.3之間，鹽濃度低於約1.0M鈉離子，通常約為0.01-1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，以及對短探針(例如10-50個核苷酸)該溫度為至少約30℃，對長探針(例如超過50個核苷酸)該溫度至少約為60℃的雜交條件。通過加入諸如甲醯胺的去穩定劑也能實現嚴謹條件。對選擇性雜交而言，陽性信號至少為背景的兩倍，也可為背景雜交的10倍，該背景雜交是在所述目的位置處與另外具有不同核苷酸的核酸序列的雜交。嚴謹雜交條件的示例如下50％甲醯胺、5×SSC、1％SDS、42℃孵育，或者是5×SSC、1％SDS、65℃孵育，用0.2×SSC、0.1％SDS、在65℃漂洗，該漂洗可進行5分鐘，15分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘或更長的時間。
參考序列(例如SEQ ID NO1)的特定核苷酸「對應位置處的HBV基因組中核苷酸的確定」是指對分離到的HBV基因組上等同於參考序列所述特定位置處的位置進行確定。本發明確定的變體不限於預測SEQ IDNO1變體遺傳素因的序列，還能應用於任何攜帶有特定對應核苷酸的HBV株。所以，當HBV分離物的基因組與SEQ ID NO1不同時(例如發生核苷酸的改變或核苷酸的添加或缺失)，與HCC發生有關的特定核苷酸有可能與其在SEQ ID NO1上的位置不完全一致。例如，由於在HBV株基因組較前位置有一個核苷酸的插入，對應於SEQ ID NO1上31C位的核苷酸位置在該特異HBV株中可能發生在32位的核苷酸位置上。儘管如此，通過對兩個序列的比對，能很容易地說明HBV株上的32位的核苷酸位置對應於SEQ ID NO1上的31位的核苷酸位置。如本發明所述，使用諸如BLAST的比對算法能在HBV分離物的基因組中確定對應的核苷酸。
附圖簡要說明

圖1所示為用於擴增HBV基因組區域的引物位置及產生的相對於HBV基因組的擴增片段的位置，在附圖底部用直線表示該HBV基因組。
圖2A和圖2B所示為示例性的B基因型HBV的分離物的基因組(SEQID NO1)，其包括與HCC發生相關的標記出的核苷酸。
圖3A和圖3B所示為示例性的C1基因型HBV分離物的基因組(SEQID NO2)，其包括與HCC發生相關的標記出的核苷酸。
圖4A和圖4B所示為示例性的C2基因型HBV分離物的基因組(SEQID NO3)，其包括與HCC發生相關的標記出的核苷酸。
具體實施方案I.引言本發明基於這樣一種發現，在感染了HBV的個體中，HBV的特定序列變異與肝細胞癌(HCC)的發生相關。特別地，HBV基因組中以下核苷酸的存在與HCC的發生相關31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A或2712G。據此，本發明提供了通過確定感染患者的HBV變體的核酸序列來確定感染了HBV的患者是否具有HCC的遺傳素因。該方法提供包括檢測任何與HCC相關的特異性變體的試劑的試劑盒，以及應用本發明方法的計算機可讀形式。
II.確定與HCC相關的HBV變體可採用多種方法來確定對應於SEQ ID NO1上、核苷酸的第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2721位和/或本發明所述其它位置的核苷酸。
在一些實施方案中，採用核苷酸測序技術對HBV基因組特定位置的核苷酸進行確定。並非是對本發明的限制，核苷酸測序的例子包括鏈末端測序。參見例如Sanger et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 745463-5467(1977)；Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。可在HBV基因組或其片段擴增後進行測序。也可以通過在PCR過程中向擴增子中選擇性地摻入抗硼化核酸酶的核苷酸以及對擴增子進行核酸酶消化以產生按大小排列的模板片段對PCR產生的擴增子進行直接測序(Porter et al.，Nucleic Acids Research 25(8)1611-1617(1997))。或者，也能採用如公開號為2003/0215862的美國專利公開中所描述的顯微流態(microfluidic)技術。也可參見公開號為2003/0215862的美國專利公開中所描述的替代測序方法。
也可使用與HBV基因組特定位置核苷酸結合的特異探針來確定HBV基因組中的核苷酸。檢測與HCC相關特定核苷酸的探針可用於反向雜交分析形式中，該形式採用固體支持物上不同位置固化的寡核苷酸探針。更特別地是能採用線性探針分析法(LiPA)的方法。該LiPA是在固體支持條片上固化有平行線型寡核苷酸探針的反向雜交分析方法。參見公開號為WO94/12670的PCT申請。在這種分析方法中，可將特異的寡核苷酸固化於膜片上的已知位置並在嚴格控制的條件下與標記的PCR產物雜交。可以設計不同的探針，使得所述條片上的每一個探針都包含HBV核苷酸序列或其互補序列，但在特定位置含有不同核苷酸。對HBV基因組或其片段進行的擴增，及將擴增產物與一種或更多種特定變體的探針雜交會導致一種所述探針對擴增產物全部或至少優先的雜交，從而提示所擴增的基因組中含有所述特定位置處的核苷酸。使用這種分析方法的雜交條件通常設置為高嚴謹性條件以至於只有一個探針可與擴增產物相結合。例如，示例性的條件包括例如標準的雜交和洗滌條件(例如，62℃時含有0.1％十二烷基磺酸鈉的1×SSC緩衝液)。
HBV的擴增在對與HCC相關位置的核苷酸進行確定之間就可以對HBV基因組或其部分進行擴增。「擴增」是指導致模板核酸序列拷貝數增加的包括酶反應在內的任何化學反應。擴增反應包括聚合酶鏈反應(PCR)和連接酶鏈反應(LCR)(參見美國專利第4,683,195和4,683,202號；PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications(Innis et al.，eds，1990))，鏈置換擴增(SDA)(Walker，et al.Nucleic Acids Res.20(7)1691-6(1992)；Walker PCRMethods Appl 3(1)1-6(1993))，轉錄介導擴增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34834-841(1996)；Vuorinen，et al.，J.Clin.Microbiol.331856-1859(1995))，基於核酸序列的擴增(NASBA)(Compton，Nature350(6313)91-2(1991)，滾環擴增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)35-40(1999))以及分支的DNA信號擴增(bDNA)(例如參見Iqbal et al.，Mol.Cell Probes13(4)315-320(1999))。
HBV基因組的擴增部分(隨意標記的)可與包括一個或更多HCC相關核苷酸或其互補核苷酸雜交，可使得在目的核苷酸位置對核苷酸的同一性進行確定。可選擇地，所述探針可確定非HCC相關核苷酸，使得可通過檢測雜交的缺乏來鑑定與HCC有關的HBV變體。
在一些實施方案中，所述基因組的擴增片段包括超過一種HCC相關核苷酸。因此，在一些實施方案中，所述片段就會包括對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位的核苷酸的任意組合形式。在一些實施方案中，所述片段包括對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位核苷酸。在一些實施方案中，所述片段包括對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170和2441位核苷酸。
以某些情況下，擴增超過一種的HBV片段。在這樣的情況下，所有擴增片段的總和包括對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位核苷酸的任意組合。例如，一個片段包括第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764位，另一個片段包括第1899，2170，2441，2525或2712位。在一些實施方案中，所有擴增片段的總和包括對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸位置。在一些實施方案中，所有擴增片段的總和包括對應於SEQ IDNO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170和2441位的核苷酸位置。
在一些實施方案中，組合使用擴增方法和檢測方法，有時在相同的反應容器中，使用可區分HCC相關核苷酸和非HCC相關核苷酸的可檢測標記探針來確定HBV寡核苷酸。探針與其互補雜交序列的結合使得用戶可在無需將反應容器中的組分去除條件下就可以對特定序列的累積進行定量。通常，根據本發明所述的方法，可使用用於不同探針確定和區分的任何類型的標記。
可採用本領域公知的任意方法對擴增產物的累積進行定量。例如，通過對特定波長光的檢測對探針的螢光進行確定。類似的，也可檢測連於所述探針的酶反應產生的多種化學產物的累積，例如確定特定波長的吸光度。在另一些實施方案中，通過將其轉印在固體支持物上並與可檢測標記的核酸探針雜交能夠對擴增反應直接進行定量。一旦未結合的探針被洗掉，就可採用本領域所屬技術人員公知放射性檢測來對探針進行定量。這項技術的其他變化是可使用化學發光方法來鑑定雜交事件。
能夠在反應結束之後或「實時地」(即當反應進行時)對擴增產物進行檢測。如果對擴增產物的檢測是在擴增反應完成後進行的，那麼就在擴增反應結束後加入檢測試劑(探針)。可選擇地，在擴增反應前或反應過程中加入探針，就可以使得在擴增反應完成後或實時地對擴增產物進行檢測。由於允許在所述反應的任意給定循環進行檢測並因此提供整個反應過程中的產物積累的更多信息，因此實時檢測尤其有用。通常使用螢光探針對擴增產物進行實時檢測。
一種使用FRET對(pair)檢測擴增產物的擴增分析方法為「Taqman」分析，參見Gelfand等人專利號為5,210,015的美國專利和Livak等人專利號為5,538,848的美國專利。該探針是標記有FRET對的單鏈寡核苷酸。在Taqman分析中，當與靶鏈雜交時，DNA聚合酶通過對寡核苷酸進行剪切釋放出一個或多個核苷酸。該釋放過程為分離FRET對的猝光劑標記和螢光團標記提供了方法。
使用FRET對的另一種核酸雜交探針分析如Tyagi等人專利號為5,925,517的美國專利所述，其使用標記的寡核苷酸探針被稱為「分子燈塔」。參見Tyagi，S.and Kramer，F.R.，Nature Biotechnology 14303-308(1996)。分子燈塔探針是這樣一種寡核苷酸，在缺乏靶序列的時候，其末端相互雜交在一起；而如果該探針的中部與其靶序列雜交時，其末端相互分開。探針-靶序列雜交體的剛性排除了探針-靶序列雜交體和通過所述末端區域形成的分子間雜交體同時存在的情況。所以，探針發生了構象改變，在這一過程中，通過末端區域形成的較小的雜交體發生解離，同時由於剛性的探針-靶序列雜交體使得該末端區域相互分開。對分子燈塔探針來說，其中部的靶識別序列側翼連接有臂，在探針不與靶鏈雜交時其相互雜交形成「髮夾」結構，其中靶識別序列(通常是指「探針序列」)是髮夾結構的單鏈環，而該臂序列形成雙鏈莖雜交結構。當探針與靶序列雜交時，也就是說，當靶識別序列與互補的靶序列雜交時，會形成具有相當剛性的螺旋，使得莖雜交結構解開並迫使該臂分離。
本領域所屬技術人員應認識到，能夠使用大量不同螢光團來標記用於本發明的探針。用於本發明方法和組合物中的螢光團包括螢光素，異硫氰酸螢光素(FITC)，羧基四氯螢光素(TET)，NHS-螢光素，5和/或6-羧基螢光素(FAM)，5-(或6-)碘乙醯胺螢光素，5-{[2(和3)-5-(乙醯巰基)-琥珀醯]胺基}螢光素(SAMSA-螢光素)及其他螢光素衍生物，若丹明，麗斯胺若丹明B磺醯氯，德克薩斯紅磺醯氯，5和/或6羧基若丹明(ROX)及其他若丹明衍生物，香豆素，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3乙酸(AMCA)及其他香豆素衍生物，BODIPYTM螢光團，諸如8-甲氧基芘-1，3，6-三磺酸三鈉鹽的Cascade BlueTM螢光團，諸如3，6-二磺酸-4-氨基-naphthalimide的金星(Lucifer)黃螢光團、藻膽蛋白衍生物、Alexa氟石染料(來自於Molecular Probes，Eugene，OR)以及其他本領域公知的螢光團。有用螢光團的常用列表參見Hermanson，GT.，BIOCONJUGATETECHNIQUES(Academic Press，San Diego，1996)。所以，反應中使用的每一種探針都能在不同的波長產生螢光且能被單獨確定出來而不會與其他探針相互幹擾。例如，在反應中使用在特定位置鑑定不同核苷酸的探針時這是非常有用。因此，例如一種波長可提示確定31T的探針結合，而另一含有不同波長的探針則可以鑑定31C。
從檢測樣本製備HBV通過在HBV基因內擴增靶區域來確定檢測樣本中HBV核酸的存在和數量。所以任何認為含有HBV核酸的液態或固態材料都可以成為合適的樣本。優選的樣本組織包括血漿、血清、全血、血細胞、淋巴液、腦脊液、滑液及其他。
本發明所用「檢測樣本」是指任何認為含有HBV核酸的液態或固態材料。檢測樣本可通過諸如例如人的動物的培養細胞或組織樣本的生物來源獲得。本發明中的樣本組織包括且不限於血漿、血清、全血、血細胞、淋巴液、腦脊液、滑液、尿液、唾液和皮膚及其他器官(例如肝活體材料)。
這些樣本通常採自於懷疑感染HBV、或者是任何涉及HBV感染的廣譜肝臟疾病患者。
從組織樣本中能提取到代表HBV目的基因的核酸。多種商業化的核酸純化試劑盒，例如在本領域所屬技術人員公知的QIAmp 96 VirusBioRobot Kit和Qiagen′s BioRobot 9604被用來從樣本中提取HBV核酸。
III.HBV基因型的鑑定本方法還涉及對個體HBV基因型的鑑定。例如，如果在一種基因型而不是另一種基因型中發現有該變異，那麼本發明所鑑定的特定核苷酸變異可能具有更強的導致HCC的遺傳素因。本文中「基因型」是指從基因組比較推導而來的至少8種HBV的基因型，並將其指定為基因型A到基因型H。參見例如Westland C.Hepatology 362-8(2002)；Borchani-Chabchoub I，et a1.，Microbes infect 2607-12(2000)；Grandjacques C，et al.，J Hepatol 33430-9(2000)；Kato H，et al.，J VirolMethods 98153-9(2001)；Ashton-Rickardt PG，et al.，J Med Virol 29204-14(1989)。所以，通過確定所鑑定的特異位置的核苷酸，該核苷酸只在特異的基因型中出現，就可以確定HBV的基因型。當然，諸如血清學方法的其他方法也是可用的。
在一些實施方案中，可對基因型B或C的HBV的存在與否進行鑑定。在一些實施方案中，基因型B包括2733C，1856C，1009T和2892T。此外，還可以鑑定基因型的亞型。例如，在一些實施方案中，C1亞型的特徵為2733A，1856C，T1099T和2892T。在一些實施方案中，C2亞型的特徵為2733C，1856T，1009T和2892T。在一些實施方案中，C3亞型的特徵為2733C，1856C，1009C和2892T。詳細描述見下表

可通過任意用於核苷酸序列檢測方法來鑑定與某種特定基因型相關的核苷酸，包括所有本發明描述的方法(例如擴增、核苷酸測序和/或探針等等)。
IV.將與HCC相關的核苷酸和HBV核苷酸進行比較可以採用任意方法對來源於個體分離物的核苷酸序列信息和與HCC相關的核苷酸進行比較。
當分離物中的核苷酸序列被確定，就可將該序列與SEQ ID NO1或其他的HBV基因組序列進行比對從而確定目的特異核苷酸的位置。用於比較的序列比對的方法在本領域中是公知的。最佳的用於比較的序列比對方法可以通過以下實施，例如通過Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2482(1981)的本地同源性算法，通過Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson和Lipman Proc.Nat』l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性方法的搜尋，通過(GAP，BESTFIT，FASTA和威斯康星遺傳軟體包中TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)這些算法的計算機執行，或者通過手工比對和肉眼檢查(例如參見Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995 supplement))。
一個適合於序列比對及確定序列一致性和序列相似性百分率的例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分別在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中描述。用本發明的參數，可用BLAST和BLAST2.0來確定最佳的比對。由國立生物信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)免費提供進行BLAST分析的軟體。該算法涉及首先通過鑑定在查詢序列中長度為W的短字節來定義高分值的序列對(HSP)，當在資料庫序列中與具有相同長度的字節進行比對時，該高分值序列對要麼匹配要麼滿足正值域值T。T是指相鄰字節分值域(上述的Altschul et al.，)。這些初始的相鄰字節的擊中作為種子發揮作用，用來啟動發現包含它們的更長HSPs的搜尋。字節擊中沿著每一條序列的兩個方向進行延伸直到累積的比對數值得以增加。對核苷酸序列來說，累積的數值由參數M(一對匹配的殘基的獎勵分數，總是大於0)和N(對不匹配殘基的懲罰分數，總是小於0)來進行計算。對胺基酸序列來說，使用評分矩陣來計算累計分數。在每一方向上字節擊中延伸的停止有以下幾種情況積累的比對分數從其最大達到值降低了X；由於一個或更多負分數的殘基比對，使得積累分數達到零或更低；或者已達到任一序列的末端。BLAST算法中的參數W、T和X確定比對的敏感性和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用字節(W)長11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4以及兩條鏈的比較的默認值，並且通常用於關閉複雜性過濾。
參照第一EcoRI剪切位點(GAACTCC)的第一C，其在HBV基因組中經常出現，在全部本申請中提供目的核苷酸的位置。該第一「C」就是SEQ ID NO1中的位置1。從而在將目的序列與SEQ ID NO1比對之後，目的序列上的特定核苷酸就可以被指定位置，該位置相對於與SEQ IDNO1比對中的對應位置。
下列任意核苷酸的存在提示HCC的遺傳素因31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A或2712G。儘管本領域所屬技術人員應理解，算法的任何數目可用來預測HCC發生的遺傳素因，如實施例所述，但是採用下列算法可獲得特別好的敏感性和特異性。
對B基因型HBV來說，以下核苷酸的存在提示HCC的遺傳素因，所述核苷酸為1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T。
對C1基因型的HBV來說，以下核苷酸的存在提示HCC的遺傳素因，所述核苷酸為31C；和/或53C；和/或1499G。
對C2基因型的HBV來說，以下核苷酸的存在提示HCC的遺傳素因，所述核苷酸為2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G。
對C3基因型的HBV來說，以下核苷酸的存在提示HCC的遺傳素因，所述核苷酸為312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
在本發明的一些實施方案中，將上述所列算法應用於計算機可讀的形式是非常有用的。實施本發明所描述的任何功能的編碼可被數碼計算機執行並可被儲存於任何適於計算機閱讀的介質中。計算機可讀的介質的例子包括磁碟、電盤或光碟、磁帶、記憶棒、晶片等等。實施本發明所描述的任何功能的編碼可採用任意適於計算機編程的語言進行編寫，包括例如Fortran、C、C++等等。使用諸如Java等目的定向程式語言可以創建圖形用戶界面及實施圖形用戶界面的功能。
V.鑑定具有HCC遺傳素因個體的優越性HCC普查的傳統方法是對感染人員血清的α-胎蛋白水平進行檢測(例如，參見Liaw Y F et al.，Gastroenterology，30263-267(1986)；ColomboM.et al.，N.Engl.J.Med.，325675-680(1991)；Oka H.et al.，Hepatology12680-687(1990)或對病人進行腹部超聲波掃描。其他診斷HCC的方法還有檢測去甲基(des)-γ-羧基凝集素(Chan C Y et al.J Hepatol.1321-24(1991)；Weitz I C et al.，Hepatology 18990-997(1993))。HCC的另一個標記是TGF-1β。例如，參見美國專利公開第2004/0121414號。
然而，由於缺乏關於哪個患者對HCC有遺傳素因的的信息，因此有必要在常規水平對每個感染HBV的患者進行篩查以儘早確診HCC。然而然而，如果太多的人都感染了HBV，且可對個體進行篩查的資源有限，不可能進行所有必要的篩查。通過指明哪些個體需要初始的HCC信號的深入篩查而哪些個體不需要接受這種深入的篩查，本發明解決了這個問題。所以，本發明提供對攜帶引起HCC遺傳素因的HBV的那些個體的檢測，並隨後對這些個體在常規水平進一步檢查HCC的存在，以及隨意地、僅在極少數情況下或從來都不對那些缺乏HCC有關的HBV變異體的個體進行檢查。
VI.試劑盒本發明的特徵在於包括本發明方法所必需成分(通常以一種非混合形式)以及裝有這些成分的試劑盒組分(包裝材料，使用這些成分和/或方法的指導，一個或更多容器(反應管、柱等))的試劑盒。本發明的試劑盒包括在HBV基因組中確定以下任意或更多核苷酸變異體的試劑，這些核苷酸變異體有31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A和/或2712G。例如，本發明的試劑盒包括本發明的用於確定與HCC相關核苷酸變異體的引物和/或探針的組合。隨意地，試劑盒可含有擴增的試劑，包括但不僅限於諸如Taq聚合酶的熱穩定聚合酶、核苷酸、緩衝液等等。
實施例我們的目標是從HBV的DNA序列中發現HCC病例的遺傳標誌物。換句話說，我們建立了基於HBV DNA的癌症預測分類模型。已有一些分類模型被應用於DNA數據集的分類，包括自然貝葉斯模型( Bayes)、決定樹模型(Decision Tree)、神經網絡模型(Neural Networks)和使用進化算法學習規則(Rule Learning Using Evolutionary Algorithm)模型。實驗結果表明使用進化算法學習規則性能最好。在本部分中，我們展示的是採用使用進化算法學習規則模型對肝癌和正常病例HBV的DNA進行分類的結果。
實驗方法在每一次實驗中，隨機選取90％的樣本作為教練組，而剩餘的10％樣本則形成了檢驗組。對每一個數據集來說，重複10次實驗。
在醫療診斷和疾病預測問題中，算法或模型的性能好壞不僅是由準確性，還是由敏感性和特異性進行判斷的。在通常情況下，敏感性在醫療診斷中比特異性和準確性更為重要，因為醫生和患者都不情願對患有疾病的患者漏診。可以採取額外的診斷和檢測來確認他們的預測並排除起初的假陽性診斷。
我們採取了所有這三種檢測手段來對我們的模型進行評估。



真陽性是指患有該疾病且具有陽性檢測結果的所有患者數量，而真陰性是指未患病且檢測結果為陰性的所有患者數量。假陽性是指未患病而檢測結果卻為陽性的所有患者數量，而假陰性是指患病而檢測結果卻為陰性的所有患者數量，假陰性是最不期望發生的事件。
結果數據描述將B基因型和C基因型的數據分別進行分析。每種基因型或C亞型的患者比例如表2所示。「CON」的指「對照組」，即未患HCC。
表2

B基因型B基因型HBV標誌物的詳細描述如表3所示。
表3.B基因型HCC的HBV標誌物

B基因型的基於應用數據純淨過程的分類規則如下所述如果在B基因型中出現1762A、1764G和1165T，那麼就有可能發生HCC。
如果在B基因型中出現1762T、1764A和2712A，2712C或2712G，那麼就有可能發生HCC。
如果在B基因型中出現1762A、1764A、2712T和2525C，那麼就有可能發生HCC。
B基因型數據集的實驗結果如表4所示。
表4.預測HCC的B基因型HBV數據集結果

C1亞組Cl亞組標誌物的詳細描述如表5所示。
表5.C1亞組的HCC相關標誌物

C1亞組的基於應用數據純淨過程的分類規則如下所述如果在C1基因型中出現31C或53C或1499G，那麼就有可能發生HCC。
C1亞組的實驗結果如表6所示。
表6.預測HCC的C1基因型HBV數據集結果

C2亞組C2亞組標誌物的詳細描述如表7所示。
表7.C2亞組的HCC相關標誌物

C2亞組的基於應用數據純淨過程的分類規則如下所述如果在C2基因型中出現2170C或2170G或2441C或799G，那麼就有可能發生HCC。
C2亞組的實驗結果如表8所示。
表8.預測HCC的C2基因型數據集結果

C3亞組的基於應用數據純淨過程的分類規則如下所述如果在C3基因型中出現C312或G961或A1613或A1899，那麼就有可能發生HCC。
C3亞組的實驗結果如表9所示。
表9.預測HCC的C3基因型數據集結果

患者與方法患者對100例患有肝細胞癌(HCC)的慢性B肝患者和100例年齡匹配的患有慢性B肝但未患肝細胞癌的對照患者的殘留血清樣本進行研究。包括了從1999年7月到2001年，連續到威爾斯王子醫院聯合肝細胞瘤診所就診(Joint Hepatoma Clinic，Prince of Wales Hospital)、並被確診為攜帶有陽性HBsAg的HCC患者。通過對有500μg/l或更高的血清α-胎蛋白(AFP)的肝組織塊的組織學或放射檢查對HCC進行確診。抗-HCV陽性或有酗酒史的患者排除在外。在聯合肝細胞瘤診所，在對所取血清樣本用於試驗研究知情同意的條件下對患者進行常規血清樣本採集。對參加患者的相關醫療信息進行了可追溯地收集。
自1997年12月後，在肝炎診所預期隨訪的大量的慢性B肝患者中鑑定出年紀匹配對照患者。患有其他原因引起的肝炎或患有包括自己免疫性肝病、原發性膽汁肝硬化、威爾遜氏病和血色素沉積症的肝硬化患者也被排除在外。在初次問診時，採用腹部超聲波對預先存在的HCC進行排除。每6個月對患者進行預期隨訪，如果有臨床指徵隨診應更頻繁，監測肝生化、HBeAg和抗HBe水平以及α-胎蛋白水平。一旦α-胎蛋白的水平高於50μg/l或有超過20μg/l的上升趨勢，就採用腹部超聲波、計算機X線斷層攝影術、肝血管造影和/或肝臟活組織檢查來對HCC進行確診。對具有正常α-胎蛋白水平的患者，每1到2年進行一次腹部超聲波檢查。
實驗室方法DNA的提取按照製造商提供的說明書採用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，CA，USA)提取血清病毒DNA。
HBV DNA的擴增為了獲得全長的HBV DNA序列，採用長距離半巢式PCR來擴增三段相互重疊的片段(A、B和C)。這些PCR片段對於HBV基因組圖譜的相對位置如圖1所示，表1中為PCR引物的核酸序列。
表1.用於對HBV DNA進行擴增和測序的引物序列

a這些引物也可於測序片段A對片段A進行擴增時，將5μl提取的DNA加入到50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl、200μM每一種dNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)、1.5單位pfu DNA聚合酶(Promega)、以及10pmol引物P1和P2中，終體積50μl進行PCR。PCR的反應條件為95℃變性5分鐘，然後擴增10個循環(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，2.5分鐘)，再擴增30個循環(94℃，36秒；50℃，36秒；72℃，2.5分鐘)，最後在72℃延伸7分鐘。
對這些PCR產物再進行半巢式PCR擴增。將1μl上述PCR產物加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2，、10mM Tris-HCl、200μM每一種dNTP、2.5單位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和10pmol引物P1和P3中，終體積為50μl進行PCR。PCR反應條件為95℃變性5分鐘，然後擴增10個循環(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，2分鐘)，再擴增30個循環(94℃，36秒；52℃，36秒；72℃，2分鐘)，最後在72℃延伸7分鐘。通過在1X TBE緩衝液中對含有溴化乙碇的1％瓊脂糖凝膠進行電泳來對PCR產物的質量和數量進行檢測。
片段B對片段B進行擴增時，將5μl提取的DNA加入到50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl、200μM每一種dNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)、1.5單位pfu DNA聚合酶(Promega)，以及10pmol引物P4和P5中，終體積50μl進行PCR。PCR的反應條件為95℃變性5分鐘，然後擴增10個循環(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，90秒)，再擴增30個循環(94℃，36秒；50℃，36秒；72℃，90秒)，最後在72℃延伸7分鐘。
對這些PCR產物再進行半巢式PCR擴增。將1μl上述PCR產物加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2，、10mM Tris-HCl、200μM每一種dNTP、2.5單位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和10pmol引物P5和P6中，終體積為50μl進行PCR。PCR反應條件為95℃變性5分鐘，然後擴增10個循環(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，90秒)，再擴增30個循環(94℃，36秒；52℃，36秒；72℃，90秒)，最後在72℃延伸7分鐘。通過1×TBE緩衝液在含有溴化乙碇的1％瓊脂糖凝膠上進行電泳來對PCR產物的質量和數量進行檢測。
片段C對片段C進行擴增時，將5μl提取的DNA加入到50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl、200μM每一種dNTP、1.25單位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)、1.5單位pfu DNA聚合酶(Promega)，以及10pmol引物P7和P9中，終體積50μl進行PCR。PCR的反應條件為95℃變性5分鐘，然後擴增10個循環(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，2分15秒)，再擴增30個循環(94℃，36秒；50℃，36秒；72℃，2分15秒)，最後在72℃延伸7分鐘。
對這些PCR產物再進行半巢式PCR擴增。將1μl上述PCR產物加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2，、10mM Tris-HCl、200μM每一種dNTP、2.5單位Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和10pmol引物P8和P9中，終體積為50μl進行PCR。PCR反應條件為95℃變性5分鐘，然後擴增10個循環(94℃，36秒；60℃，36秒；72℃，1分50秒)，再擴增30個循環(94℃，36秒；52℃，36秒；72℃，1分50秒)，最後在72℃延伸7分鐘。通過1×TBE緩衝液在含有溴化乙碇的1％瓊脂糖凝膠上進行電泳來對PCR產物的質量和數量進行檢測。
DNA測序使用MegaBACE的循環測序試劑盒DYEnamic ET染料終止基因(Cycling Sequencing Kit DYEnamic ET Dye terminator)對所有半巢式PCR產物(正鏈和負鏈)進行直接測序。
對三個HBV DNA片段進行測序的引物序列(引物序列如表1所列)如下片段AS1，S2，P3，S9片段BP6，P7，S7，S8片段CP8，S3，S4，P9，S5，S6取1微升未純化的PCR產物作為循環測序的DNA模板。將其加入到8μl DYEnamic ET試劑預混物和10pmol引物中，終體積為20μl進行測序反應。對測序反應混合物進行95℃起始變性2分鐘，然後以95℃，25秒；52℃，30秒；60℃，60秒擴增30個循環。
使用乙醇沉澱的反應後清洗的方法對測序產物進行純化。在每個反應管中加入2μl 7.5M的乙酸胺和2.5倍體積(55μl)的100％乙醇，使得乙醇的終濃度為75％。然後在14℃4000rpm離心30分鐘。再採用短暫的倒置旋轉(500rpm 1分鐘)將上清液去除。將DNA沉澱用100μl的70％乙醇洗一遍。然後在14℃4000rpm離心30分鐘，並採用短暫的倒置旋轉(500rpm 1分鐘)將上清液去除。空氣乾燥DNA沉澱並用10μl上樣緩衝液重懸(70％甲醯胺和1mM EDTA)。在使用MegaBACE 1000 DNA測序儀進行凝膠電泳分析之前，樣品保存於4℃。
應當理解，本發明所描述的實施例和實施方案僅為說明目的。本領域所屬技術人員根據其教導，能夠進行多種改進和變化。這些改進和變化應符合本申請的實質，涵蓋於所附權利要求的範圍內。本申請引用的所有出版物、專利和專利申請均全部引入作為參考。
權利要求
1.確定感染B型肝炎病毒的個體發展成肝細胞癌(HCC)的遺傳素因的方法，該方法包括確定分離自所述個體的HBV基因組中對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525和/或2712位的核苷酸；及將確定的核苷酸和導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中所述導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸包括31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1764A，1899A，2170C，2170G，2441C，2525C，2712C，2712A和/或2712G。
2.如權利要求1所述的方法，所述方法包括確定分離自所述個體的B基因型HBV基因組中對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525或2712位的核苷酸；及將確定的核苷酸和導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中所述導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸包括1165T，1762T，1764A，2525C，2712C，2712A或2712G。
3.如權利要求1所述的方法，所述方法包括確定分離自所述個體的B基因型HBV基因組中對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；及將確定的核苷酸和導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中所述在B基因型中導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸包括1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。
5.如權利要求3所述的方法，其中所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包括對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸的擴增產物。
6.如權利要求5所述的方法，包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述雜交是以線性探針分析法進行的。
8.如權利要求3所述的方法，還包括確定來自於所述個體的HBV基因型。
9.如權利要求1所述的方法，所述方法包括確定分離自所述個體的C基因型HBV基因組中對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1499，1613，1899，2170或2441位的核苷酸；及將確定的核苷酸和導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中所述導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸包括31C，53C，312C，799G，961G，1499G，1613A，1899A，2170C，2170G或2441C。
10.如權利要求9所述的方法，所述方法包括a)確定來自所述個體C基因型HBV的亞型，其中C1亞型包括的核苷酸為2733A，1856C，1009T和2892T，C2亞型包括的核苷酸為2733C，1856T，1009T和2892T，和C3亞型包括的核苷酸為2733C，1856C，1009C和2892T；b1)如果HBV的基因型為C1，則確定對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53和1499位的核苷酸；或b2)如果HBV的基因型為C2，則確定對應於SEQ ID NO1中核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸；及b3)如果HBV的基因型為C3，則確定對應於SEQ ID NO1中核苷酸第312，961，1613，1899位的核苷酸；及c)將確定的核苷酸和導致HCC遺傳素因相關的核苷酸在所述相關位置上進行比較，其中在C1亞型中導致HCC的遺傳素因相關的所述核苷酸包括31C；和/或53C；和/或1499G；及C2亞型中導致HCC的遺傳素因相關的所述核苷酸包括2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G；及C3亞型中導致HCC的遺傳素因相關的所述核苷酸包括312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ ID NO1上核苷酸第31，53和1499位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ ID NO1上核苷酸第799，2441和2170位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述確定步驟包括對側翼連接有對應於SEQ ID NO1上核苷酸第312，961，1613和1899位的核苷酸的HBV基因組進行核苷酸測序。
14.如權利要求10所述的方法，其中所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包含有對應於SEQ ID NO1上核苷酸第31，53和1499位核苷酸的擴增產物。
15.如權利要求10所述的方法，其中所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包含有對應於SEQ ID NO1上核苷酸第799，2441和2170位核苷酸的擴增產物。
16.如權利要求10所述的方法，其中所述確定步驟包括對至少HBV基因組的部分進行擴增，以產生一種或更多種包含有對應於SEQ ID NO1上核苷酸第312，961，1613和1899位核苷酸的擴增產物。
17.如權利要求14所述的方法，包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為31C；和/或53C；和/或1499G。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述雜交是以線性探針分析法進行的。
19.如權利要求14所述的方法，包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述多種探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述雜交是以線性探針分析法進行的。
21.如權利要求14所述的方法，包括將所述一種或更多種擴增產物與一種或更多種能與HCC相關核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴增產物在HCC相關核苷酸位置含有互補核苷酸的條件下，所述多種探針與所述擴增產物才能進行雜交，所述相關核苷酸為312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述雜交是以線性探針分析法進行的。
23.如權利要求10所述的方法，還包括確定所述個體HBV的基因型。
24.如權利要求1所述的方法，所述方法包括確定HBV的基因型，其中B基因型包括2733C、1856C、1009T和2892T，其中C1基因型包含2733A、1856C、099T和2892T，C2基因型包含2733C、1856T、1009T和2892T，C3基因型包含2733C、1856C、1009C和2892T；如果HBV的基因型為B，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第1165，1762，1764，2525和2712位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C1，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31和/或53和/或1499位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C2，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第2170和/或2441和/或799位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C3，則確定HBV基因組上對應於SEQ ID NO1中核苷酸第312和/或961和/或1613和/或1899位的核苷酸；及將確定後的核苷酸和導致HCC遺傳素因相關的核苷酸進行比較，其中在B基因型中導致HCC遺傳素因相關的核苷酸包括1762T和1764A和2712A；或1762T和1764A和2712C；或1762T和1764A和2712G；或1762T和1764A和2712T和2525C；或1762A和1764G和1165T；其中在C1基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括31C；和/或53C；和/或1499G；和其中在C2基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G；其中在C3基因型中與HCC遺傳素因相關的核苷酸包括312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A；由此確定所述個體發展成為HCC的遺傳素因。
25.確定與肝細胞癌(HCC)發展有關的HBV分離物的試劑盒，包括一種或更多種探針，當其與HBV基因組接觸時，如果所述基因組包括至少一種下列對應於SEQ ID NO1中核苷酸位置的核苷酸時會選擇性地與所述基因組雜交，所述核苷酸是31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1764G，1899A，2441C，2170C，2170G，2712A，2712C，2712G或2525C。
26.如權利要求25所述的試劑盒，其中所述探針與固體支持物相連。
27.如權利要求25所述的試劑盒，其中所述探針選擇性地雜交於1762T和1764A和2712A；和/或1762T和1764A和2712C；和/或；1762T和1764A和2712G；和/或1762T和1764A和2712T和2525C；和/或1762A和1764G和1165T。
28.如權利要求25所述的試劑盒，其中所述探針選擇性地雜交於31C；和53C；和1499G。
29.如權利要求25所述的試劑盒，其中所述探針選擇性地雜交於2170C；和/或2170G；和/或2441C；和/或799G。
30.如權利要求25所述的試劑盒，其中所述探針選擇性地雜交於312C；和/或961G；和/或1613A；和/或1899A。
31.如權利要求25所述的試劑盒，還包括對至少HBV基因組的部分進行擴增的引物。
32.計算機可讀的介質，包括a)接收信息的編碼，該信息描述對應於SEQ ID NO1中核苷酸第31，53，312，799，961，1165，1499，1613，1762，1764，1899，2170，2441，2525或2712位的核苷酸；b)將在a)中接收的核苷酸和導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸進行比較的編碼；及c)提供確定導致HCC的HBV遺傳素因的編碼，其中導致HCC的遺傳素因相關的核苷酸包括31C，53C，312C，799G，961G，1165T，1499G，1613A，1762T，1762A，1764A，1764G，1899A，2441C，2170C，2170G，2712A，2712C，2712G或2525C。
全文摘要
本發明提供了預測HBV感染個體發展成肝細胞癌(HCC)的遺傳素因的方法。
文檔編號C07H21/00GK1769495SQ20051009867
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月9日 優先權日2004年9月10日
發明者沈祖堯, 陳力元, 徐國榮, 梁廣錫, 莫樹錦, 安傑蘭·巴託洛梅烏斯, 梁慧儀, 李健康 申請人:香港中文大學, 醫院管理局