一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒的製作方法
2023-06-11 22:48:41
一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒。該試劑盒用磁珠法提取樣本核酸，採用實時螢光定量PCR技術，以HCV基因組的高度保守區域為擴增靶目標，設計特異性引物及TaqMan探針，在實時螢光PCR儀上通過PCR擴增對HCV基因進行快速、準確分型檢測。
【專利說明】—種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於C型肝炎病毒基因型檢測【技術領域】，涉及一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]磁珠法是近年發展迅速且被廣泛應用的一種核酸提取方法，其優於傳統方法的特點可以總結為以下幾點:提 取體積可變性大、吸附核酸專一性強、純度高、可實現自動化操作。
[0003]實時螢光PCR技術(FQ-PCR)把PCR、分子雜交和光化學融為一體，使PCR擴增和產物分析的全過程均在單管封閉條件下進行。實時螢光PCR技術與其它檢測技術相比具有以下優勢:(1)與免疫學檢測比較，具有更高的靈敏度，從理論上講只要有一個基因拷貝就可以檢測出來。(2)根據各種病原體獨特的保守基因序列設計引物，能夠保證PCR反應的高度特異性，避免交叉反應。(3)能對病毒進行定量檢測，可反映出患者體內病原體拷貝數的高低和複製情況。定量檢測有助於判斷病原體感染與疾病發生和發展的關係，探討藥物對病原體的作用，了解感染性疾病病人用藥後病情的變化情況。這對理解發病機制和預測抗病毒治療的有效性十分關鍵。(4)可擴大檢測人群的範圍，適用於大規模的流行病調查。對手足口病這類自然感染率極高的病原微生物尤其適用。(5)將PCR敏感性與探針特異性相結合，在很大程度上改變了傳統PCR的缺陷，縮短了反應時間，簡化了操作步驟。(6)全過程均在單管封閉條件下進行，避免了由於樣本間交叉引起的假陰性和環境汙染。(7)實時檢測技術可連續不斷的檢測PCR過程中榮耀信號的變化，避免了傳統PCR的「平臺期效應」，並且模板的定量不通過終產物，而由Ct值算出，準確性和靈敏性都有提高。
[0004]國內少有基於實時螢光定量PCR技術定量檢測HCV (C型肝炎病毒，hepatitis Cvirus)基因型的試劑盒應用於臨床檢測中，這些試劑盒所提供的HCV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。該類試劑盒存在很多不足之處:1)檢測靈敏度低，約在10000IU/ml左右；檢測範圍窄，一般在1.00E+04IU/ml~1.00E+07IU/ml之間，對於臨床高值(大於
5.00E+07IU/ml)和低值(小於1.00E+04IU/ml)的樣本無法檢測；2)對於HCV基因型覆蓋不全，只能檢測其中某種基因型下的亞型；3)酚-氯仿法是最經典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對於設備和人員操作要求高，低病毒載量的標本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時長，特異性較差；4)無法有效去除樣本中的PCR抑制物(如:血脂、強溶血等)；5)國外試劑成本和耗材成本太高，很難在臨床廣泛開展。
[0005]因此，目前存在的問題是針對現有C型肝炎病毒基因型螢光定量PCR檢測試劑盒的缺陷，研究開發一種覆蓋型別全面、RNA提取得率高、檢測靈敏度高、檢測範圍寬而準確的HCV基因型螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒可以對血漿等未知樣本中的HCV-RNA進行快速、準確分型檢測，檢測結果可用於HCV分型的輔助診斷。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒。該試劑盒用磁珠法提取樣本核酸，採用實時螢光定量PCR技術，以HCV基因組的高度保守區域為擴增靶目標，設計特異性引物及TaqMan探針，在實時螢光PCR儀上通過PCR擴增對HCV基因進行快速、準確分型檢測。
[0007]為此，本發明一方面提供了一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒，其包括6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液，所述6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液中均含有用於靶多核苷酸檢測的探針和用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物，且所述引物和探針的序列為，
[0008]HCVl 型 PCR 反應液:
[0009]上遊引物HCVl-F:5』-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3』 ；
[0010]下遊引物HCVl-R:5』-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3』 ；
[0011]探針HCVl-P:5』FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13』 ；
[0012]HCV2 型 PCR 反應液:
[0013]上遊引物HCV2-F:5』-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3』 ；
[0014]下遊引物HCV2-R:5，-GCCTTTCGCAACCCAACG-3，；
[0015]探針HCV2-P:5，FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13，；
[0016]HCV3 型 PCR 反應液:
[0017]上遊引物HCV3-F:5』-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3』 ；
[0018]下遊引物HCV3-R:5』-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3』 ；
[0019]探針HCV3-P:5』FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13』 ；
[0020]HCV4 型 PCR 反應液:
[0021]上遊引物HCV4-F:5』-TTCGCCGACCTCATGGGA-3』 ；
[0022]下遊引物HCV4-R:5』-CCGTCCTCCACAGCCCTGA-3』 ；
[0023]探針HCV4-P:5』FAM-CCAGGGCTCTGGCGACGCCAC-BHQ13』 ；
[0024]HCV5 型 PCR 反應液:
[0025]上遊引物HCV5-F:5』-GGTCGCAACCCCGTGGAC-3』 ；
[0026]下遊引物HCV5-R:5』-CACCCTGCCCACCCGAG-3』 ；
[0027]探針HCV5-P:5』FAM-ACCCCAGGACCGGCCCGTG-BHQ13』 ；
[0028]HCV6 型 PCR 反應液:
[0029]上遊引物HCV6-F:5』-CATGGGGTACATTCCCGTCG-3』 ；
[0030]下遊引物HCV6-R:5，-TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3，；
[0031]探針HCV6-P:5』 FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13』。
[0032]根據本發明，所述6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液中均含有PCR反應緩衝液、脫氧核糖核苷三磷酸。
[0033]在本發明的一個實施例中，每種所述基因型的PCR反應液中含有5 X PCR反應緩衝液10 μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸,0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針。[0034]根據本發明，所述試劑盒中還包括C型肝炎病毒分型酶混合液、C型肝炎病毒分型陰性對照和C型肝炎病毒分型陽性對照，其中，所述C型肝炎病毒分型酶混合液包括Tth酶、H-Taq DNA聚合酶。
[0035]在本發明的一個實施例中，所述HCV分型酶混合液含有5U/ μ I~15U/ μ I的Tth酶和IU/ μ I~IOU/ μ I的H-Taq DNA聚合酶。
[0036]在本發明另一個實施例中，所述HCV分型陽性對照為標定已知濃度的假病毒，其濃度為1.00~5.00E+05IU/ml。所述HCV分型陰性對照為滅菌生理鹽水。
[0037]根據本發明，所述試劑盒還包括RNA提取溶液和RNA洗脫液，其中，所述RNA提取溶液包括，
[0038]RNA提取溶液1:包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和100~400 μ g/ml的磁珠；
[0039]RNA提取溶液I1:含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉，且pH6.5±0.2 ;
[0040]RNA提取溶液III:含曲拉通和氯化鈉；
[0041 ] RNA提取溶液IV:含礦物油。
[0042]在本發明的一個實施例中，所述RNA提取溶液I由十二烷基硫酸鈉0.2%~1.0%(質量/體積)、曲拉通1.0%~4.0% (體積/體積)，異硫氰酸胍0.2mol/L~1.0mol/L、100~400 μ g/ml的磁珠組成。
[0043]在本發明的一個實施例中，所述RNA提取溶液II含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L 和氯化鈉 100 ~300mmol/L，且 ρΗ6.5±0.2。
[0044]在本發明的一個實施例中，所述RNA提取溶液III含有曲拉通[濃度為0.1%~1.0%(體積/體積)]和氯化鈉(100~300mmol/L)。
[0045]在本發明的一個實施例中，所述RNA洗脫液由Tris-HCl0.8~1.2mol/L和EDTA0.1 ~1.0mol/L 組成。
[0046]本發明另一方面提供了一種使用如上所述的試劑盒進行C型肝炎病毒基因型檢測的方法，其包括:
[0047]步驟K，將6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液分別與C型肝炎病毒分型酶混合液混合後製成6種PCR混合液；
[0048]步驟L，將6種PCR混合液分別進行離心處理，然後將經過離心處理的6種PCR混合液分別加入6組反應管，分別向每組含有PCR混合液的各反應管中加入待測樣本RNA、C型肝炎病毒分型陰性對照、C型肝炎病毒分型陽性對照，製成PCR反應樣品，蓋好管蓋；
[0049]步驟M，將各反應管置於螢光定量PCR擴增儀上進行螢光PCR反應，檢測並記錄樣品的擴增曲線與閾值線；
[0050]步驟N，根據樣品的擴增曲線與閾值線是否存在交點Ct，以及Ct值進行C型肝炎病毒分型分析；
[0051 ] 其中，在步驟K中，C型肝炎病毒PCR反應液的加入量為43 μ I/人份，C型肝炎病毒分型酶混合液的加入量為2 μ I/人份。
[0052]根據本發明，在步驟L中，PCR混合液的加入量45 μ I，待測樣本RNA、C型肝炎病毒分型陰性對照、C型肝炎病毒分型陽性對照的加入量均為5 μ I。
[0053]在本發明的一個實施例中，將含有PCR反應樣品的反應管放入螢光定量PCR擴增儀的擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度，選擇FAM通道(Reportere:FAM, Quencher:None),然後進行突光PCR反應，反應結束後，儀器自動保存結果，可以利用儀器自帶的軟體進行自動分析(也可以手動調苄基線的開始值、結束值以及閾值線值進行分析)，然後記錄樣本Ct值結果。
[0054]本發明中所述用語「Ct」(即cycle threshold)是指擴增曲線與閾值線的交點，而Ct值是指PCR反應管內的螢光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數值；儀器軟體根據各樣本Ct值大小，可以判斷檢測結果。
[0055]在本發明的一個實施例中，在步驟N中，
[0056]如果各基因型C型肝炎病毒PCR反應液檢測均為無Ct或Ct值> 36，則判斷為HCV1、2、3、4、5 和 6 型陰性；
[0057]如果HCVl型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCVl型陽性或複合感染；
[0058]如果HCV2型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV2型陽性或複合感染；
[0059]如果HCV3型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV3型陽性或複合感染；
[0060]如果HCV4型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV4型陽性或複合感染；
[0061]如果HCV5型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV5型陽性或複合感染；[0062]如果HCV6型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV6型陽性或複合感染。
[0063]根據本發明方法，所述方法還包括提取RNA的操作，其包括，
[0064]步驟A,裂解病毒:將RNA提取溶液I尚心處理後與待測樣品一起在尚心管中震湯混合均勻再進行離心處理製成提取樣品混合液I ;
[0065]步驟B，磁珠吸附核酸並去除雜質:向步驟A中製得的含有提取樣品混合液I的離心管中加入RNA提取溶液II，震蕩混合均勻、靜置10~30分鐘，再將離心管置於磁珠分離器上處理2~5分鐘後緩慢將溶液吸出；
[0066]步驟C，洗滌:向離心管中加入RNA提取溶液III和RNA提取溶液IV震蕩混合均勻、離心處理後置於磁珠分離器上處理2~5分鐘後，上清液分為兩層，將吸頭插入離心管底部，從底部開始緩慢將液體完全吸出丟棄，靜置I~3分鐘後，將管底殘餘液體完全吸出丟棄；
[0067]步驟D，洗脫:向離心管中加入RNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻3~4次，室溫靜置5~30分鐘後將離心管再次置於磁珠分離器上處理2~5分鐘，然後將洗脫下來的待測樣本RNA吸至新的1.5ml滅菌離心管中。
[0068]本發明在對HCV分型所有已知基因型的序列進行比對的基礎上，在HCV分型的最保守區域設計了多對引物和探針，經定量PCR優化，篩選出了擴增效果最好的6對引物和探針，可檢測出全面的HCV基因型，同時不能檢測出非HCV病原體，說明本發明試劑盒具有很好的特異性。同時，對HCV-RNA的提取方法進行了比較和優化，選擇了吸附效果好、易於純化的磁珠法提取RNA，可以獲得高純度和高得率的核酸，大大提高了檢測靈敏度、準確度和穩定性，檢測靈敏度可達1000IU/ml，檢測範圍為1.0E+03~1.0E+08IUs/m。螢光PCR擴增結束後，經儀器自帶軟體自動分析樣本的Ct值，可用於HCV分型的輔助診斷，指導臨床治療方法。
[0069]特異性試驗表明，試劑盒能夠檢測C型肝炎病毒對應的基因型，而對EBV、TP、HBV等樣本均保持良好的陰性結果。各基因型間的交叉反應率< 10%。[0070]RNA不同提取方法對HCV分型檢測的影響試驗表明，目前常用的酚_氯仿法和柱提取法，因有PCR抑制物存在，而導致HCV分型陽性樣本檢測為陰性，即為假陰性，因此應該進行重新檢測或者改進方法進行檢測。本發明的磁珠法提取純化HCV RNA，血漿樣本的HCV分型檢測的結果均有Ct值(即都為陽性)，體系中沒有PCR抑制物的存在；因此，本試劑盒所採用的磁珠法提取核酸，能夠有效去除複雜樣本中的PCR抑制物，適合於血漿等樣本的RNA提取和PCR檢測。
[0071]臨床樣本的檢測試驗表明，本發明的磁珠法提取純化試劑盒的檢測範圍為1.0E+03IU/mL ~1.0E+08IU/mL，檢測下限即靈敏度為 1000IU/mL。
[0072]本發明的C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒用磁珠法提取樣本核酸，採用實時螢光定量PCR技術，以HCV基因組的高度保守區域為擴增靶目標，設計特異性引物及TaqMan探針，在實時螢光PCR儀上通過PCR擴增對HCV基因進行快速、準確分型檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0073]圖1為HCV分型試劑檢測近似病原體擴增曲線圖。
[0074]圖2為HCV分型試劑內源幹擾物質擴增曲線圖。
[0075]圖3為HCV分型試劑外源幹擾物質擴增曲線圖。
[0076]圖4為I型1.0E+08IU/ml~1.0E+03IU/ml梯度樣本檢測結果。
[0077]圖5為2型1.0E+08IU/ml~1.0E+03IU/ml梯度樣本檢測結果。
[0078]圖6為3型1.0E+08IU/ml~1.0E+03IU/ml梯度樣本檢測結果。
[0079]圖7為4型L 0E+08IU/ml~L 0E+03IU/ml梯度樣本檢測結果。
[0080]圖8為5型L 0E+08IU/ml~L 0E+03IU/ml梯度樣本檢測結果。
[0081]圖9為6型1.0E+08IU/ml~1.0E+03IU/ml梯度樣本檢測結果。
[0082]圖10為I型檢測限20次檢測結果。
[0083]圖11為2型檢測限20次檢測結果。
[0084]圖12為3型檢測限20次檢測結果。
[0085]圖13為4型檢測限20次檢測結果。
[0086]圖14為5型檢測限20次檢測結果。
[0087]圖15為6型檢測限20次檢測結果。
【具體實施方式】
[0088]為使本發明更加容易理解，下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例僅起說明性作用，並不局限於本發明的應用範圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0089]實施例
[0090]實施例1:提供一種HCV基因型檢測試劑盒
[0091]一種HCV基因型檢測試劑盒，其至少由以下幾種獨立存在的組分組成:
[0092]HCVl型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10 μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV1-F, HCV1-R,0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV1-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0093]上遊引物HCVl-F:5』-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3』 ；
[0094]下遊引物HCVl-R:5』-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3』 ；
[0095]探針HCVl-P:5，FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13，；
[0096]HCV2型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0 .2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV2-F、HCV2-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV2-P、。所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0097]上遊引物HCV2-F:5』-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3』 ；
[0098]下遊引物HCV2-R:5，-GCCTTTCGCAACCCAACG-3，；
[0099]探針HCV2-P:5，FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13，；
[0100]HCV3型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV3-F、HCV3-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV3-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0101]上遊引物HCV3-F:5』-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3』 ；
[0102]下遊引物HCV3-R:5』-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3』 ；
[0103]探針HCV3-P:5』FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13』 ；
[0104]HCV4型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV4-F、HCV4-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV4-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0105]上遊引物HCV4-F:5』-TTCGCCGACCTCATGGGA-3』 ；
[0106]下遊引物HCV4-R:5，-CCGTCCTCCACAGCCCTGA-3，；
[0107]探針HCV4-P:5』FAM-CCAGGGCTCTGGCGACGCCAC-BHQ13』 ；
[0108]HCV5型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV5-F、HCV5-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV5-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0109]上遊引物HCV5-F:5』-GGTCGCAACCCCGTGGAC-3』 ；
[0110]下遊引物HCV5-R:5』 -CACCCTGCCCACCCGAG-3』 ；
[0111]探針HCV5-P:5』 FAM-ACCCCAGGACCGGCCCGTG-BHQ13』 ；
[0112]HCV6型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV6-F、HCV6-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV6-P。所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0113]上遊引物HCV6-F:5』 -CATGGGGTACATTCCCGTCG-3』 ；
[0114]下遊引物HCV6-R:5』 -TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3』 ；
[0115]探針HCV6-P:5，FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13，；[0116]實施例2:提供一種HCV基因型檢測試劑盒
[0117]一種HCV基因型檢測試劑盒，其除了含有實施例1中獨立存在的各組分外還含有以下幾種獨立存在的組分:
[0118]HCV 分型酶混合液:Tth 酶 5U/ μ I ~15U/ μ I，IU/ μ I ~IOU/ μ I H-Taq DNA 聚合酶；
[0119]HCV分型陽性對照:標定已知濃度的假病毒，其濃度為1.00~5.00E+05IU/ml。
[0120]HCV分型陰性對照:滅菌生理鹽水。
[0121]實施例3:提供一種HCV基因型檢測試劑盒
[0122]一種HCV基因型檢測試劑盒，其至少由以下十幾種獨立存在的組分組成:
[0123]RNA提取溶液1:由十二烷基硫酸鈉0.2%~1.0% (質量/體積)、曲拉通
[0124]1.0% ~4.0%(體積 / 體積)，異硫氛酸狐 0.2mol/L ~1.0mol/L、100 ~400 μ g/ml的磁珠組成；
[0125]RNA提取溶液I1:4_羥乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化鈉100 ~300mmol/L ；
[0126]RNA提取溶液II1:曲拉通0.1%~1.0%(體積/體積)、氯化鈉100~300mmol/L ；
[0127]RNA提取溶液IV:礦物油；
[0128]RNA 洗脫液:Tris-HCl0.8 ~1.2mol/L、EDTA0.1 ~1.0mol/L
[0129]HCVl型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10 μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV1-F, HCV1-R,0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV1-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0130]上遊引物HCVl-F:5』-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3』 ；
[0131]下遊引物HCVl-R:5』-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3』 ；
[0132]探針HCV1-P: 5，FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13，；
[0133]HCV2型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV2-F、HCV2-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV2-P、。所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0134]上遊引物HCV2-F:5』-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3』 ；
[0135]下遊引物HCV2-R:5』-GCCTTTCGCAACCCAACG-3』 ；
[0136]探針HCV2-P:5，FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13，；
[0137]HCV3型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV3-F、HCV3-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV3-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0138]上遊引物HCV3-F:5』-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3』 ；
[0139]下遊引物HCV3-R:5』-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3』 ；
[0140]探針HCV3-P:5，FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13，；
[0141]HCV4型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV4-F、HCV4-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV4-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0142]上遊引物HCV4-F:5』-TTCGCCGACCTCATGGGA-3』 ；
[0143]下遊引物HCV4-R:5』-CCGTCCTCCACAGCCCTGA-3』 ；
[0144]探針HCV4-P:5，FAM-CCAGGGCTCTGGCGACGCCAC-BHQ13，；
[0145]HCV5型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV5-F、HCV5-R, 0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV5-P，所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為: [0146]上遊引物HCV5-F:5』-GGTCGCAACCCCGTGGAC-3』 ；
[0147]下遊引物HCV5-R:5』-CACCCTGCCCACCCGAG-3』 ；
[0148]探針HCV5-P:5，FAM-ACCCCAGGACCGGCCCGTG-BHQ13，；
[0149]HCV6型PCR反應液:5XPCR反應緩衝液10μ I (Tth聚合酶附帶的)，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物HCV6-F、HCV6-R，0.2 μ mol/L~0.4 μ mol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針HCV6-P。所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針，其鹼基對序列分別為:
[0150]上遊引物HCV6-F:5』-CATGGGGTACATTCCCGTCG-3』 ；
[0151]下遊引物HCV6-R:5』-TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3』 ；
[0152]探針HCV6-P:5，FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13，；
[0153]HCV 分型酶混合液:Tth 酶 5U/ μ I ~15U/ μ I，IU/ μ I ~10U/ μ I H-Taq DNA 聚合酶；
[0154]HCV分型陽性對照:標定已知濃度的假病毒，其濃度為1.00~5.00E+05IU/ml。
[0155]HCV分型陰性對照:滅菌生理鹽水。
[0156]實施例4:使用實施例3的試劑盒提取血漿等未知樣本中RNA
[0157]I試劑準備
[0158]I)按量(RNA提取溶液Ι200μ I~Iml/人份)取相應量的RNA提取溶液I，瞬時離
心後備用。
[0159]2RNA提取操作
[0160]I)裂解病毒:每管加入200μ I~Iml RNA提取溶液l_mix，然後加入100 μ I~Iml待測樣本(血漿等待測樣本),蓋上管蓋,震蕩混勻10秒鐘,瞬時離心(HCV分型陰性對照以及陽性對照參照相同步驟提取)；
[0161]2)磁珠吸附核酸:每管加入50 μ I~400 μ I RNA提取溶液2，震蕩混勻10秒鐘後，室溫靜置10~30分鐘；
[0162]3)去除雜質:瞬時離心後，將離心管置於磁珠分離器上，2~5分鐘後緩慢將溶液吸出；
[0163]4)洗滌:每管加入400μ I~Iml RNA提取溶液3和100 μ I~500 μ I RNA提取溶液4，震蕩混勻3~7秒鐘，瞬時離心後將離心管再次置於分離器上；
[0164]5) 2~5分鐘後，上清液分為兩層，將吸頭插入離心管底部，從底部開始緩慢將液體完全吸出丟棄，靜置I~3分鐘後，將管底殘餘液體完全吸出丟棄。
[0165]6)加入10 μ I~IOOul RNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻3~4次，室溫靜置5~30分鐘後將離心管再次置於分離器上2~5分鐘，然後將洗脫下來的RNA吸至新的1.5ml滅菌離心管中。
[0166]實施例5:使用實施例3的試劑盒檢測血漿等未知樣本中C型肝炎病毒基因型
[0167]I試劑準備
[0168]根據待測樣本、陰性對照、陽性對照的數量，按比例(PCR反應液43 μ I/人份+酶混合液2 μ I/人份)取相應量的HCV分型PCR反應液及C型肝炎病毒分型酶混合液充分混勻製成6種PCR混合液，瞬時離心後備用。
[0169]2.PCR反應及HCV分型分析
[0170](I)根據待測樣本、陰性對照、陽性對照的數量，分別將經過離心處理的PCR混合液加入6組反應管，每個反應管加入45 μ IPCR混合液，吸取已處理的待測樣本RNA、陰性對照、陽性對照按每個反應液點樣5 μ I加入3隻含有PCR混合液的反應管中，製成PCR反應
樣品，蓋好管蓋。
[0171](2)將含有PCR反應樣品的反應管放入螢光定量PCR擴增儀的擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度，選擇FAM通道(Reportere: FAM, Quencher: None )，然後進行螢光PCR反應，並檢測樣品Ct值，螢光定量PCR反應條件見表1。
[0172]表1
【權利要求】
1.一種C型肝炎病毒基因型檢測試劑盒，其包括6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液，所述6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液中均含有用於靶多核苷酸檢測的探針和用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物，且所述引物和探針的序列為， HCVl型PCR反應液:
上遊引物 HCVl-F:5』 -AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3』 ；
下遊引物 HCVl-R:5』 -TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3』 ；
探針 HCVl-P:5』 FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13』 ； HCV2型PCR反應液:
上遊引物 HCV2-F:5』 -CGGAATTGCCGGGAAGACT-3』 ；
下遊引物 HCV2-R:5』 -GCCTTTCGCAACCCAACG-3』 ；
探針 HCV2-P:5』 FAM-ATAAACCCACTCTATGCCCGGTCATTTGG-BHQ13』 ； HCV3型PCR反應液:
上遊引物 HCV3-F:5』 -GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3』 ；
下遊引物 HCV3-R:5』 -GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3』 ；
探針 HCV3-P:5』 FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13』 ； HCV4型PCR反應液:
上遊引物 HCV4-F:5』 -TTCGCCGACCTCATGGGA-3』 ；
下遊引物 HCV4-R:5』 -CCGTCCTCCACAGCCCTGA-3』 ；
探針 HCV4-P:5』 FAM-CCAGGGCTCTGGCGACGCCAC-BHQ13』 ； HCV5型PCR反應液:
上遊引物 HCV5-F:5』 -GGTCGCAACCCCGTGGAC-3』 ；
下遊引物 HCV5-R:5』 -CACCCTGCCCACCCGAG-3』 ；
探針 HCV5-P:5』 FAM-ACCCCAGGACCGGCCCGTG-BHQ13』 ； HCV6型PCR反應液:
上遊引物 HCV6-F:5』 -CATGGGGTACATTCCCGTCG-3』 ；
下遊引物 HCV6-R:5』 -TTGATCCCGTCCTCGATTGC-3』 ；
探針 HCV6-P:5』 FAM-ACACCATGTGCGAGCGCAGCCG-BHQ13』。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液中均含有PCR反應緩衝液、脫氧核糖核苷三磷酸。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，每種所述基因型的C型肝炎病毒PCR反應液中含有5 X PCR反應緩衝液IOy 1，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ mol/L~0.4ymol/L的用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物，0.2 μ mol/L~0.4ymol/L的用於靶多核苷酸檢測的探針。
4.根據權利要求1到3中任意一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括C型肝炎病毒分型酶混合液、C型肝炎病毒分型陰性對照和C型肝炎病毒分型陽性對照，其中，所述C型肝炎病毒分型酶混合液包括Tth酶、H-Taq DNA聚合酶。
5.根據權利要求1到4中任意一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括RNA提取溶液和RNA洗脫液，其中，所述RNA提取溶液包括， RNA提取溶液1:包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和100~400 μ g/ml的磁珠; RNA提取溶液I1:含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉，且pH6.5 ±0.2 ; RNA提取溶液II1:含曲拉通和氯化鈉； RNA提取溶液IV:含礦物油。
6.一種使用如權利要求1~5中任意一項所述的試劑盒進行C型肝炎病毒基因型檢測的方法，其包括: 步驟K，將6種基因型的C型肝炎病毒PCR反應液分別與C型肝炎病毒分型酶混合液混合後製成6種PCR混合液； 步驟L，將6種PCR混合液分別進行離心處理，然後將經過離心處理的6種PCR混合液分別加入6組反應管，分別向每組含有PCR混合液的各反應管中加入待測樣本RNA、C型肝炎病毒分型陰性對照、C型肝炎病毒分型陽性對照，製成PCR反應樣品，蓋好管蓋； 步驟M，將各反應管置於螢光定量PCR擴增儀上進行螢光PCR反應，檢測並記錄樣品的擴增曲線與閾值線； 步驟N，根據樣品的擴增曲線與閾值線是否存在交點Ct，以及Ct值進行C型肝炎病毒分型分析； 其中，在步驟K中， C型肝炎病毒PCR反應液的加入量為43 μ I/人份，C型肝炎病毒分型酶混合液的加入量為2 μ I/人份。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，在步驟L中，PCR混合液的加入量45μ 1，待測樣本RNA、C型肝炎病毒分型陰性對照、C型肝炎病毒分型陽性對照的加入量均為5 μ I ο
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，在步驟N中， 如果各基因型C型肝炎病毒PCR反應液檢測均為無Ct或Ct值> 36，則判斷為HCV1、2、3、4、5和6型陰性； 如果HCVl型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCVl型陽性或複合感染； 如果HCV2型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV2型陽性或複合感染； 如果HCV3型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV3型陽性或複合感染； 如果HCV4型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV4型陽性或複合感染； 如果HCV5型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV5型陽性或複合感染； 如果HCV6型反應液檢測Ct值< 36，則判斷為HCV6型陽性或複合感染。
9.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括提取RNA的操作，其包括， 步驟Α，裂解病毒:將RNA提取溶液I離心處理後與待測樣品一起在離心管中震蕩混合均勻再進行離心處理製成提取樣品混合液I ; 步驟B，磁珠吸附核酸並去除雜質:向步驟A中製得的含有提取樣品混合液I的離心管中加入RNA提取溶液II，震蕩混合均勻、靜置10~30分鐘，再將離心管置於磁珠分離器上處理2~5分鐘後緩慢將溶液吸出； 步驟C，洗滌:向離心管中加入RNA提取溶液III和RNA提取溶液IV震蕩混合均勻、離心處理後置於磁珠分離器上處理2~5分鐘後，上清液分為兩層，將吸頭插入離心管底部，從底部開始緩慢將液體完全吸出丟棄，靜置I~3分鐘後，將管底殘餘液體完全吸出丟棄；步驟D，洗脫:向離心管中加入RNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻3~4次， 室溫靜置5~30分鐘後將離心管再次置於磁珠分離器上處理2~5分鐘，然後將洗脫下來的待測樣本RNA吸至新的1.5ml滅菌離心管中。
【文檔編號】C12R1/93GK103725797SQ201310750988
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】戴立忠, 黃河, 劉佳 申請人:湖南聖湘生物科技有限公司