天花粉蛋白合成基因的製作方法

2023-06-11 21:26:46 1

專利名稱：天花粉蛋白合成基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學，具體地說涉及採用計算機輔助設計基因DNA順序、DNA的全合成和重組技術以及基因表達的調控等基因工程學，使大腸桿菌等產生原來只有在中醫藥用植物-栝樓屬(Trichosanthes Kirilowii Maxim.)植物塊根中才含有的醫用蛋白質，天花粉蛋白(縮寫TCS)。
栝樓在我國有長期的藥用歷史，近年來，在發掘祖國醫學寶庫的研究中，我國科技工作者分離純化了結晶的天花粉蛋白，並成功地在臨床上將TCS用於中期妊娠引產和抗早孕、迄今已有十多年數以千計病例的成功實踐。TCS對宮外孕、絨毛膜上皮癌及葡萄胎也有療效。最近發現TCS能抑制愛滋病病毒(HIV)在感染細胞內的複製，對B型肝炎等七種病毒也有抑制作用。分子生物學研究指出TCS具有I型核糖體失活蛋白的活力，是一個藥用範圍潛力廣泛的重要醫用蛋白[汪猷主編，〈天花粉蛋白〉(1990年)，科學出版社，北京.]。
TCS是一個分子量為26，000D，等電點為pI9.4的鹼性蛋白質。它由247個胺基酸殘基組成的單鏈多肽，其胺基酸順序已被測定[Wang，Yu，et al.，Pure Appl.Chem.(1986)58，789-798;Collins，E.J.，et al.，J.Biol.Chem.(1990)265，8665-8669.]。TCS天然基因DNA順序已被測定[Chow，T.P.，et al.，J.Biol.Chem.(1990)265，86708674.]，它編碼289個胺基酸殘基，其中包括N-端23個殘基的前導肽，247個殘基的成熟肽和C端19個殘基的延伸肽。
TCS在應用於臨床引產和治療愛滋病的病例中尚出現過一些不利的副作用，還需要對它的結構與功能加以改造。迄今，對蛋白質的結構改造比較有效的是基因工程方法，已有文獻報導關於天花粉蛋白天然基因的基因工程研究[Shaw，P.-Ch.，et al.，Gene(1991)97，267-272;鮑一明等，中國科學B輯(1992)9944-950;汪麗琴等，自然科學進展(1992)5402-406;Zhu，R.-H.，et al.，Int.Pept.Prot.Res.(1992)39，77-81.]。此外，美國專利(US 5128460，1992年)公布了一個合成的DNA順序，它不同於天然TCS基因順序，主要用於編碼成熟的TCS順序，但合成步驟複雜繁瑣。上述已有技術報導的基因在大腸桿菌中表達的產率低，僅為1-5mg/l，表達的結果只能用靈敏的放射免疫印跡法(Western blotting)檢出，大多數用天然基因表達的產物是TCS前體，有的帶著前導肽或帶C端延伸肽，有的甚至不表達。為了克服上述缺點，因此設計和合成一個方法簡便且高表達的TCS基因是目前天花粉蛋白基因工程研究的重要課題。
為此，本發明目的是設計合成一個成熟的天花粉蛋白結構基因，直接在大腸桿菌中能高表達出與天然天花粉蛋白有相同免疫活力和生物活力的蛋白質，並且在天花粉蛋白基因中設置至今為最多的限制性內切酶部位，以提供一個便於進行基因突變研究的基因工程體系。
本發明是一種在大腸桿菌中高表達的天花粉蛋白合成基因，是按大腸桿菌高表達體系的密碼子分配係數，經計算機輔助設計和全合成的TCS結構基因(簡稱mTCS G)，能以高產率(20mg/l)表達出單一的成熟TCS，經生物測試證明這個基因產生的蛋白質具有與天然TCS相同的免疫活力和生物活力，並且該基因便於對TCS突變進行系統的結構與功能研究。
1.基因的設計將247個殘基的胺基酸順序輸入計算機後，運轉有關程序，按大腸桿菌高表達密碼子分配係數[參見文獻Sharp，P.M.，et al.，Nucl.Acids Res.(1986)14，5134.]和設置儘可能多的常用的單一的限制性內切酶部位的要求設計了含755b.P.的mTCSG(

圖1)，它含有編碼基因741 b.P.，雙重終止密碼子(保證正確表達的機率很高)，以及兩端的粘性末端EcoRⅠ和HindⅢ。在mTCSG中，除了二端的EcoRⅠ/HindⅢ外，還設置了27個常用的單一的限制性核酸內切酶部位(圖2)，相應的TCS天然基因中只有7個這種內切酶。顯然mTCSG更有利於進行基因的定位突變和盒式突變，以便系統、全面地對TCS進行結構與功能關係的研究。另外對照TCS天然基因，有141個鹼基不一樣(圖1中mTCSG核苷酸順序上面標出的部分鹼基)，這是為了改變126個胺基酸的密碼子使mTCSG適合於在大腸桿菌中表達。與美國專利(US 5128460)報導的合成基因比較有131個胺基酸密碼子的164個鹼基不同。即mTCSG與天然TCS基因及美國專利的合成TCS基因比較，有50%以上的密碼子不同。
2.基因的全合成本發明參照該領域的標準方法和本實驗室於1990年發表的單鏈法[參見文獻Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878]並加以改進後完成了mTCSG的全合成。採用T4DNA連接酶催化連接有機合成的寡核苷酸片段，然後用DNA重組技術將連接成的mTCSG大片段單鏈或雙鏈直接克隆進一種質粒載體，並且在載體中裝配成完整的mTCSG，得到含此基因的克隆質粒並且轉化一種大腸桿菌。
圖3表示mTCSG被劃分為EP1PN和NH三個大片段和它們由A、B.C.D……等等26個寡核苷酸片段組成。圖4是mTCSG的合成路線圖EP和PN大片段分別從六個和四個寡核苷酸片段按單鏈法連接成相應的單鏈大片段，NH大片段由三個雙鏈連接而成;然後EP，PN和NH三個大片段分別先後按圖4所示的路線逐步重組克隆進載體pUC18(參見文獻Yanisch-Perron，C.，et al.，Gene(1985)33，103-119)，直至得到含完整mTCSG的克隆質粒pCOTCS(於1993年5月18日提交中國典型培養物保藏中心，地點中國武漢，保藏編號CCTCC NOM93029)。
3.全合成mTCSG的表達為了使全合成的mTCSG能在大腸桿菌中高表達，除上述密碼子設計方面的安排外，還採取下述二個設計a.選擇由強啟動子控制的表達載體質粒，b.設計和合成與這個表達載體及mTCSG都匹配的核糖體結合部位，SD順序，及相關的核苷酸順序。
利用本發明的mTCSG容易改造的優點，如實施例3所述按圖6所示的路線構建了高效表達質粒pElTCS(於1993年5月18日提交中國典型培養物保藏中心，地點中國武漢，保藏編號CCTCC NOM93030)，並轉化大腸桿菌C600(pCI857)。轉化子經預培養至對數生長的中後期，於41℃熱誘導並繼續培養4個小時後，離心收集菌體。表達產物經過不同時間取樣經過十二烷基磺酸鈉變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表明(圖7)在與天然TCS泳距相同的部位，出現一條隨表達時間延長而產物數量逐漸增加的蛋白質條帶，表達產率約為20mg/l。
4.mTCSG表達產物的純化和活力測定將上述表達產物20mg/l按圖8的程序將菌體細胞用溶菌酶等方法破碎，離心收集上清液。經硫酸銨沉澱及上清液對磷酸鈉(pH7)透析，再用羧甲基葡聚糖C-50柱層析分離，經NaCl梯度洗脫後(圖9)可得到純度為95%以上的TCS純品(圖10)15mg/l，經ELISA方法鑑定有天然TCS的免疫活性[表3]，和對中期妊娠小白鼠的止孕效應測定證實用mTCSG表達產生的TCS具有天然TCS的生物活力[表4]。
5.天花粉蛋白突變體結構基因的構建和表達為了利用mTCSG進行TCS突變，原則上先找出要突變的胺基酸密碼子(一個或幾個)在圖1中的部位，然後找到待突變胺基酸密碼子附近的二端限制性內切酶，決定要置換的限制性內切酶片段，併合成含有新密碼子的限制性內切酶片段後，用類似上述方法進行DNA重組構建突變體質粒，並進行突變體質粒的基因表達等。
這裡介紹天花粉蛋白N227K突變體先在質粒pClTCS上進行將第227位天門冬醯胺密碼子AAT變換成賴氨酸密碼子AAG的限制性內切酶片段置換，即用新合成的限制性內切酶片段，BClI-BstBI，取代pClTCS中原來的BClI-BstBI片段的DNA重組，得到含突變體N227K結構基因的質粒pC1TCS-N227K，然後用實施例3(A)後半部分相同的方法將突變體N227K結構基因從突變體質粒pC1TCS-N227K轉入表達載體pPLc2833得到突變體表達質粒pE1TCS-N227K，並轉化大腸桿菌C600(pCI857)後基因表達和表達產物的分離純化、測活等等。用相似的步驟對mTCSG進行基因突變可以構建許多突變體基因，然後基因表達可得到許多天花粉蛋白的突變體。研究它們的結構與功能關係，從中可以發現一些性能優良的天花粉蛋白的衍生物或新品種，實施例5介紹的N227K突變體已顯示它對IgE單抗的免疫力有明顯降低，是天然天花粉蛋白的24%-44%(表5)。
下面所給出的定義是為了更清楚地說明它們在本發明中使用的含義。
基因是指生物合成一個蛋白質所需的完整DNA部分，一個基因包括結構基因，結構基因上遊的轉錄啟動區，它啟動和調節結構基因的表達，和3'端多聚腺苷酸順序。
結構基因是基因的一個部分，包括編碼蛋白質或多肽的部分，有時包括其中一部分插入的DNA片段。結構基因通常可以在細胞中發現或通常不在其被引入的細胞位置上，在後一種情況下，它被稱之為異源基因。異源基因可以全部或部分地來自該領域已知的任何來源。結構基因在編碼區或翻譯區有一個或多個修飾，它們能影響表達產物的生物活性或化學結構、表達率或表達控制方式。這些修飾包括(但不局限於)突變、插入、缺失和一個或多個核苷酸的置換。
合成基因是指一個結構基因的DNA順序中編碼區的全部或大部分是化學合成的，如這裡所列舉的，寡核苷酸片段是採用該領域熟知的過程化學合成，經退火和酶催化連接而形成基因片段，然後用酶催化進一步裝配這些基因片段成完整的基因。與這裡所描述的合成基因的功能和結構相當的基因可採用該領域中所用的定位突變或其它有關的方法來製備。
克隆是指一群細胞的每一個衍生自同一個祖先細胞，克隆最重要的用處是將DNA片段，包括整個基因或一部分，通過載體(如質粒，噬菌體和柯斯質粒)在宿主細胞中擴增。本發明合成的mTCSG按此領域的常規方法重組進質粒後轉化大腸桿菌而得到擴增。
轉化是指穩定地將攜帶功能基因的一個DNA片段引入一個以前不含有該基因的生物體內。上述mTCSG通過重組進質粒後轉化引入以前不含有該基因的大腸桿菌中。
基因表達是指結構基因轉錄和翻譯(或轉譯)而產生所編碼的蛋白質。本發明的合成mTCSG在大腸桿菌中比相應的TCS天然基因有更高的表達效率和更正確的表達結果。
功能相當指功能相同或接近相同。一種基因的表達產物，其免疫活性和生物活力與天然基因表達的產物或天然分離的相同，就被認為與天然基因功能相當。
本發明有下列優點1.只設計成熟TCS的編碼基因核苷酸順序，表達時可以採用多種方法如在實施例3中敘述的，在基因的5'端加一個翻譯所需的起始密碼子ATG和必要的核糖體結合部位，SD順序，等有關核苷酸順序，這樣可使本發明的mTCSG有適宜於選擇各種大腸桿菌表達體系的靈活性。
2.按表達的宿主細胞密碼子體系設計相應的結構基因，從根本上克服了天然基因(植物細胞真核系統)的局限性。我們在mTCSG的密碼子選擇上消除了原天然基因中18個在大腸桿菌高表達體系分配係數中極低的密碼子[表1]，為在大腸桿菌中實現高表達奠定基礎。
3.在mTCSG中通過計算機輔助設計了儘可能多均勻分布的單一的限制性核酸內切酶部位。不包括二端粘性末端，mTCSG中設置27個常用的單一的限制性內切酶部位，二個相鄰部位之間平均間隔約40b.p.，這樣就可以很方便地利用mTCSG進行基因的定位突變或盒式突變去進行TCS結構與功能關係的研究。
4.本發明天花粉蛋白合成基因的合成方法步驟簡單，只經過四次克隆就完成了整分子mTCSG的全合成和克隆。尤其是PN片段的合成方法，不用放射性標記，只用常規方法，簡便而節省(節約鹼基約33%)地實現了單鏈法連接，在基因合成領域中應用前途廣闊。
以下的實施例可用作本發明的具體方案，它們不限制本發明的範圍。
材料與方法除下述材料與方法之外的參見文獻[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878.]。
Sep-pak C18反相柱來自Waters公司;
低熔點瓊脂糖凝膠和考馬斯亮蘭R-250來自GibCO BRL公司;
限制性核酸內切酶，多核苷酸磷酸化激酶，T4DNA連接酶來自New England Biolabs;
DNA順序分析所需的引物由本實驗室合成純化;ATP來自Amersham公司;
羧甲基葡聚糖C-50和質粒pUC 18來自pharmacia-LKB公司;
表達載體pPLC 2833和大腸桿菌C600(pCI857)系麻省理工學院khorana教授贈送;
大腸桿菌JM110系Messing教授贈送;
其他化學試劑均為市售國產品。
寡核苷酸片段間的連接按單鏈法進行，雙鏈法按文獻[Karnik，s.s.，Sakmar，T.P.，Chen，H.-B.and Khorana，H.G.，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA.(1988)85，8459-8463]進行。
質粒的構建對需要進行重組的質粒先按選擇的限制性內切酶進行雙酶解，酶解物經低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離，按常規方法製備線性質粒大片段，然後與合成的基因片段或從另一個質粒雙酶解後分離的基因片段連接，連接產物按常規方法轉化大腸桿菌並以特定的抗菌素篩選轉化子以pUC18為載體的質粒轉化大腸桿菌JM83用氨苄青黴素37℃培養。以pPLc2833為載體的質粒轉化大腸桿菌C600(pCI857)用氨苄青黴素和卡那黴素30℃培養。對長出的菌落，挑選單菌落於LB培養液中按常規方法擴增和製備新構建好的質粒。
質粒中的基因DNA順序分析按文獻[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878.]的條件用pUC18多接頭區兩端的通用引物或基因合成中用作配對的短寡核苷酸為引物進行。
基因表達這裡介紹以pPLc2833為載體[參見文獻Remaut，E.，Tsao，H.and Fiers，W.，Gene(1983)22，103-113.]的基因表達。
過夜培養的含表達質粒的菌液，稀釋後30℃培養使A650nm升高到0.5-0.8轉入41℃熱誘導，直至A650nm不再增加為止。
表達產物的分離純化菌體自培養液離心分離後懸浮於含溶菌酶的Tris·HCl(三羥甲基甲銨鹽酸鹽)和EDTA(乙二胺四醋酸鈉鹽)組成的緩衝液中，保溫後，用乾冰和溫水反覆凍融三次，然後用上述不含溶菌酶的緩衝液稀釋，高速離心取蛋白質上清液用硫酸銨沉澱離心，取上清液對磷酸鈉緩衝液透析，後經羧甲基葡聚糖C-50柱分離，用NaCl鹽梯度洗脫。分離純化得到純的基因工程產生的天花粉蛋白。
實施例1mTCSG的設計(A)編碼DNA順序的設計在計算機VAX/11-780輔助下進行mTCSG的設計，將已知的α-TCS胺基酸順序輸入計算機後，運轉美國國家生物醫學研究基金會(NBRF)贈送的軟體PSQ和NAQ，檢查由計算機逆翻譯的由兼併密碼子組成的RNA順序中可能出現的限制性內切酶的識別順序，然後按照(1)大腸桿菌高表達密碼子分配係數(表1)，(2)在選定的克隆質粒pUC18中均勻安置單一的限制性內切酶於TCS合成基因中，和(3)合成基因片段分段和消除自身配對第三項要求人工選定每個胺基酸的密碼子而確定全基因的DNA順序如圖1。在這個順序的3'端還加上二個終止密碼子TAA和TGA以及兩端為分子克隆所需要的EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶識別順序的粘性末端。
(B)部分表達調控順序的設計如前述，我們採用質粒pPLc2833作為TCS合成基因的表達載體。為了使這個載體能實際運作，必須在啟動子與合成基因的5'端之間加一個翻譯的起始密碼子ATG和核糖體結合部位，SD順序。考慮到基因表達時轉錄出來mRNA的5'端的200個核苷酸會形成二級結構，以及SD順序在這個初生態mRNA5'端二級結構中的狀況對表達產率會有極大影響，我們設計了下列帶SD順序的區域及結構基因的5'端編碼順序如下EcoRI BstEII SacIAATTCTAAGGAGGTAACCGCAATGGATGTTTCTTTCCGTCTGTCTGGTGCAACGAGCTGATTCCTCCATTGGCGTTACCTACAAAGAAAGGCAGACAGACCACGTTGC實施例2mTCSG的全合成(A)寡聚脫氧核苷酸的製備mTCSG被分成如圖3所示的EP，PN和NH三個大片段。EP(345b.p.)進一步劃分為A、B、C、D、E和F六個正股寡核苷酸片段，二個末端負股片段A'b和eF'，以及三個中間連接用的短的橋式負股寡核苷酸bc，cd和de。PN(268b.p.)劃分為G.H.I和J四個負股寡核苷酸片段，二個末端正股短片段G'和J'以及三個橋式正股短的連接用寡核苷酸gh，hi和ij。NH(142b.p.)劃分為K(+)K(-)、L(+)L(-)和M(+)M(-)三個雙鏈。總計26個寡核苷酸在DNA合成儀上(ABⅠ 381A型)用固相亞磷醯胺三脂法合成。每個寡核苷酸被單獨合成後，經濃氨水55℃處理6小時以上，使之從固相柱上脫落並切除保護基團，粗產物濃縮後溶於水，用尿素變性的聚丙烯醯胺電泳(PAGE)分離，含純產物的凝膠帶經碳酸氫三乙銨(1mole/l)溶出，用Sep-pak C18反相柱按LO等方法(參見文獻Lo，K-M.，Jones，S.S.，Hackett，N.R. khorana，H.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)81，2285-2289.]脫鹽得到純的寡核苷酸片段。
純的寡核苷酸用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常規方法進行5'-磷酸化，必要時用Sephadex G-50純化。
(B)寡核苷酸間的連接合成基因大片段首先按圖4所示的合成路線，將上述5'-磷酸化的寡核苷酸分別用T4DNA連接酶連接成EP，PN和NH三個大片段，其中EP和PN片段用單鏈法連接，NH大片段用雙鏈法合成。
單鏈法連接合成基因大片段以PN大片段的合成為例。等摩爾的G，H，I和J與正股配對短片段gh和ij按1∶1.2摩爾比分為二組即G.H和gh;I，J和ij分別置於配對溶液[Tris·HCl(pH8，50m mole/l)，氯化鎂(10m mole/l)]退火配對，溫度降至40℃時，混合這二組配對物，並加入正股短片段hi，待溫度進一步降至10℃，加入T4DNA連接酶等連接反應液組分，在10℃連接反應16小時，結果如圖5所示。它顯示的是用非放射性的ATP進行寡核苷酸的5'一磷酸化後連接合成了PN大片段，用2%低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離純化產物取得滿意結果。其中DNA電泳條帶在紫外燈下用溴乙錠染色而顯示橙色螢光帶。表2列出該連接反應中各種可能形成的中間產物片段。
EP大片段的連接合成是採用[γ-32P]ATP將B.C.D.E和F等五個寡核苷酸[5'-32P]磷酸化後，按上述相類似的步驟分步配對一次連接裝配成EP大片段，PAGE分離純化，用鄰位分析[參見文獻Sgaramelle，V.，and Khorana，H.G.，J.Mol.Biol.(1972)72，427-444.]顯示dAp+∶dGp+∶dTp+∶dCp+＝1∶1∶3∶0，初步證實已合成了EP大片段。
NH大片段由三個雙鏈K(+)K(-)，L(+)L(-)和M(+)M(-)按常規方法等摩爾比一次連接合成。
(C)大片段克隆和mTCSG的全合成按圖4程序，上述連接成的EP，NH和PN三個片段分別先後克隆進質粒pUC18得到含mTCSG整分子的克隆質粒pCOTCS。
首先將EP片段與A'b與eF'二端負股配對片段按單鏈法配對後與EcoRⅠ/PstⅠ雙酶解pUC18而得的線性質粒連接，並且轉化大腸桿菌JM83。對轉化子擴增後提取製備的質粒進行酶介分析EcoRⅠ/PstⅠ雙酶解及BstEⅡ，EcoRV，BglⅡ，AlwNⅠ，ECoO109Ⅰ和NdeⅠ酶解，初步肯定EP片段已經正確合成並克隆進質粒pUC18得到新質粒pCOTCS-EP。
NH片段則與經NheⅠ/HindⅢ雙酶解p3'THF＊得到的線性質粒連接並轉化大腸桿菌JM83，並對轉化子所得的質粒經BstBⅠ，DraⅠ酶解及NheⅠ/HindⅢ雙酶解證實後，進一步用PstⅠ/HindⅢ雙酶解所得的質粒pCOTCS-NH，低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離純化小片段與同樣經PstⅠ/HindⅢ雙酶解pCOTCS-EP而得的大片段連接重組成pCOTCS-EP/NH質粒，最後，這個質粒經過PstⅠ/NheⅠ雙酶解後，和事先已將PN片段與二個末端配對片段G'和J'配對後，以1∶10或1∶20摩爾比進行連接，並轉化大腸桿菌JM83，得到含mTCSG的克隆質粒pCOTCS。經DNA順序分析證明合成的mTCSG與設計的相符。
實施例3合成的天花粉蛋白結構基因在大腸桿菌中的表達(A)表達質粒的構建如圖6所示含mTCSG的質粒pCOTCS經EcoRⅠ/SacⅠ雙酶解後，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離製備線性質粒大片段。實施例1設計的SD順序的片段ES(+)和ES(-)，在DNA合成儀上合成，純化後，配對成帶SD順序的雙鏈片段ES與上述線性質粒大片段，按10∶1或20∶1摩爾比連接轉化大腸桿菌JM83(參見文獻Vieria，J.，et al.，Gene(1982)19，259-268)，轉化子經BstEⅡ酶解分析證明是含有在mTCSG上遊帶SD順序的質粒pC1TCS。
＊此質粒系發明人實驗室從質粒pWR13m[參見文獻Chen，H.-B.，et al.，「Current Research on Photosynthesis」Vol Ⅲ，347-350(1990)，Ed.by Baltscheffsky，M.Kluwer Academic Publishers，Netherland]在多接區的PstⅠ和HindⅢ之間引入NheⅠ識別順序改建而成。
質粒pC1TCS與pPLc2833分別經EcoRⅠ/HindⅢ雙酶解，前者取結構基因的較小片段，後者取線性質粒大片段，連接重組成如圖6所示的表達質粒pE1TCS，並轉化大腸桿菌C600(pCI857)(參見文獻Simons.G.，et al.，Gene(1984)，28，55-64)。
(B)在大腸桿菌中的基因表達取上述合格的轉化子單菌落置於少許LB培養液中30℃搖蕩過夜，然後此培養液稀釋50倍至A650nm＝0.05-0.06，30℃培養約2小時至A650nm＝0.5-0.8時，轉入41℃熱誘導表達，分別於15'，30'，60'，2小時和4小時各取樣1ml，離心後沉澱部分加入100μl菌體裂解液溶解均勻後，各取15μl上樣，經15%十二烷基磺酸鈉變性的PAGE分離，然後用考馬斯亮蘭顯色顯示在電泳遷移速度與天然天花粉蛋白泳速相同的部位出現一條隨表達時間延長而蛋白量不斷增加的色帶(圖7)，但熱誘導四小時後不再增加，後經1-2公升培養液規模表達多次重複，表達產率約20mg/l。表達產物純化後顯示與天然天花粉蛋白有相同的免疫活力和生物活力已如前述。
實施例4mTCSG表達產物的純化如圖8所示，1克溼重菌體懸浮在3ml緩衝液pH8.0含Tris·HCl(10m mole/l)，EDTA(1m mole/l)，0.6mg溶菌酶，在37℃水浴上保溫20分鐘，經凍融法反覆處理三次，用上述不含溶菌酶的緩衝液稀釋至30ml，30，000g離心20分鐘，取上清液和少許沉澱，經15%SDS-PAGE分離分析表明，基因表達產物主要存在於上清液中，上清液用25%飽和度的硫酸銨沉澱和6，000g離心20分鐘，取上清液對磷酸鈉(pH7.0，10m mole/l)透析，經圖9所示的陽離子交換層析柱(CM-Sephadex C-50)層析，NaCl梯度洗脫(0.1mole/l-0.8mole/l，由各300ml以磷酸鈉為基液的溶液組成)，每3ml搜集1管，實驗條件下產物峰在0.44mole/l NaCl洗脫(即圖9中98-105管)，經過15% SDS-PAGE分析，此產物的純度大於95%(圖10)，每立升培養液純化後得15mg天花粉蛋白純品。
實施例5天花粉蛋白N227K突變體結構基因的構建和表達。
(A)天花粉蛋白N227K基因突變體限制性片段的選擇和設計為了實現N227K突變，我們從mTCSG結構圖中(圖1)找到N227，由該基因的第679-681位鹼基即AAT編碼，只需將第681位鹼基從T變為G則AAT變為AAG，後者編碼賴氨酸(K)。另外在這個密碼子的上遊最近的酶切位點是BclI，其下遊是BstBI(圖2)，這樣我們就設計合成下述雙鏈限制性內切酶片段BclI StyI BstBI
用來取代原來的BclI/BstBI片段，由於新合成的限制性內切酶片段通過第681位鹼基的變換新引入了一個StyI限制性內切酶位點，便於對突變體N227K的基因分析鑑定。
(B)含N227K突變體基因克隆質粒的構建質粒pClTCS(圖6)轉化大腸桿菌JM110(參見文獻Yanisch-Perron，C.，et al.，Gene(1985)33，103-119)，轉化後的菌落在LB培養液中擴增後製備無甲基化腺嘌呤(或胞嘧啶)的質粒pClTCS。這樣從JM110製備的質粒pClTCS經BclI/BstBI雙酶解後，分離製備線性質粒大片段，並以1∶10和1∶20與上述新合成的BclI/BstBI限制性DNA片段連接，連接產物轉化大腸桿菌JM110，轉化子經StyI酶解證實已得到含天花粉蛋白N227K突變體基因的質粒pClTCS-N227K。
(C)含天花粉蛋白N227K突變體基因的表達和產物性能測定按實施例3(A)相同的方法將質粒pClTCS-N227K與pPLc2833重組後得到pElTCS-N227K表達質粒並轉化大腸桿菌C600(pCI857)。然後按實施例3(B)相同的方法進行基因表達。表達產物純化後，用ELISA方法測免疫活力和用小白鼠受孕後測中期妊娠引產活力。表5的數據表明天花粉蛋白N227K對天花粉蛋白IgE單克隆抗體的免疫活力有明顯降低，為天然天花粉蛋白的24%-44%，而中期妊娠引產活力基本不變(表6)。
此外，類似於實施例5可以逐步突變本發明的合成基因，直到其中123個密碼子被改變，即使這樣得到的突變體基因，其密碼子與本發明的天花粉蛋白合成基因相對應的密碼子還有50%以上相同。
表1.天花粉蛋白合成基因和天然基因的密碼子分配情況表
A.胺基酸符號 C.密碼子 N.天然基因 S.合成基因E-H.在大腸桿菌高表達體系中密碼子的分配係數表2.裝配PN段連接反應混合物中各種片段的預期長度(計算值)條帶編號 產物或中間體 鏈長(鹼基) 連接的片段數1 pGpHplpJ 268 42 pGpHpl 205 3pHplpJ 197 33 pGpH 139 2pHpl 134 2plpJ 129 24 寡核苷酸原料 ～67 1
表3.ELISA法測定基因工程產生的天花粉蛋白(GE-TCS)的免疫特異性數據
Exp.1表面抗原 20μg/孔Exp.2表面抗原 2μg/孔TCS-1中科院上海細胞生物學研究所純化的天然天花粉蛋白TCS-2武漢生物製品研究所出品的天然天花粉蛋白表4.基因工程產生的天花粉蛋白(GE-TCS)對中期妊娠小白鼠的止孕效應GE-TGS劑量 母鼠數 總胎仔數 死胎仔數+吸收點數 有效率(μg) (只) (只) (只) (%)300 3 23 22 95.7200 13 109 109 100100 10 95 95 10050 13 131 127 96.9
表5.ELISA法測天花粉蛋白突變體N227K(TCS-N227K)抗天花粉蛋白1gE單克隆抗體(TE1)和抗血清(1∶5000)的免疫活性
Exp.1表面抗原 2μg/孔Exp.2表面抗原 20μg/孔TCS-1中科院上海細胞生物學研究所純化的天然天花粉蛋白TCS-2武漢生物製品研究所出品的天然天花粉蛋白表6.天花粉蛋白突變體N227K(TCS-N227K)對中期妊娠小白鼠的止孕效應劑量 孕鼠數 胎仔總數 死胎仔數+吸收點數 有效率(μg/0.2ml) (只) (只) (只) (%)300 5 43 42 97.7100 10 95 95 10050 16 164 156 95.130 9 96 18 18.8
權利要求
1.一種在大腸桿菌中高表達的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於該基因的DNA順序是圖1中所顯示的-5～750的核苷酸，它編碼一個與天然的天花粉蛋白功能相當的醫用蛋白質。
2.如權利要求1所述的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於由這個合成基因衍生的突變體基因，與權利要求1所述的合成基因相對應的密碼子有50%以上相同。
3.如權利要求1或2所述的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於該基因及其衍生的突變體基因可插入一種質粒載體。
4.如權利要求3所述的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於所述質粒載體是pUC18或pPLc2833。
5.如權利要求1或2所述的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於該基因及其衍生的突變體基因可通過質粒載體轉化一種大腸桿菌宿主細胞。
6.如權利要求5所述的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於所述的大腸桿菌宿主細胞是JM83，C600(pCI857)或JM110。
7.如權利要求1所述的天花粉蛋白合成基因的合成方法，其特徵在於如圖3和圖4所示的全合成步驟。
8.如權利要求1所述的天花粉蛋白合成基因，其特徵在於可應用於產生天花粉蛋白及其突變體，包括如圖4和圖6所示將合成基因插入大腸桿菌質粒載體和轉化大腸桿菌宿主細胞，以及在大腸桿菌中高產率的基因表達和表達產物的純化。
全文摘要
天花粉蛋白合成基因已按大腸桿菌高表達密碼子分配係數重新設計和全合成。這個含有27個單一的限制性核酸內切酶部位的合成基因已在大腸桿菌中高表達(20mg/l)，產生了與從栝樓塊根中分離的天花粉蛋白有相同免疫活力和生物活力的蛋白質。
文檔編號C12N15/29GK1084889SQ9311243
公開日1994年4月6日 申請日期1993年5月19日 優先權日1993年5月19日
發明者陳海寶, 夏懿, 荊軍平, 蔣昆, 鮑建紹 申請人:中國科學院上海有機化學研究所