一種調控真核生物基因轉錄的dna序列及其結合蛋白的製作方法

2023-06-12 01:45:46 2

專利名稱：一種調控真核生物基因轉錄的dna序列及其結合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種調控真核生物基因轉錄的DNA序列及其結合蛋白。
背景技術：
惡性瘧原蟲紅細胞膜表面蛋白(PfEMPl)是var基因家族的編碼產物，為惡性瘧原蟲最重要的毒力因子之一，介導被感染紅細胞與宿主細胞受體黏附和免疫逃避等過程。var基因家族具有相互排斥性表達的特點，在約60個var基因中，一般只有其中一個基因獲得表達。痕原蟲在紅細胞內的生活史循環中，該唯一表達的成員不斷發生轉換(Switching),導致高度的抗原變異。研究表明，該過程是在轉錄水平上進行調控所有var基因都位於細胞核周，沉默的基因位於異染色質區；活化的基因則位於常染色質。因此，var基因位點在細胞核周區域的定位是該過程的關鍵調控途徑。但是，介導這一核周定位(Anchoring)的相關因子尚未有報導。所有var基因具有類似的結構兩個外顯子和一個內含子。其中，內含子序列高度保守。已有研究證實var基因的轉錄沉默與其內含子有關，內含子的缺失可導致相應var基因的轉錄激活。因此，內含子是var基因家族的重要調控序列，但是相應的作用因子(核蛋白)及其分子機制尚不清楚。鑑定參與var基因轉錄調控的內含子關鍵序列以及相關的結合蛋白，並研究它們的調控途徑，不僅有助於闡明var基因家族的表達調控機制，而且為惡性瘧原蟲的防治提供潛在的藥物靶點，具有重要的科學和應用意義。

發明內容
本發明的目的在於獲得var基因內含子區域中關鍵核蛋白結合位點(iNBE)的DNA序列(寡核苷酸序列)、與該特徵序列結合的核蛋白，以及iNBE/核蛋白複合物在var基因轉錄調控中所起的作用機制。本發明的目的還在於提供調控var基因轉錄的蛋白及調控方法，所述的蛋白是肌動蛋白。本發明的目的還在於提供篩選降低瘧原蟲毒力的潛在物質的方法。在本發明的第一方面，提供一種寡核苷酸，所述的寡核苷酸選自⑴如下所示序列的寡核苷酸5』 AAAAA (TA) JCATAAAATAAAAA 3』 ；其中η =2-20(優選的，n = 3-9 ;如 3，4，5，6 或 7);或(ii)與(i)的寡核苷酸同源的變異體，具有與(i)的寡核苷酸相同的與蛋白質結合的能力。在一個優選例中，所述的寡核苷酸分離自惡性痕原蟲(Plasmodiumfalciparum)var基因家族的內含子序列。 在另一優選例中，所述的寡核苷酸是分離的或人工合成的。在另一優選例中，所述的寡核苷酸是核蛋白的結合位點。
在另一優選例中，所述的蛋白質是肌動蛋白；較佳地是I類肌動蛋白(ActinI)。在本發明的另一方面，提供所述的寡核苷酸的用途，用於特異性地與肌動蛋白相互作用。在另一優選例中，所述的肌動蛋白是I類肌動蛋白(Actin I)。在本發明的另一方面，提供肌動蛋白的用途，用於與var基因內含子相互作用(結合)，調控var基因的轉錄和表達。
在另一優選例中，所述的肌動蛋白選自(a)胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示的蛋白；(b)將SEQ ID NO 2胺基酸序列經過一個或多個(如1_20個；更佳地1_10個；更佳地1-5個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。在另一優選例中，所述的肌動蛋白由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列編碼而成。在本發明的另一方面，提供一種複合物，包括所述的寡核苷酸以及肌動蛋白。在另一優選例中，所述的複合物是分離的。在另一優選例中，所述的複合物中，所述的寡核苷酸以及肌動蛋白相互作用(結合)。在本發明的另一方面，提供所述的複合物的用途，用於篩選抑制var基因轉錄水平、從而降低瘧原蟲毒力的物質。在本發明的另一方面，提供一種篩選降低瘧原蟲毒力的潛在物質的方法，所述方法包括用候選物質與所述的複合物接觸，觀察該複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況，若兩者的相互作用增強，則表明其是對於降低瘧原蟲毒力有用的潛在物質。在另一優選例中，所述方法包括(a)在測試組中，向包含權利要求4或5所述的複合物的體系中添加待篩選的候選物，並檢測複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況；並且，在對照組中，在不添加所述候選物的、包含權利要求4或5所述的複合物的體系中，檢測複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用與對照組複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用進行比較，如果測試組複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用在統計學上強於(優選顯著強於，較佳的強20%或更強；更佳的強40%或更強；進一步更佳的強60%或更強)對照組，就表明該候選物是對於降低瘧原蟲毒力有用的潛在物質。在另一優選例中，通過免疫共沉澱法鑑定複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況。在另一優選例中，所述的肌動蛋白是游離的肌動蛋白(G-actin)。在本發明的另一方面，提供一種調控細胞內var基因的轉錄的方法，所述方法包括採用調節肌動蛋白聚合或解聚合的試劑處理細胞。在另一優選例中，所述的細胞是瘧原蟲的細胞。在另一優選例中，採用調節肌動蛋白解聚合的試劑處理細胞，調控細胞內var基因轉錄沉默，從而降低瘧原蟲的毒力；或
採用調節肌動蛋白聚合的試劑處理細胞，調控細胞內Var基因轉錄激活。在另一優選例中，所述的調節肌動蛋白解聚合的試劑是Cytochalasin D(⑶)。在另一優選例中，所述的調節肌動蛋白聚合的試劑是Jasplakinolide(JAS)。 本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖I、惡性瘧原蟲var基因內含子的EMSA探針設計。自惡性瘧原蟲3D7株系基因組中擴增獲得染色體中間位置var基因(PFDlOOOc)的全長內含子，並通過PCR分割成一系列片段重疊的短探針(5，端生物素標記)進行多輪的EMSA試驗，最終的探針Cl. 2. 2即為iNBE序列ο圖2、用EMSA試驗鑑定var基因內含子核心結合序列(iNBE)。圖示左側為第一輪EMSA試驗中，4條探針分別與惡性瘧原蟲3D7株核蛋白提取物的結果，其中int-a/b/c/d分別代表4條探針；N.E.代表惡性瘧原蟲核蛋白抽提物；C1、C2為初步鑑定到的不同的探針/核蛋白複合帶。圖示右側以Cl. 2. 2 (iNBE)探針檢測到特異性探針/核蛋白複合帶，提示內含子核心結合序列所在位點。圖3、競爭性EMSA驗證iNBE結合複合物的特異性。惡性瘧原蟲核蛋白抽提物與競爭性DNA (無生物素標記DNA)相互作用的EMSA結果，以cl. 2. 2作為全部EMSA反應的特異探針；N. E.:核提取物，ssDNA :鮭魚精DNA，酵母tRNA。圖4、iNBE序列在3D7株基因組中的分布。圖上部橫坐標代表不同5』 UTR類型的var基因，縱坐標為3D7株不同Var基因內含子中的iNBE核心結合序列的拷貝數，圖中每一個黑點代表一個內含子，共59個內含子。圖5、免疫印跡分析Pfactin-I抗體的特異性。圖示不同蟲期階段的惡性瘧原蟲抽提物分別與抗Pfactin-I抗體(鼠抗)進行免疫印記試驗的結果，R、T、S分別代表3D7蟲株的環狀體、滋養體和裂殖體階段。圖6、超遷移試驗(Super-shift)驗證Pfactin-I與iNBE的相互作用。超遷移試驗鑑定var基因內含子特徵序列，抗體來自重組Pfactin-I免疫後小鼠的血清總IgG，佐劑免疫小鼠組的IgG作為該實驗陰性對照。圖7、染色質免疫沉澱試驗(ChIP)驗證Pfactin-I與iNBE的體內相互作用。圖示PCR鑑定ChIP實驗獲取的DNA組分，其中I泳道為input DNA,即免疫沉澱前的樣品，2、3泳道分別為佐劑組IgG獲取的DNA產物，上樣量分別為I μ I和2 μ I ;4、5泳道分別為實驗組IgG獲取的DNA產物，上樣量分別為I μ I和2 μ I。圖8、間接免疫螢光技術(IFA)分析Pfactin-I在惡性瘧原蟲中的亞細胞定位。100倍油鏡觀察，綠色螢光示目的蛋白Pfactin-I在細胞核的分布位置,藍色螢光示DAPI細胞核染色，Merge示兩螢光通道融合顯示目的蛋白具體分布特徵，標尺為2 μ m。圖9、不同Actin抑制劑對惡性痕原蟲var基因轉錄譜的作用。A :⑶以及JAS這兩種藥理性質相反的藥物作用於Actin蛋白後，誘使其發生生物學性狀改變，其中Actin蛋白單體以楔形圖標顯示。B :螢光定量PCR鑑定經不同藥物作用後的var基因亞類轉錄變化，以DMSO (對照)、CD以及JAS三種藥物分別與原蟲培養液進行孵育。星號顯示該兩組藥物組別之間具有明顯的統計學差異(P < O. 01, T 檢驗)。FBA(fructose-biphosphate aldolase gene)果糖二磷酸醛縮酶。
具體實施方式
本發明首次從惡性瘧原蟲中鑑定和分離介導var基因家族轉錄沉默的非編碼DNA序列(寡核苷酸)及其結合蛋白一肌動蛋白。該DNA序列與肌動蛋白相互作用使var基因定位於細胞核周的異染色質區，導致基因沉默。本發明人鑑定的DNA序列還存在其它真核生物體，具有介導真核生物基因轉錄調控應用前景；所述的肌動蛋白在真核生物中也是高度保守的。並且，基於本發明的新發現，可篩選調節var基因轉錄(激活或沉默)、進而調節惡性瘧原蟲毒力的物質。iNBE 序列目前，var基因家族的研究熱點主要集中在var基因家族的轉錄調控機制，其中，非編碼區域的轉錄調控功能日益受到重視。非編碼區包括5』 UTR(啟動子)、3』 UTR以及內含子序列，其中，內含子區域在Var基因的轉錄沉默過程中發揮重要作用，但是相關機制尚未清楚。本發明人通過長期、深入的研究，首次鑑定了 var基因內含子中存在著關鍵的細胞核蛋白結合位點(Intron Nuclear-protein Binding Element, iNBE),長度為 18個喊基，該序列存在於大多數var基因的內含子中。每個內含子中含有該序列的拷貝數與相應var基因在染色體上的位置有關，其中，染色體中間區域的var基因內含子含有相對高的拷貝數，提示該內含子序列主要介導該類var基因的轉錄調控。在本發明的具體實施例中，以惡性瘧原蟲3D7株的一個var基因(No、PFDlOOOc)的內含子的不同區域作為EMSA試驗的探針，對細胞核核蛋白抽提物進行EMSA試驗。結果發現，該內含子區域存在一個多拷貝重複區，該區域是內含子中唯一具有核蛋白結合能力的位點(iNBE)。通過全基因組序列對比分析，發現iNBE序列只存在於var基因家族中的內含子區域中，並且該序列的拷貝數分布與var基因在染色體上的位置有關。此外，在人類、大鼠或小鼠等哺乳動物基因組中，也發現了不同拷貝數(分別是12、6和9個)的iNBE序列，提示該序列在進化上具有高度的保守性(在不同動物體中甚至可達到序列或序列片段完全一樣，即100%—致性)，可能具有類似的作用機制。作為本發明的優選方式，所述的iNBE序列具有5』 AAAAA(TA)nTCATAAAATAAAAA 3』所示的序列，其中，η為大於3的正整數(如3,4,5或以上)，如η = 3-20 較優選的,所述的iNBE是具有η為3-9 (如3，4，5，6或7)的序列，該序列是所有var基因內含子中iNBE序列的主要類型(75/76)。本發明還涉及上述寡核苷酸的變異體。此寡核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生(如人工構建)的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個寡核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其功能或特性(如與蛋白結合的特性)。本發明所述的寡核苷酸可以以分離的形式提供。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。本發明的寡核苷酸序 列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，擴增而得有關序列。—旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。目前，已經可以完全通過化學合成來得到本發明所述的寡核苷酸序列(DNA序列)。此外，還可通過化學合成將突變弓I入本發明蛋白序列中。I 類肌動蛋白(Actin-I)本領域技術人員均了解，肌動蛋白(Actin)是真核細胞高度保守的細胞骨架和核骨架蛋白組成成分。其傳統的細胞學特性為維持細胞形態以及細胞的運動。細胞核內也有Actin的存在，並且在基因轉錄調控方面起著關鍵作用。本發明人通過iNBE結合蛋白複合物的質譜分析,鑑定出I類肌動蛋白(Actin-I)是iNBE結合複合物中的成員之一。以惡性瘧原蟲為例，該蛋白(Pfactin-I)富集於惡性痕原蟲環狀體細胞核周圍區域,提示iNBE與Pfactin-I的相互作用是介導var基因位點在細胞核核周定位的重要途徑。此外，本發明人通過肌動蛋白抑制實驗，證實了游離的Actin (G-actin)主要參與Var基因的沉默；聚合的Actin (F_actin)則導致var基因的轉錄活化，表明惡性瘧原蟲細胞核內肌動蛋白的動態平衡對var基因的沉默/活化具有重要的調控作用。在惡性瘧原蟲中，存在兩種表達Actin的基因，S卩Pfactin_I和Pfactin-II，後者僅表達於瘧原蟲的有性生殖階段，而前者則貫穿了瘧原蟲的整個生活史。現有研究表明，惡性瘧原蟲Actin蛋白主要參與裂殖子運動及入侵紅細胞過程。本發明以iNBE序列作為純化探針，從惡性瘧原蟲細胞核蛋白抽提物中分離出iNBE結合複合物，並且通過串聯質譜分析鑑定出，Pfactin-I是該複合物的成分之一。本發明人通過製備Pfactin-I特異的抗體,分析了該蛋白在惡性瘧原蟲中的亞細胞分布狀態。間接免疫螢光試驗(IFA)表明，Pfactin-I主要分布在瘧原蟲細胞核核周。通過與惡性瘧原蟲核孔複合物抗體進行共定位IFA試驗，證實該蛋白富集於細胞核核內的外圍，即var基因位點的分布區域,提示Pfactin-I通過與iNBE相互作用，介導var基因位點在細胞核核周的定位,從而導致var基因在核周的異染色質區域處於轉錄沉默狀態。作為本發明的優選方式，所述的Actin-I是Pfactin-I，在惡性瘧原蟲基因組序列(www.plasmodb.org)中的編號為PFL2215w,其具有如SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列，以及SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本發明還涉及具有與所述的肌動蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-20個，較佳地1-15個，更佳地
1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括所述的肌動蛋白的活性片段和活性衍生物。該肌動蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與SEQ ID NO 3雜交的DNA所編碼的蛋白。
本發明還提供所述的肌動蛋白的類似物。這些類似物與天然肌動蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、Y -胺基酸)的類似物。Actin抑制藥物對var基因轉錄譜的影響由於Actin是真核生物生長發育必需的持家基因，因此無法通過基因敲除方法研究該蛋白對於Var基因的轉錄調控功能。根據不同物種中Actin保守的結構特徵，其主要有兩種存在形式游離的單個分子(G-actin)和聚合的微絲(F-actin)，這兩種形式之間的平衡對於Actin的生物學功能具有及其重要的意義。據此，本發明人利用了兩種化合物Jasplakinolide (JAS)和Cytochalasin D(O))對這種平衡作用進行短暫的破壞,分別導致Actin的聚合或解聚，並通過實時定量PCR方法觀察var基因轉錄譜的變化，從而評估不同形態的Actin對var基因的調控作用。本發明人發現，JAS處理後，3個持家基因的轉錄水平基本保持不變，但是具有iNBE序列的var基因出現了明顯的轉錄上調，而不具有iNBE序列的var基因則未受明顯的影響。該試驗表明，聚集狀態的Actin可以介導var基因的激活；而游離的Actin分子則與var基因默認的沉默狀態有關。因此，本發明還提供了一種調控細胞內var基因的轉錄的方法，所述方法包括採用調節肌動蛋白聚合或解聚合的試劑處理細胞。較佳地，所述的細胞是瘧原蟲的細胞。具體的，採用調節肌動蛋白解聚合的試劑處理細胞，調控細胞內var基因轉錄沉默，從而降低瘧原蟲的毒力；或採用調節肌動蛋白聚合的試劑處理細胞，調控細胞內Var基因轉錄激活。例如，所述的調節肌動蛋白解聚合的試劑是Cytochalasin D(CD);或所述的調節肌動蛋白聚合的試劑是 Jasplakinolide (JAS)同時，本發明還提供了調節肌動蛋白聚合或解聚合的試劑的用途，用於調控細胞內var基因的轉錄。篩選降低瘧原蟲毒力的物質本發明還提供了一種對於篩選降低瘧原蟲毒力的物質有用的複合物，其包括本發明所述的寡核苷酸以及肌動蛋白，且兩者能夠相互結合。所述的複合物可以是分離的或存在於混合物中(如細胞核蛋白)。所述的複合物可以作為篩選降低瘧原蟲毒力的物質(該物質可以是潛在物質)的篩選模型。因此，本發明還提供了一種篩選降低瘧原蟲毒力的潛在物質的方法，所述方法包括用候選物質與寡核苷酸以及肌動蛋白形成的複合物接觸，觀察該複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況，若兩者的相互作用增強，則表明其是對於降低瘧原蟲毒力有用的潛在物質。可以通過設置不加入候選物質的對照組來進行比較，以方便地做出判斷；這種方法是本領域人員熟悉的。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的瘧原蟲毒力抑制試驗，以進一步選擇和確定對於抑制瘧原蟲毒性有用的物質。在本發明中，鑑定肌動蛋白與本發明的寡核苷酸相互作用以及相互作用的強弱的方法是本領域人員熟知的技術，比如GST沉降技術、噬菌體展示技術、酵母雙雜交系統或免疫共沉澱技術。作為本發明的一種優選實施方式，可通過免疫共沉澱法鑑定複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況。採用免疫沉澱技術來驗證所述的寡核苷酸與蛋白之間的特異性相互作用。所述的免疫共沉澱技術的原理是在保持核酸-蛋白相互作用的條件下，收穫和裂解細胞，從細胞提取液中特異性地免疫沉澱目的核酸-蛋白，然後通過離心等方法分離免疫沉澱物。核酸-蛋白的共沉澱物，可採用抗該蛋白的抗體，通過比如Western印跡來檢測其中存在的蛋白，通過比如PCR擴增技術檢測其中存在的核酸。此外，如果細胞在裂解前已經用標記物進行過標記，則可通過放射自顯影或其它免疫學技術來觀察共沉澱的核酸-蛋白。發明的主要優點在於(I)通過EMSA實驗，首次從var基因內含子區域中鑑定了惡性瘧原蟲細胞核蛋白的結合位點，而且該位點的分布與Var基因的染色體位置有關聯。(2)該內含子位點(iNBE)在高等哺乳動物基因組中也有一定的分布，提示了一種進化上的保守性。(3)首次在瘧原蟲細胞核內鑑定到了核內Actin，而且該蛋白與var基因內含子具有相互作用，提示其參與了 var基因在細胞核內的定位，從而導致var基因沉默。(4)首次在細胞核內觀察到Actin富集於核周，目前為止，未曾在其他生物體中發現該現象。(5)通過Actin藥物抑制試驗,揭示了 Actin的動態平衡對於var基因轉錄調控的重要作用，並證實聚合的Actin能夠激活var基因轉錄，而且這種活化作用和內含子的iNBE序列有關。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按
重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例I、惡性瘧原蟲var基因內含子序列的擴增及探針製備(I) var基因內含子序列擴增 為了製備EMSA探針，首先需要從惡性瘧原蟲3D7株(參見中國專利申請200610118947. 8)基因組中擴增出var基因內含子序列，克隆到載體上並進行測序。由於惡性瘧原蟲非編碼區序列中的AT含量可以高達90%以上，因此普通的Taq酶無法有效地擴增這些序列，而且難以保證序列的正確性。在本實施例中，為了兼顧擴增效率和序列保真，本發明人全部採用Toyobo的KOD-Plus高保真酶。具體的反應配製以及擴增程序如下IOx KOD-Plus 反應緩衝液5 μ I MgCl (2mM) 5μ I ；dNTP(2mM) 5μ I ；上遊引物(SEQID NO 4) (20 μ Μ) 1μ I ；下遊引物(SEQID NO 5) (20 μ Μ) 1μ I ；瘧原蟲基因組DNA :1 μ I ;KOD-Plus (Toyobo) I μ I ；雙蒸水31μ I_50 μ I反應程序95°C，2min;94°C 30s，5(TC 30s，65°C lmin，32 循環；65°C，lOmin。1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，並割膠回收目的片段。本發明人將擴增出的目的基因通過雙酶切連接方法克隆到T載體(Promega)上(具體方法參見分子克隆第二版)，並對陽性重組子進行序列分析，每個基因測2個克隆，以排除PCR反應過程中的點突變，最終獲得序列正確的var基因(PFDlOOOc)內含子序列。(2)探針製備注自惡性瘧原蟲3D7株系基因組中擴增獲得染色體中間位置var基因(PFDlOOOc)的全長內含子，並通過PCR分割成一系列片段重疊的短探針(5』端生物素標記)進行多輪的EMSA試驗。在本實施例中，本發明人採用生物素-親和素反應系統取代常規的同位素法進行EMSA分析。首先需要製備基於var基因內含子序列的生物素標記的探針，根據探針長度的不同，主要有以下兩種標記方法(I) PCR 法對於IOObp以上的探針，由於不易獲得如此長度的引物，因此無法進行直接標記。於是本發明人先設計一對引物，並在合成時直接在這對引物的5』端進行生物素標記。然後用該對引物從載體上的基因中擴增目的片段，瓊脂糖凝膠電泳後回收，TE溶液洗脫，即可作為EMSA探針使用。(2)直接標記法對於較短的探針(比如80bp以下)，本發明人利用Pierce公司的Biotin3』EndDNA Labeling Kit分別在兩條互補的引物3』端標記生物素(具體操作參見操作手冊=Pierce 89818)，然後將這兩條互補引物等量混合，在PCR儀上90°C變性I分鐘，室溫逐漸冷卻，靜置30-60分鐘後，即可作為EMSA引物。考慮到EMSA分析中探針長度適宜在300bp以下，因此為了便於探針的設計與合成，本發明人以該內含子序列為模板，通過PCR方法擴增出部分序列重疊( 20bp)的4條探針Bio-int-a、b、c和d,並用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳對這4條探針進行分離和純化,最後測定濃度後用於EMSA試驗。當某一條探針具有核蛋白結合活性後，則在該探針序列的基礎上進行更短探針的設計，從而找到該內含子中最關鍵和最短的結合位點(圖I)。實施例2、惡性痕原蟲海南株總核蛋白初步提取
I.取IOOml的體外培養的惡性瘧原蟲3D7株培養物，原蟲率約為10% (每100各紅細胞中被瘧原蟲感染的紅細胞個數)，2000rpm, 5min去上清。2.加入 20ml 的 O. 15% (w/v)皂素/PBS 溶液，混勻，4°C，30min。3. 8000rpm, 4°C, IOmin,去上清。4.用20ml冷的IxPBS溶液洗滌3次，每次4°C，8000rpm, 10分鐘。5.加入 I. 5ml 完全細胞裂解液(20mM Hepes ρΗ7· 9，IOmM KCl，ImMEDTA, ImM EGTA,ImM DTT, I X蛋白酶抑制劑混合物，O. 65 % (v/v) NP-40)，充分混勻，振蕩10秒，冰水浴10 分鐘。6.8000rpm，5min，小心吸取上清，即為瘧原蟲胞漿蛋白，分裝後-80°C保存。7.重複2次，充分洗滌細胞核。8.在細胞核沉澱中加入150μ I完全核蛋白提取液(20mM Hepes pH7. 9,800mMKCl, ImM EDTA, ImM EGTA, ImM DTT, I X蛋白酶抑制劑混合物)，混勻後置於冰水浴上，間隔振蕩，每次10s，總共30min。9. 14000rpm, 4°C, 30min。10.小心吸取上清，即為瘧原蟲核蛋白。11.在核蛋白中加入等體積的核蛋白稀釋緩衝液(20mM Hepes pH7. 9, ImM EDTA,ImM EGTA, I X蛋白酶抑制劑混合物，30% (v/v)甘油)，混勻後，分裝，_80°C保存。實施例3、EMSA實驗鑑定內含子-核蛋白複合物在本實施例中，本發明人主要採用Pierce公司的LightShiftChemiluminescentEMSA試劑盒進行核蛋白的鑑定(具體方法參見Pierce 20418產品說明書)。其主要步驟如下A.預實驗，初步建立EMSA體系，並摸索探針的最佳用量；B. EMSA 分析(I)根據探針大小，配製相應的非變性PAGE膠。(2)以O. 5XTBE為電泳緩衝液，4°C，100V，預電泳lh。(3)根據不同的實驗目的，設計相應的EMSA反應體系(以20 μ I體系為例)，各體系如表I。表I
試劑__Ppi管序』
__1234567
ddH^O* -------
4 X EMSA緩 5(μ1) 5(μ I) 5( μ I) 5( μ I) 5( μ I) 5(μ I) 5(μ I)
[0128」
衝液**________
探針 1( μ I) 1(μ I) 1(μ I) 1(μ I) 1(μ I) 1( μ I) 1( μ I) 核提取物 - 1( μ I) 2(μ1) I(Ul) I(Ul) 1( μ I) 1( μ I) Polydl-dC - I(Ul) I(Ul) I(Ul) I(Ul) I(Ul) I(Ul)
權利要求
1.一種寡核苷酸，其特徵在於，所述的寡核苷酸選自(i)如下所示序列的寡核苷酸5』AAAAA(TA)nTCATAAAATAAAAA 3』 ；其中n = 2-20 ;或(ii)與⑴的寡核苷酸同源的變異體，具有與⑴的寡核苷酸相同的與蛋白質結合的能力。
2.權利要求I所述的寡核苷酸的用途，用於特異性地與肌動蛋白相互作用。
3.肌動蛋白的用途，用於與var基因內含子相互作用，調控var基因的轉錄和表達。
4.一種複合物，其特徵在於，包括權利要求I所述的寡核苷酸以及肌動蛋白。
5.如權利要求4所述的複合物，其特徵在於，所述的寡核苷酸以及肌動蛋白相互作用。
6.權利要求4或5所述的複合物的用途，用於篩選抑制var基因轉錄水平、從而降低瘧原蟲毒力的物質。
7.一種篩選降低瘧原蟲毒力的潛在物質的方法，其特徵在於，所述方法包括用候選物質與權利要求4或5所述的複合物接觸，觀察該複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況，若兩者的相互作用增強，則表明其是對於降低瘧原蟲毒力有用的潛在物質。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述方法包括(a)在測試組中，向包含權利要求4或5所述的複合物的體系中添加待篩選的候選物， 並檢測複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況；並且，在對照組中，在不添加所述候選物的、包含權利要求4或5所述的複合物的體系中，檢測複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用與對照組複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用進行比較，如果測試組複合物中寡核苷酸以及肌動蛋白的相互作用在統計學上強於對照組，就表明該候選物是對於降低瘧原蟲毒力有用的潛在物質。
9.一種調控細胞內var基因的轉錄的方法，其特徵在於，所述方法包括採用調節肌動蛋白聚合或解聚合的試劑處理細胞。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，採用調節肌動蛋白解聚合的試劑處理細胞，調控細胞內var基因轉錄沉默，從而降低痕原蟲的毒力；或採用調節肌動蛋白聚合的試劑處理細胞，調控細胞內Var基因轉錄激活。
全文摘要
本發明涉及一種調控真核生物基因轉錄的DNA序列及其結合蛋白。本發明人首次從惡性瘧原蟲中鑑定和分離介導var基因家族轉錄沉默的非編碼DNA序列及其結合蛋白——肌動蛋白。該DNA序列與肌動蛋白相互作用使var基因定位於細胞核周的異染色質區，導致基因沉默。並且，基於本發明的新發現，可篩選調節var基因轉錄、進而調節惡性瘧原蟲毒力的物質。
文檔編號C12Q1/68GK102618538SQ201110028869
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者張青鋒, 潘衛慶 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學