一種抗癌轉移的基因工程藥物及其製備方法
2023-06-11 16:16:06
專利名稱：一種抗癌轉移的基因工程藥物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及抗癌新藥的研製，屬基因工程製藥；具體是指Nm23-H1/NDPK-A(以下簡稱NDPK)重組蛋白為單一活性成份的抗癌轉移的基因工程藥物及其製備方法。
NDPK是國際公認的抑癌轉移基因。美國著名《科學》周刊(Science.Vol278.7 November 1997.WWW.Sciencemag.org)在97年底的專刊中，特別介紹了這類研究和這類新藥的研究進展。
Kim，J等人在Cell 94353～362，1998公開了動物內滲模型。與此同時Nature雜誌394527～528，1998，指出了癌轉移的第一步是內滲並建立了動物模型。
NDPK(核苷二磷酸激酶)是本世紀五十年代初就已在人體和各生物體內就測定了的一種蛋白激酶。當時只知道(推測)這種酶與核苷二磷酸和核苷三磷酸之間的反應有關。以後的研究隨著NDPK蛋白純化的進展，確定NDPK是NDP和NTP反應時必具的催化劑。有了這種催化劑，人體內的高能磷酸化過程才得以實現。
綜上所述與本發明相當的研究均屬理論探討，特別是針對發現NDPK在人體各組份的分布與腫瘤轉移的組化檢測研究。迄今為止，還沒有任何報導提出將NDPK研製成抗癌轉移新藥的企圖，更沒有諸如NDPK影響內外滲、穩定毛細血管細胞和NDPK基因工程製藥技術方法的記載。人得了腫瘤，只要不機械壓迫和佔據重要的生命位置，一般都不會致人於死命，致人死命的是腫瘤轉移。如果一個腫瘤患者發生轉移，一般來說，死亡也就為期不遠了。因此，努力尋找抗腫瘤轉移新藥或試劑，是近幾年國際抗癌的熱點。
本發明的目的在於研究癌細胞從血管內向血管外轉移的外滲方面和從血管外向血管內轉移的內滲方面建立動物模型，並用實驗方法證明NDPK能夠抑制和逆轉癌細胞的外滲和內滲等機理，提供NDPK作為一種抗癌轉移的基因工程藥物及其製備方法，從而開發出一種能阻止腫瘤病人死亡，延長病人生命的抗癌轉移藥物。
發明人首次提出NDPK抑制癌轉移的內、外滲動物模型，並用實驗方法證實NDPK能夠抑制和逆轉癌細胞的內、外滲，通過電鏡方法，看到了沒有用NDPK保護的毛細血管內皮細胞間質細胞和外皮細胞被癌細胞及其釋放的物質(蛋白酶等)破壞，形成很多空泡；而受NDPK重組蛋白預先保護的毛細血管內皮細胞間質細胞和外皮細胞不被癌細胞攻擊，不出現內皮細胞間質細胞和外皮細胞空泡。從而從動物實驗證明NDPK具有保護血管免受癌細胞破壞，具有阻止癌細胞內、外滲的能力。為NDPK在治療癌轉移的藥物上的應用奠定了基礎。
NDPK蛋白是通過寡聚核苷酸將其基因合成好以後，或從CDNA庫上用PCR方法調出以後，將這種基因重組進一個高表達質粒，並且基因的3′末端終止密碼後加了稀罕胺基酸鹼基，這種重組表達質粒轉化進E.coli後，便可高表達NDPK重組蛋白。
一種抗癌轉移的基因工程藥物，該藥物具有下述理化性質核苷酸長度為456個核苷，序列為5』-ATG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC ATT GCG ATC AAA CCA GATGGG GTC CAG CGG GGT CTT GTG GGA GAG ATT ATC AAG CGT TTTGAG CAG AAA GGA TTC CGC CTT GTT GGT CTG AAA TTC ATG CAAGCT TCC GAA GAT CTT CTC AAG GAA CAC TAC GTT GAC CTG AAGGAC CGT CCA TTC TTT GCC GGC CTG GTG AAA TAC ATG CAC TCAGGG CCG GTA GTT GCC ATG GTC TGG GAG GGG CTG AAT GTG GTGAAG ACG GGC CGA GTC ATG CTC GGG GAG ACC AAC CCT GCA GACTCC AAG CCT GGG ACC ATC CGT GGA GAC TTC TGC ATA CAA GTTGGC AGG AAC ATT ATA CAT GGC AGT GAT TCT GTG GAG AGT GCAGAG AAG GAG ATC GGC TTG TGG TTT CAC CCT AAG GAA CTG GTAGAT TAC ACG AGC TGT GCT CAG AAC TGG ATC TAT GAA TGA -3』胺基酸序列為152個胺基酸，其中第44、120、122和/或125位絲氨酸和118位組氨酸都參與轉磷作用；分子量17～18千道爾頓(KD)；幾何結構由4條反向平行的β-片層、表面被5個α螺旋結構部分覆蓋，活性中心保守性很強，分子表面有一個「Y」字形溝隙，Y字兩臂為NDP結合區，其中一臂包含了具轉磷作用的第118位組氨酸。
一種抗癌轉移的基因工程藥物的製備方法，該法包括以下步驟及其工藝條件步驟一基因克隆，構建高表達質粒(1)在mRNA水平選定NDPK基因插入的最佳位置，通過計算機模擬，確定NDPK基因插入的最佳位置為距離SD6個鹼基；(2)在表達質粒上選定了SD與NDPK的ATG的距離也是以6個鹼基為最佳位置；(3)按上述要求將NDPK構進表達質粒pBV220質粒；(4)構建高表達細菌——重組體DH5α菌，質粒和細菌選好以後，將CDNA庫或已合成的NDPK基因和質粒都用EcoR1和BamH1內切酶消化，放在一起用T4連接酶連接，所獲得的重組質粒轉化進DH5α細菌，便可獲得高表達NDPK重組蛋白的重組體；步驟二重組菌發酵重組菌在25～35℃下活化，在25～35℃下培養1～4小時，然後在35～45℃下誘導2～12小時，獲高產NDPK；步驟三NDPK的分離純化(1)應用超聲波破碎法進行菌體破碎破碎時間及超聲波選擇的功率比較和優化選擇後確定功率為120w～180W，時間為10～30分鐘，溫度零下0～8℃；(2)破碎液在0～8℃下10000～25000rpm離心10～30分鐘，獲上清和沉澱上清進入色譜分離純化程序；(3)DEZE纖維素DE52離子交換層析粗分離上清首先經過弱陰離子交換柱層析，柱型4×5(cm..i.d)——實驗中試6～8cin.i.d；流速2ml/min～4ml/min，平衡緩衝液20mM Tris-Hcl pH7.5，1mM EDTA pH7.5，2mM MgCL2pH7.5，1mMDTT pH7.5，柱平衡後上樣50～80ml上清，再以0.1M、0.2M和0.3M上述平衡緩衝液進行階段性洗脫；應用15％SDS-PAGE分析各分離組份，達到粗純；(4)Cibacron Blue親和層析精分離柱型1×8(cm.i.d)；流速上清及洗脫0.4ml/min，洗脫蛋白1ml/min；平衡液同上加0.2M Nacl，洗脫液上液加0.2M Nacl和1mM ATP，過程柱平衡後，上樣40ml，用平衡液BuffA+0.2M Nacl洗滌雜蛋白至吸收值為零，用洗脫液BuffA+0.2M Nacl+1mM ATP洗下目標蛋白，收集兩個柱床體積洗脫液即可獲得目標蛋白(5)最終產品純化高壓液相色譜進一步純化預裝柱Shim-Pack DIOL-300；柱型7.9×300mm；流速1ml/min流動相0.1M Nacl+0.02M PBS+10mM EDTApH7.0。
經過上述色譜組合柱純化，獲得大量分子量為17～18的單體蛋白即為NDPK重組蛋白。
如上述步驟所得的NDPK重組蛋白生物活性，即酶活性分析如下(1)反應方程式UTP+ADP＝UDP+ATP(2)酶促反應體 積0.3ml時 間5min緩衝體系Na-Hepes 33mM pH7.4Mgcl25mM底 物UTP 1mMADP 1mM監測反相高效液相色譜柱C18反相柱流速1ml/min；流動相A液，B液，等度0～10minA液68％，B液32％，檢測波長254mm最後獲得生物活性(酶活力)為800單位/mg蛋白。
如上述所得的NDPK重組蛋白抗癌轉移藥物具有下述理化及生物性質1、具有廣泛的生理意義促進分化和發育，參與信號傳導，參與能量代謝；2、參與微管聚合，穩定細胞內骨架；3、參與基因調控和分化抑制功能；4、抑制癌症轉移和固體癌的大小；5、其蛋白單體分子量17KD，為含有456個鹼基(核苷酸序列)和152個胺基酸(蛋白序列)。等電點pH5.4～8.3(因為NDPK在人體內以六聚體形式存在)。
最重要的生物學活性
1、能夠催化NDP與NTP之間高能磷酸鍵的轉化；2、能夠穩定細胞內微管和骨架的結構；3、能夠穩定和保護腫瘤細胞誘生的動物毛細血管的內皮細胞、間質細胞和外皮細胞免受癌細胞的內滲侵入和外滲浸出，從而阻止癌症的轉移；4、能夠保護荷瘤裸鼠腫瘤生長、癌細胞轉移。
本發明有如下突出的優點與效果1、本發明首次提出了NDPK對毛細血管內皮細胞、間質細胞和外皮細胞的保護作用在抗癌轉移藥物中的應用。應用到實驗動物模型證明(1)沒有用過基因工程重組蛋白NDPK的腫瘤細胞誘導的動物模型，其毛細血管內皮細胞胞漿出現大的空泡、細胞核和胞漿變形。間質細胞也出現空泡，外皮細胞亦見空泡。
(2)用過基因工程重組蛋白NDPK的腫瘤細胞誘導的動物模型，其毛細血管內皮細胞結構完整，無空泡，內皮細胞有正常的微絨毛結構，胞核橢圓型。間質和外皮細胞亦正常。
(3)應用轉基因方法，將NDPK基因轉入荷瘤裸鼠或應用基因工程重組NDPK蛋白注射荷瘤裸鼠，都能縮小荷瘤小鼠腫瘤的大小，能夠阻止癌細胞轉移。
2、本發明提供了的能阻止腫瘤病人死亡，延長病人生命的抗癌轉移藥物，並已完成實驗階段和部分臨床前的試驗，以下是部分試驗結果完成了基因克隆、基因重組、表達調控、發酵工藝和NDPK重組蛋白的純化工藝，獲得了高表達高純度的NDPK單體。完成了NDPK的理化性質、生物學活性、核酸和蛋白的序列檢測，NDPK基因和NDPK重組蛋白的抗癌轉移3個動物模型，並在此模型上證明NDPK(基因和蛋白)具有阻止腫瘤細胞轉移的多個動物實驗結果。完成了在分子、細胞和動物水平的抗癌轉移的藥理學、藥效學和長期毒性，短期毒性等動物實驗。完成了藥物穩定性、安全性實驗，在國家新藥評審辦規定的實驗室階段的實驗全部完成了。完成了國家新藥評審辦規定的20項臨床前試驗的大部分。正在繼續完成餘下的小部分的工作。整個實驗室結果和臨床前期的實驗結果令人滿意，整個研究正在順利進行中。
3、本發明提供了一種包括載體重組技術和單體蛋白純分技術在內的抗癌轉移藥物製備方法，製備方法相對簡單，NDPK蛋白得率很高，純度高，易工業化。
經過計算機模擬優化高表達質粒構建和轉化用大腸桿菌DH5α菌株後，NDPK蛋白佔菌體總蛋白的42％。每升菌液可得純度為96％以上的NDPK重組蛋白，該蛋白活性為800U/mg蛋白，這是目前為止國內外最佳重組NDPK蛋白的生產質粒。
下面結合實施例對本發明作進一步詳述一種抗癌轉移的基因工程藥物的製備方法，包括以下步驟及其工藝條件步驟一基因克隆，構建高表達質粒(1)在mRNA水平選定NDPK基因插入的最佳位置，通過計算機模擬，確定NDPK基因插入的最佳位置為距離SD6個鹼基；(2)在表達質粒上選定了SD與NDPK的ATG的距離也是以6個鹼基為最佳位置；(3)按上述要求將NDPK構進表達質粒pBV220質粒；(4)轉化和構建高表達細菌——重組體DH5α菌，質粒和細菌選好以後，將CDNA庫或已合成的NDPK基因都用EcoR1和BamH1內切酶消化，放在一起用T4連接酶連接，所獲得的重組質粒轉化進DH5α細菌，便可獲得高表達NDPK重組蛋白的重組體；步驟二重組菌發酵30℃下活化過夜，次日30℃下培養2.5小時，然後40℃誘導4小時；步驟三NDPK的分離純化(1)應用超聲波破碎法進行菌體破碎；破碎時間及超聲波選擇的功率比較和優化選擇後確定功率為150w，時間為20分鐘，溫度零下4℃；(2)破碎液在4℃下20000rpm離心15分鐘，獲上清和沉澱上清進入色譜分離純化程序；(3)上清首先經過DE-SL弱陰離子交換柱層析，柱型4×5(cm..i.d)——實驗；中試8cin.i.d；流速4ml/min，平衡緩衝液20mMTris-Hcl，1mMEDTA，2mM MgCL2，1mMDTT，pH7.5，柱平衡後上樣80ml上清，再以0.1M、0.2M和0.3M上述平衡緩衝液進行階段性洗脫；應用15％SDS-PAGE分析各分離組份，達到粗純，可去除70％以上的雜蛋白；(4)Cibacron Blue 3GA和色譜柱精分離柱型1×8(cm.i.d)；流速上清及洗脫0.4ml/min，洗脫蛋白1ml/min；平衡液同上加0.2M Nacl，洗脫液上液加0.2M Nacl和1mM ATP，過程柱平衡後，上樣40ml，用平衡液BuffA+0.2M Nacl洗滌雜蛋白至吸收值為零，用洗脫液BuffA+0.2M Nacl+1mM ATP洗下目標蛋白，收集兩個柱床體積洗脫液即可獲得目標蛋白；(5)最終產品純化排阻-HPLC(高壓液相色譜)進一步純化儀器Waters 600 HPLC預裝柱用島津公司的Shim-Pack DIOL-300HPLC；柱型7.9×300mm；流速1ml/min；流動相0.1M Nacl+0.02M PBS+10mM EOTApH7.0。
經過上述色譜組合柱純化，獲得純度為98％，酶活性為800V/mg，152個胺基酸，分子量為17.5KD的單體蛋白即為NDPK重組蛋白。
權利要求
1.一種抗癌轉移的基因工程藥物，其特徵在於該藥物具有下述理化性質核苷酸長度為456個核苷，序列為5』-ATG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC ATT GCG ATC AAA CCA GATGGG GTC CAG CGG GGT CTT GTG GGA GAG ATT ATC AAG CGT TTTGAG CAG AAA GGA TTC CGC CTT GTT GGT CTG AAA TTC ATG CAAGCT TCC GAA GAT CTT CTC AAG GAA CAC TAC GTT GAC CTG AAGGAC CGT CCA TTC TTT GCC GGC CTG GTG AAA TAC ATG CAC TCAGGG CCG GTA GTT GCC ATG GTC TGG GAG GGG CTG AAT GTG GTGAAG ACG GGC CGA GTC ATG CTC GGG GAG ACC AAC CCT GCA GACTCC AAG CCT GGG ACC ATC CGT GGA GAC TTC TGC ATA CAA GTTGGC AGG AAC ATT ATA CAT GGC AGT GAT TCT GTG GAG AGT GCAGAG AAG GAG ATC GGC TTG TGG TTT CAC CCT AAG GAA CTG GTAGAT TAC ACG AGC TGT GCT CAG AAC TGG ATC TAT GAA TGA -3』胺基酸序列為152個胺基酸，其中第44、120、122和/或125位絲氨酸和118位組氨酸都參與轉磷作用；分子量17～18千道爾頓(KD)幾何結構由4條反向平行的β-片層、表面被5個α螺旋結構部分覆蓋，活性中心保守性很強，分子表面有一個「Y」字形溝隙，Y字兩臂為NDP結合區，其中一臂包含了具轉磷作用的第118位組氨酸。
2.一種抗癌轉移的基因工程藥物的製備方法，其特徵在於該法包括以下步驟及其工藝條件步驟一基因克隆，構建高表達質粒(1)在mRNA水平選定NDPK基因插入的最佳位置，通過計算機模擬，確定NDPK基因插入的最佳位置為距離SD6個鹼基；(2)在表達質粒上選定了SD與NDPK的ATG的距離也是以6個鹼基為最佳位置；(3)按上述要求將NDPK構進表達質粒pBV220質粒；(4)構造高表達細菌——重組體DH5α菌，質粒和細菌選好以後，將CDNA庫或已合成的NDPK基因和質粒都用EcoR1和BamH1內切酶消化，放在一起用T4連接酶連接，所獲得的重組質粒轉化進DH5α細菌，便可獲得高表達NDPK重組蛋白的重組體；步驟二重組菌發酵重組菌在25～35℃下活化，在25～35℃下培養1～4小時，然後在35～45℃下誘導2～12小時，獲高產NDPK；步驟三NDPK的分離純化(2)應用超聲波破碎法進行菌體破碎破碎時間及超聲波選擇的功率比較和優化選擇後確定功率為120w～180W，時間為10～30分鐘，溫度零下0～8℃；(2)破碎液在0～8℃下10000～25000rpm離心10～30分鐘，獲上清和沉澱上清進入色譜分離純化程序；(3)DEZE纖維素DE52離子交換層析粗分離上清首先經過弱陰離子交換柱層析，柱型4×5(cm..i.d)——實驗；中試6～8cin.i.d；流速2ml/min～4ml/min，平衡緩衝液20mM Tris-Hcl pH7.5，1mM EDTA pH7.5，2mM MgCL2pH7.5，1mMDTT pH7.5，柱平衡後上樣50～80ml上清，再以0.1M、0.2M和0.3M上述平衡緩衝液進行階段性洗脫；應用15％SDS-PAGE分析各分離組份，達到粗純；(4)Cibacron Blue親和層析精分離柱型1×8(cm.i.d)流速上清及洗脫0.4ml/min，洗脫蛋白1ml/min；平衡液同上加0.2M Nacl，洗脫液上液加0.2M Nacl和1mM ATP，過程柱平衡後，上樣40ml，用平衡液BuffA+0.2M Nacl洗滌雜蛋白至吸收值為零，用洗脫液BuffA+0.2M Nacl+1mM ATP洗下目標蛋白，收集兩個柱床體積洗脫液即可獲得目標蛋白；(5)最終產品純化高壓液相色譜進一步純化預裝柱Shim-Pack DIOL-300；柱型7.9×300mm；流速1ml/min；流動相0.1M Nacl+0.02M PBS+10mM EDTApH7.0，經過上述色譜組合柱純化，獲得大量純度為98％，酶活性為800V/mg，152個胺基酸，分子量為17～18KD的單體蛋白即為NDPK重組蛋白。
全文摘要
本發明涉及抗癌新藥的研製,經建立癌細胞從血管內向血管外轉移的外滲和從血管外向血管內轉移的內滲的動物模型,並用實驗證明NDPK能夠抑制和逆轉癌細胞的外滲和內滲等機理,提供一種抗癌轉移的基因工程藥物及其製備方法。本發明歷經基因克隆,構建高表達質粒,重組菌發酵和NDPK的分離純化,獲得純度為97%以上,酶活性為800V/mg,分子量為17～18KD的單體蛋白即為NDPK重組蛋白。NDPK重組蛋白能阻止腫瘤病人死亡,延長病人生命的抗癌轉移藥物。
文檔編號C12P21/00GK1243750SQ9911700
公開日2000年2月9日 申請日期1999年7月23日 優先權日1999年7月23日
發明者趙利淦, 張美英 申請人:暨南大學