對甲型流感病毒h1亞型具有同亞型交叉中和性能的單克隆抗體的製作方法

2023-06-11 17:22:21 1

專利名稱：對甲型流感病毒h1亞型具有同亞型交叉中和性能的單克隆抗體的製作方法
對甲型流感病毒H1亞型具有同亞型交叉中和性能的單克
隆抗體總的來說，本發明涉及免疫學領域。更具體地說，本發明涉及針對甲型流感病毒(influenza virus A)Hl亞型HA(血 凝素)抗原的單克隆抗體，其對來自人的分離株和來自動物的分離株兩者都能夠識別並中 和。流感病毒能感染不同物種的動物，其中特別是若干鳥類、豬科和馬科的物種。這些 病毒中只有少數已經成功地適應人類，即感染人類，特別是其自身可以從人到人進行傳播。 允許這種適應性的主要因素與該病毒最重要的表面蛋白(血凝素)的特性相關聯。尤其是， 依據這種蛋白的抗原特性已鑑別出16個亞型(H1-H16)，只有其中三個(H1、H2和H3)已成 功地完全適應人類，是造成過去一個世紀三次流感大流行的原因。目前在人類中流通並導 致季節性流感流行的有兩種亞型-Hl亞型和H3亞型。Hl亞型(本發明的抗體所識別的目 標)出現於1918年，導致了被命名為「西班牙流感」(根據報導第一個病例的歐洲國家而 命名)的可怕大流行。最近的研究表明，負責「西班牙流感」的這種病毒是感染鳥類的禽流 感病毒，作為少數突變的結果，該病毒發展出了能夠感染人並且其自身可以從人到人進行 傳播的能力。1918年的分離株是在人類與其他動物(如豬)中發現的所有Hl亞型病毒的 共同祖先。直至1957年，每年度人類流感的流行都是由Hl亞型病毒引起的，在該年，它們 被具H2亞型血凝素的病毒所取代，後者造成了所謂的「亞洲」大流行。直到1977年，再也 沒有由Hl亞型引起的病例報告，在該年，由於仍然不完全明白的原因，在俄羅斯重新出現 了少量的Hl分離株。因此，現在，Hl亞型病毒仍在流通，並與自1967年以來在人類出現的 H3亞型病毒發生關聯。例如，歐洲2007-08流感季節(包括從2007年第40周至2008年 第16周期間)的通告證明，30%的有效分離株與Hl亞型血凝素相關(European Influenza Surveillance Scheme-Weekly Electronic Bulletin-April 28,2008)。每年的流感病毒流行對公共健康服務和與此相關的費用造成相當大的影響。僅 在美利堅合眾國，據估計，每年有超過200，000人因流感病毒的症狀住院，有約40，000人 的死亡或多或少與此直接相關(Thompson等，JAMA，2003，觀9 :179-186)。我們必須以指數 更大的數字向這些數據添加在或長或短時期不能去工作的感染者的所有病例，以及因工作 日減少而導致的不可避免的經濟損失。最近的一項工作(Molinari等，Vaccine, 2007, 25 5086-5096)估計，與每年流感流行直接相關的醫療費用為每年10. 4億美元，對此，還必須 加入另外的16. 3億美元，這是由於缺勤而導致的收入損失。如果在計算中我們再考慮其他 項目，如將與感染者的死亡相聯繫的經濟損失貨幣化，數量會上升到每年871億美元的驚 人數字。目前，面對年度流感流行，在某種程度來說唯一可用的工具是含Hl亞型和H3亞型 病毒分離株抗原(還有乙型分離株)的滅活三價疫苗，它們可能就成為引起下一個流感季 節的流行病因。基於與一些標誌地理區域的早期分離相聯繫的流行病學數據的這種類型的 預測並不總是成為正確。因此，存在不是微不足道的風險，這種風險一年又一年存在，即為 某一流感季節研製的三價疫苗相反地可能是實質上無效的。
在那種情況下，以及在新的大流行的情況下，唯一可用的預防/治療手段是求助 於兩類可用的抗病毒藥物M2蛋白抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和神經氨酸酶抑制劑 (奧賽米韋和扎那米韋)。但是，在這種情況下也一樣，已經可以預期一系列的問題，既涉 及到需要在感染的非常早期就給予抗病毒藥物，同時涉及到抗藥性病毒分離株的迅速呈現 (這種情況已經發生)。另一種有效的策略可以是依賴中和抗體製劑，它們直接針對關鍵的病毒蛋白質並 能夠識別此類蛋白質在不同的流感病毒分離株中共亭的部分。為了更好地理解基於被動給予抗體的方案的潛能，有必要簡單地提及流感病毒的 主要結構特徵。流感病毒屬於正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，其特徵是具有源自受感染 細胞細胞膜的包膜，在包膜上有約500個突起。這些突起由來自兩種重要的病毒表面蛋白 即上述的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的三聚體和四聚體組成，其也被用作甲型流感病 毒的分型。在包膜表面還發現了膜內在蛋白(M》，與血凝素和神經氨酸酶相比，該蛋白的數 量低得多，也以四聚體構成。流感病毒的進一步特徵是，在其核心存在由8條單鏈RNA片段組成的節段基因組。 基於其病毒粒子中某些蛋白質(NP和Ml)的特性，可識別三種已知類型的流感病毒甲型 (A型)、乙型(B型)和丙型(C型)。造成每年流行的病毒型是甲型病毒和乙型病毒。相 反，丙型病毒造成不太嚴重的症狀。表面蛋白的作用在病毒複製周期是至關重要。具體而言，血凝素是使病毒能夠識 別存在於一些細胞表面的唾液酸並感染這些細胞的蛋白。相反，神經氨酸酶在病毒複製周 期的末期，即在新病毒顆粒從被感染細胞釋放的期間發揮作用。它的功能是促進新形成的 病毒粒子的血凝素從產生病毒粒子的細胞表面存在的唾液酸上釋放。這兩種蛋白質發揮的 關鍵作用以及它們在病毒表面的呈現，解釋了為什麼它們代表免疫應答的主要靶標，以及 為什麼它們易於高速率突變。事實上，引起每年流行的病毒都是或多或少與往年有所不同， 因此，都能夠或多或少有效地逃逸由它們刺激所產生的免疫應答。換句話說，血凝素(主要 的)和神經氨酸酶(次要的)上點突變的逐步積累使由先前流行過程中產生的保護性抗體 基本上逐步無效。體液組分在抗流感免疫應答中發揮了主要的保護作用。抗體發揮其保護作用主要 是通過幹擾血凝素與唾液酸的結合，從而阻止病毒對細胞的感染。這樣的選擇壓力決定了 血凝素的高突變率。然而，在如此高的變異性中發現了一些不變化的胺基酸殘基，預示它們 在該蛋白質的功能中有重要作用。這些血凝素部分代表了交叉中和應答的潛在靶標。但 是，可以預見，這些區域將無法在大多數患者中誘導有效的抗體應答，因為此類靶標在免疫 沉默區域的藏匿肯定代表了對病毒非常有利的進化環節。從預防和治療角度考慮，提供能識別一種亞型中此類共同區域的抗體分子將是 極其有用的。對有風險受治療者給予此類抗體可能事實上代表了有用的預防手段，因為 它們能夠識別廣譜的在進化上彼此遠離的同一亞型病毒，從而能夠潛在地阻止屬於此種 亞型的大部分病毒，包括可能出現的獲得了從動物傳播給人類的能力的新病毒。這種免 疫類型(其在流行株表現出比前幾年有很高突變率時會失效)，被稱為同亞型抗流感免疫 (H0M0SUBTYPE ANTI-INFLUENZAIMMUNITY)。本發明現已成功地獲得具上述希望特性的單克隆抗體。
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因此，本發明的第一個方面是針對甲型流感病毒的單克隆抗體，其能夠結合多種 表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒的分離株，包括人類的分離株和動物的分離株兩者。本發明的第二方面是針對甲型流感病毒的單克隆抗體，其特徵是對Hl亞型甲型 流感病毒人類和動物分離株有中和活性。優選地，所述中和單克隆抗體識別Hl亞型甲型流 感病毒的血凝素(HA)抗原。本發明的單克隆抗體優選是人抗體或人源化抗體。當給予有風險患者時此類抗體代表了有價值的預防工具。此外，對人類患者使用人或人源化單克隆抗體有進一步的優勢，因為人抗體或人 源化抗體肯定有很好的耐受性。此外，作為對這種病毒的人類抗體應答的組份的代表，本發明的單克隆抗體構成 了用於設計創新型疫苗的關鍵因素，與目前使用的疫苗所引起的免疫力比較，所述新疫苗 能誘導對Hl亞型病毒的更加有效、更具保護和更廣範圍的免疫力。在下述的實驗章節詳細介紹了獲得本發明單克隆抗體的步驟，還例證了其結合和 中和性能。藉助實驗章節中具體描述的程序可獲得的單克隆抗體是人抗體。人源化抗體的製備可以通過任何本身已知的方法來進行，如下述文獻中描述的方 法Baca 等，1997，J. Biol. Chem, 272 :10678-84 ；或 Carter 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci, 89 42850這些目錄文獻是專供說明而非限制性的。事實上，在現有技術中已知的其它製備 人源化抗體的方法都可以用於本發明中。在實驗章節具體介紹了命名為INF49的一個克隆的獲得，所述克隆能產生Fab片 段形式的單克隆抗體，該抗體在體外能結合多種人類和動物的Hl亞型甲型流感病毒分離 株。由克隆INF49生產的單克隆抗體(命名為Fab49)代表了本發明的一個優選實施 方案，因為本發明人經實驗證明，這些抗體顯示出對多種人類和動物的Hl亞型流感病毒株 A分離株的中和活性。為簡便起見，這種與中和人類和動物的Hl亞型流感病毒株A分離株的 能力相關的免疫學特性在本文下述中有時會被稱為「對Hl亞型的同亞型交叉中和活性」。序列表顯示了本發明的Fab49的重鏈可變區胺基酸序列(SEQ IDNO 1)和輕鏈可 變區胺基酸序列(SEQ ID NO :2)。還進一步顯示了它們各自的編碼核苷酸序列，分別命名 為 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4。具體而言，實驗章節介紹了 Fab片段形式的單克隆抗體Fab49的製備。然而，應該 明白，所述單克隆抗體也可以其它形式來製備和使用，例如整個免疫球蛋白，或其它類型的 抗體片段，比如F(ab' )2片段或比Fab小的抗體片段(例如，單鏈抗體、單域抗體)，以及 與Fab具有相同免疫學特性的至少有8個胺基酸長度的多肽。可以根據Ladner等人在美國專利4，946，778中描述的方法去構建單鏈抗體，該 專利在此引作參考。單鏈抗體包含由柔性接頭相連的輕鏈和重鏈可變區。命名為單域抗 體的抗體片段甚至比單鏈抗體更小，因為它僅包括一個分離的重鏈可變區。獲得具有(至 少部分)與整個抗體同樣結合能力的單域抗體的技術，在現有技術中已有描述。Ward等在 "Binding Activities of a Repertoire of Single ImmunoglobulinVariable Domains Secreted from Escheria coli (大腸桿菌分泌的單免疫球蛋白可變區系統的結合活 性)」 (Nature 341 :644-646)中描述了獲得抗體重鏈可變區(VH單域抗體)的篩選方法，所述單域抗體與靶表位有足夠的親和力並以分離的形式與之結合。在後面的描述中，術語「抗體」將被用來指代上述所有實施方案，包括全免疫球蛋 白、Fab片段或其它類型的抗體片段、單鏈抗體、單域抗體等。本發明的單克隆抗體可以以游離的形式或與載體綴合的形式被生產和使用。載體 可以是能夠與抗體綴合併賦予其免疫原性或增加其免疫原性的任何分子或化學的或生物 學的實體。載體的非限制性例子有蛋白質[如KLH(匙孔賊血藍蛋白)、麻仁球蛋白、甲 狀腺球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)]、紅細胞如綿羊紅細胞 (SRBC)、破傷風類毒素、霍亂類毒素、多聚胺基酸如多聚(D-賴氨酸D-穀氨酸)等等。為 了促進抗體與載體的結合，抗體的C末端或N末端可被修飾，例如，插入額外的胺基酸殘基， 比如一個或多個能形成二硫鍵的半胱氨酸殘基。鑑於其性質(將在隨後的實驗章節中參考Fab49詳細顯示)，本發明的單克隆抗體 特別適合於醫療應用，尤其是用於生產針對Hl亞型甲型流感病毒感染的廣譜預防性或治 療性藥物。因此，應用本發明的單克隆抗體製備預防或治療由Hl亞型甲型流感病毒感染引 起的疾病(比如流感症狀)的藥物，屬於本發明的範疇。同樣，在本文，表述「Fab49抗體」不僅包括Fab片段，還包括可製備出抗體的任何 其他形式，例如整個免疫球蛋白、其他種類的抗體片段、單鏈抗體等。正如在實驗章節中詳細介紹的，本發明的單克隆抗體是藉助分子生物學技 術從能產生人類交叉反應單克隆抗體的EB病毒轉化人淋巴細胞為起始所獲得，因 此，其能夠識別用用幾種表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒人參照分離株感染的 MDCK (Madin-Darby狗腎)(ATCC n° CCL-34TM)細胞裂解液，所述分離株在下文被稱為 A/Puerto Rico/8/34(ATCC n° VR-1469TM) ；A/Wilson-Smith/33(ATCC n° VR-1520)； A/Malaya/302/54 (ATCC η ° VR-98)。還可使所述的抗體能夠識別用動物源性「現 場(field)」分離株(特別是豬源分離株(SWl))感染的NSK(新生豬腎MIstituto Zooprofilattico di Brescia)細胞裂解液，這藉助所表達的Hl亞型血凝素HA2片段的序 列(SEQ IDNO 5)得到證實。本發明的單克隆抗體的另一個特別有優勢的特性是其結合源自A/ California/04/2009流感病毒分離株的重組HA蛋白的能力，該分離株最近被確定為引起 所謂的「豬流感」的分離株之一，由世衛組織(WHO)官方命名為「新流感」。在後面的實驗章節介紹了採用源自A/California/04/2009分離株的重組HA蛋白 和源自A/PR/08/1934分離株的重組HA(作為陽性對照)進行的結合實驗。該實驗證明，本 發明的單克隆抗體Fab49對這兩種重組HA蛋白都能結合。所進行的實驗還表明，單克隆抗體Fab49能中和源自上述兩種流感病毒分離株的 HA蛋白偽顆粒。在後面的實驗章節描述了從患者外周血製備轉化B細胞系的具體程序。還介紹了克隆編碼本發明的Fab49抗體的重鏈和輕鏈的Fd部分的基因的程序及 其重組製備(無論是單一的肽還是Fab片段)的程序。藉助ELISA和免疫螢光證實了本發明單克隆抗體與不同的人類和動物的Hl亞型 甲型流感病毒分離株感染的細胞發生反應的能力。此外，進行了中和實驗以驗證所述抗體在體外的生物活性。在該實驗中，Fab49抗體顯示出對如上文所述的人類和動物的甲型和 Hl亞型病毒分離株的同亞型交叉中和活性。所獲得的數據表明，本發明的抗體在賦予給予了上述形式之一的受治療者對Hl 亞型甲型流感病毒產生被動免疫方面潛在有效，以及其在廣譜的預防和治療由Hl亞型甲 型流感病毒感染引起的疾病(如流感症候群)方面的有用性。因此，本發明的另一方面是藥物組合物，其包含作為活性成分的有效量的本發明 單克隆抗體和藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。有效量是指在給予了所述組合物的受治 療者體內能夠引起有利效果(例如中和Hl亞型甲型流感病毒)的量。在本文，術語「受治療者」被定義為可以給予本發明組合物的任何動物宿主，包括 人類。在本發明的藥物組合物中可用的藥學上可接受的載體或稀釋劑的非限制性例子 包括穩定劑如SPGA、碳水化合物(例如，山梨醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、 蛋白質如白蛋白或酪蛋白、含蛋白試劑如牛血清或脫脂乳，以及緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝 液)。本發明的單克隆抗體還可有益地用作體外方法中的診斷試劑，用於檢測先前從患 者獲得的生物樣品中具有相同或相似中和特性的抗Hl亞型甲型流感病毒抗體，其中該生 物樣品可以是血清、血漿、血液樣本或任何其它合適的生物學材料。「具有相同或相似中和特性的抗甲型流感病毒抗體」是指呈現與人類或動物的Hl 亞型甲型流感病毒有同亞型交叉中和活性的抗體。這些抗體可出現在下述患者(或動物) 的生物樣品中其先前曾接觸到甲型流感病毒，或者是因為治療或預防疾病或研究目的該 患者先前已經被給予本發明的單克隆抗體。因此，本發明的範疇也包括用於檢測先前從患者或動物宿主獲取的生物樣本中對 Hl亞型有同亞型交叉中和活性的抗甲型流感病毒抗體存在情況的分析方法，包括用本發明 的單克隆抗體作為特異性檢測試劑接觸所述生物樣品。該方法可以是定性或定量的。可通過例如競爭性酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來檢 測或定量有同亞型交叉中和活性的抗Hl亞型甲型流感病毒抗體。因此，包含本發明的單克 隆抗體作為特異性試劑的診斷試劑盒也屬於本發明的範疇，所述試劑盒特別設計用於檢測 或定量生物樣本(先前從患者或動物宿主獲取的)中對Hl亞型甲型流感病毒有同亞型交 叉中和活性的抗甲型流感病毒抗體的存在情況。同樣，本發明的單克隆抗體可作為特異性試劑用於檢測方法中，所述方法用於檢 測或定量在以前製備的免疫原性或疫苗組合物中、具有誘發能力的抗原表位中、在已經給 予了這種組合物的受治療者中的、具有與本發明的單克隆抗體相同或相似的中和性質(即 對Hl亞型甲型流感病毒的同亞型交叉中和活性)的抗Hl亞型甲型流感病毒抗體。預測這種方法可用於對用作疫苗或免疫原製劑的任何製劑的評估，因為能被本發 明的單克隆抗體所識別可以指示免疫原製劑和/或疫苗中存在能刺激抗體克隆產生的一 種或多種表位，其中所述抗體克隆能夠識別有益的表位，例如能誘發抗Hl亞型甲型流感病 毒的同亞型免疫的表位。最後，本發明的單克隆抗體可用於根據本身已知的方法來製備抗獨特型抗體。抗 獨特型抗體是特異性針對用於製備它們的獨特型廣譜中和抗體的抗體，因此能夠模仿它們識別的關鍵表位。 針對本發明單克隆抗體的抗獨特型抗體也因此包括在本發明的範疇內。
提供下述實驗章節純粹為了說明而非限制。實驗章節患者的詵擇挑選進入本研究的患者，以增加從中克隆交叉反應性抗流感抗體的機會，所述抗 體即能夠識別、潛在地能夠中和不同的流感病毒分離株的抗體。尤其是，據介紹，有些個體， 儘管連續暴露於流感病毒(有時是由於職業原因，如醫生、兒科醫生、在幼兒園和學校工作 的人們)，並不會患上這種疾病。由此，他們被認為是用於製備人類單克隆抗體的最佳人選。 具體地講，遵循下述入選標準-年齡在25至55歲之間；-最近的病理醫療史在本研究前十年內是臨床流感症候群陰性；-對引起本研究前五年期間年度流行的Hmi亞型病毒分離株的抗體效價高於 1 1000 ；-抗兩種人類參照HlNl亞型甲型病毒分離株(A/PuertoRico/8/34 ；A/ Malaya/302/54)的中和效價(IC50 >= 1 20)能被檢測到；-沒有事先接種抗流感疫苗；-應允接種抗流感疫苗。接種疫苗時和在接種後約3周，從每個患者抽取約20ml血液到肝素處理試管中。參照病毒分離株的培養以在改良Eagle培養基(MEM)(購自GIBC0)中傳種的MDCK細胞(Madin-Darby狗 腎)細胞(ATCC no.CCL-34TM)作為所述細胞系，所述培養基中添加10%滅活(在56°C 處理30分鐘)的胎牛血清(FBS)(購自EuroClone)、50 μ g/ml青黴素、100 μ g/ml鏈黴素 (購自GIBC0)和2mML-穀氨醯胺(購自EuroClone)。關於現場豬分離株SWl (以附在本專 利申請的HA2區序列明確表徵)，用NSK(新生豬腎)細胞(IstitutoZooprofilattico di Brescia)來代替，對其進行相似的處理。這些細胞置於37°C、5% CO2氛圍下培養，並每周兩 次以1 3比率傳代。對於本專利申請中描述的實驗，採用以下Hmi亞型流感病毒分離株 A/Puerto Rico/8/34 分離株(ATCC no. VR-1469TM)、A/Wilson_Smith/33 分離株(ATCC no. VR-1520)和 A/Malaya/302/M 分離株(ATCC no. VR-98)。對於 Hmi 亞型，也使用豬 源分離株(SWl)，根據血凝素HA2部分的序列(SEQ ID NO 5)進行表徵。還使用了其他三種 參照病毒分離株，兩種屬於甲型H3N2亞型(A/PortChalmers/ 1/73-ATCC no. VR-810和A/ Aichi/2/68-ATCC no. VR-547)，一種屬於乙型(B/Lee/40-ATCC no. VR-101)。作為培養 病毒的培養基，使用添加了 1 μ g/ml無血清胰蛋白酶(購自SIGMA)的MEM。病毒原液以胞 外病毒形式從培養液上清獲得。簡言之，在感染細胞後，每天觀察單層以監測是否出現細胞 病變效應。通常在感染後4天，收集上清液，以1000RCF(相對離心力)離心10分鐘以消除 細胞碎片，並用0.22 μ m過濾器(購自MILLIP0RE)過濾。然後，分裝上清並保存於_80°C， 作為無細胞病毒。從外周血B淋巴細胞篩選單克隆抗流感病毒抗體來自患者的單克隆抗體的生產是通過藉助EB病毒(EBV)感染的轉化方法來進行的，該方法先前由Cole等介紹(1984Cancer Research22 :2750-2753)。用ELISA評估從不同 克隆得到的上清中抗體的存在情況。選擇能夠在上清中產生下述IgG抗體的克隆以供隨後 的表徵，所述抗體在針對用上述三種人分離株和Hmi亞型豬源分離株SWl感染的細胞裂解 液的ELISA中能反應，但在針對用所述兩種H3N2亞型分離株和所述B分離株感染的細胞裂 解液的ELISA中不能反應。具體而言，用上述分離株以高感染複數感染MDCK細胞。感染後 大約48小時，將細胞從燒瓶中移出，並在PBS中漂洗兩次。然後，將細胞沉澱懸浮於300 μ 1 裂解溶液(IOOmM NaCl, IOOmM Tris ρΗ 8和0. 5% Triton-X)中，並在冰中放置20分鐘。 在IOOOOg離心5分鐘去除細胞碎片，將上清保存於-20°C作為蛋白提取物。關於對照抗原 的製備，以同樣的方式處理非感染細胞。使用BCA 蛋白檢測試劑盒(購自Pierce)以復份 測定上清液蛋白濃度。簡單地說，樣品中蛋白質含量參照標準曲線來確定，所述標準曲線通 過一系列已知稀釋濃度的牛血清白蛋白(BSA)獲得。用分光光度計在MOnm波長處測量每 個樣品的吸光度。然後用這樣得到的裂解液(每孔300ng)包被ELISA板(C0STAR)，將板在 4°C過夜孵育。次日，用蒸餾水洗滌該板，並用PBS/1% BSA(購自Sigma)在37°C封閉45分 鍾。然後，從每個克隆取40μ1上清液加到每一孔中，在37°C孵育1小時。用PBS/0.5%吐 溫-20 (Sigma)進行 5 次洗板(WASHER ETI-SYSTEM，DiaSorin)後，在每一孔中加入 40 μ 1 過氧化物酶綴合的抗人Fc(以1 4000於PBS/1%牛血清白蛋白中，購自Sigma)，將板置 於37°C孵育1小時。用PBS/0. 5%吐溫-20再進行5次洗板後，在每一孔中加入40 μ 1過 氧化物酶底物TMB (Pierce)。大約15分鐘後，加入40 μ 1 H2SO4阻斷酶的活性，用分光光度 計在450nm處測量信號。具體地講，一個克隆(命名為cINF49)被證明能夠產生下述抗體， 該抗體能以特異性方式識別從不同Hmi亞型分離株(包括所述動物分離株)感染的細胞 獲得的所有裂解液。相反，在用所述兩種H3N2亞型病毒和所述B分離株感染的培養物中沒 有檢測到信號。從克隆CINF49製備Fab片段將Fab49鏈編碼基因克隆到原核表達載體。這可以避免由於抗體生產細胞克隆的 不穩定性所引起的問題，更好地從分子觀點表徵編碼基因，以便可自由獲得確實是單克隆 的分子以及增加該抗體本身的數量。從培養的CINF49克隆中提取信使RNA(mRNA)，按本身已知的方法用寡聚dT進行反 轉錄。然後按已描述方法擴增編碼輕鏈和Fd片段(即重鏈可變區和Fab片段內恆定區的部 分)的 cDNA(CSH Press, Phage display manual，D. R. Burton 編輯，ρ· Al. 6)。然後將這樣 得到的cDNA克隆到本身已知的表達載體中，所述表達載體名為RBCaf (Burioni等，J. Imm. Meth, 1988)。簡而言之，在37°C用限制性酶XhoI和SpeI (Roche)消化編碼重鏈Fd部分的 基因(擴增的DNA) 1.5小時，隨後插入到載體上用於重鏈的克隆位點(也用同樣的酶進行 消化)。相反，用酶McI和^CbaI(Roche)消化輕鏈(擴增的DNA)，並克隆到經同樣消化的 載體中。用這樣得到的重組構建體電轉化大腸桿菌菌株XLlBlue (在甘油中用冷洗滌製備 感受態)，使用0. 2cm轉化池(cuvette)按照標準化方案操作(電壓2500V ；電容25 μ F ； 電阻200 Ω )。對輕鏈可變區部分和重鏈可變區部分的DNA序列進行平行分析。所述序列 提供在序列表中。突變模式的分子分析顯示了起因於抗原誘導的體細胞突變過程的圖片。ELISA評估通過克隆到RBCaf中獲得的Fab49
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使用對培養物進行熱休克而獲得的裂解液，通過ELISA分析了 40個用Fab49構建 體轉化的重組細菌克隆。具體地講，將用所述構建體轉化的細菌克隆接種於IOml SB培養 基(含有氨苄青黴素和四環素，其濃度分別為50μ g/ml和10μ g/ml)，在37°C振蕩培養直 至達到0.D.600 = 1。隨後，加入特異性誘導劑(IPTG，異丙基-0-0-硫代半乳糖苷)至終 濃度為ImM，培養物在30°C振蕩培養過夜。利用熱休克(3次冷凍/解凍循環，分別在-80°C 和37°C )溶解這些細胞，然後離心以從含Fab上清中分離細胞碎片。用ELISA法檢測所獲 得的可溶性Fab。用從上述病毒分離株感染的細胞獲得的裂解液包被96孔微孔板(購自 Nunc) 0用從未感染細胞獲得的裂解液作為陰性對照。然後，讓包被了 300ng所得裂解液 的ELISA板在4°C過夜。第二天，去除未結合的抗原後，用PBS洗板5次，用含3%白蛋白的 PBS封閉非特異性結合位點，在37°C封閉1小時。去除封閉液後，向其中加入經如上所述 處理、含有所述可溶性Fab的細胞培養物的上清液。緊接是在37°C 2小時的孵育步驟。用 PBS/0. 5%吐溫-20進行10次洗板循環後，向其中加入40μ 1(1 700稀釋度，於PBS/1 % BSA中)辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人Fab免疫球蛋白多克隆製劑(Sigma)。在37°C孵 育1小時和再進行10次清洗系列後，向各孔中加入底物(0PD-鄰苯二胺)。然後，將板在黑 暗中於室溫下孵育30分鐘。用IN硫酸淬滅反應，用分光光度計在450nm處讀數評估光密 度。所有檢測的克隆都顯示對從用所述Hmi亞型病毒感染的細胞獲得的每一裂解液有特 異性反應。於是，篩選出一個用含Fab49的輕鏈和重鏈Fd片段基因的表達載體轉化的細菌 克隆。所篩選出的細菌克隆被命名為INF49。純化Fab49和用ELISA評估感染細胞裂解液的Fab49用含蛋白G( 2mg/ml)的瓊脂糖凝膠樹脂柱免疫親和純化由克隆INF49產生的 Fab (從此處開始無差別地稱為「克隆」或「Fab」 )，在所述蛋白G上共價連接了能夠結合人 Fab的山羊抗體多克隆製劑(PIERCE，Illinois)。簡言之，將克隆INF49的一個菌落接種 於IOml SB培養基(含有氨苄青黴素和四環素，濃度分別為50 μ g/ml和10 μ g/ml)。將在 37°C生長過夜的培養物繼代接種到裝有500ml SB (加有與之前相同濃度的抗生素)的燒瓶 中。細胞隨後用ImM IPTG誘導，然後讓細胞在30°C振蕩過夜。將培養物在5000rpm離心 25分鐘，重新懸浮在PBS中的沉澱用超聲波處理。有必要在ISOOOrpm再次離心25分鐘以 去除細胞碎片。過濾上清液，然後慢慢地通過上述瓊脂糖柱。此後，用10倍體積量的PBS 洗滌樹脂，最後用酸性溶液將結合的Fab洗脫出來(洗脫緩衝液-H20/HC1 pH 2.2)。用適 當的溶液(1M Tris pH 9)中和所收集的各組分，通過超濾(Centricor^Millipore)進行濃 縮。取一等分的純化Fab在12%聚丙烯醯胺/十二烷基硫酸鈉凝膠(SDS-PAGE)上電泳以 評估其純度。最後，如所述用ELISA法測定系列稀釋的純化Fab。在每塊板中，用針對HCV E2糖蛋白的單克隆Fab作為陰性對照。本實驗結果證實了先前用細菌裂解液所得的結果， 確證所述克隆對Hmi亞型病毒感染細胞具有特異性反應。通過克隆到RBCaf對獲得的Fab49進行免疫螢光評估為了證實用ELISA法取得的數據，還採用免疫螢光檢測分析了 Fab49。簡單地說， 將來自用所有上述參照病毒感染的培養物的細胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗兩次後，用血 細胞計數器在顯微鏡下計數。因此，通過在細胞離心機(Cyt0Spin4，購自Siandon Southern Products)於90g離心3分鐘後，將細胞懸液用於製片。如此製備的載玻片，每一片載有細 胞總數為2X105。用未受感染的細胞按同樣方法製備對照載玻片。然後，細胞於室溫下用甲醇-丙酮溶液(在-20°C的溫度下使用)固定和透化10分鐘。用PBS洗滌3次後，在潮 溼箱於37°C用Fab49(100yg/ml)孵育細胞30分鐘，隨後用PBS洗滌三次。然後，細胞在潮 溼箱於黑暗中37°C與螢光異硫氰酸綴合的山羊Fab (Sigma)(以1 200稀釋於Evans Blue 中)孵育30分鐘。在螢光顯微鏡(Olympus)下檢查該載玻片。特異性針對流感病毒Ml蛋 白的市售小鼠單克隆抗體(Argene)被用作陽性對照。針對C型肝炎病毒E2糖蛋白的抗體 (e509 ；Burioni等，!fepatology，1998)被用作陰性對照。通過免疫螢光法，Fab49顯示對人 類Hmi亞型分離株感染的所有細胞呈特異性反應，所述分離株是A/Puerto Rico/8/34分 離株、A/ffilson-Smith/33分離株和A/Malaya/302/M分離株。使用被本研究所用的豬分 離株SWl感染的細胞也得到類似的結果。所顯示的螢光模式顯然是細胞質型模式。相反， 在未受感染的細胞、用H3N2亞型病毒感染的細胞和用乙型分離株或用陰性對照抗體感染 的細胞中未觀察到螢光。中和試騎為了表徵所選擇克隆的體外生物學活性，為本研究中使用的一些參考病毒分離株 設計了中和試驗。簡言之，將MDCK細胞(在豬分離株SWl的情況下用NSK)接種於96孔板 中的MEM-10% FBS(2xl04細胞/孔)。在維持培養液(含2% FBS的MEM)中製備病毒原液 (如上所述獲得)的系列稀釋液(從KT1到10_8)。每個稀釋度重複6次。當培養的細胞發 生融合時，移除生長培養基，向每孔分別加入100 μ 1每一病毒稀釋液。經過37°C 1小時，除 去接種物，向每孔加入200 μ 1含有lug/ml胰蛋白酶的MEM培養基。病毒滴度，用TCID5tl (感 染50%細胞培養物的劑量)表示，採用Reed-Muench公式計算
Trm,n>50% 的感染力—50%
TCID5° = >50%的感染力—的感染力基於所獲得的數據，對病毒懸液進行稀釋，使得在中和實驗中使用約為0. 01的感 染複數(Μ. 0. I.)(每100個細胞1個病毒粒子)。在實際的中和試驗中，細胞接種於M孔 板，每孔含有滅菌載玻片。中和實驗是在80% -90%融合細胞時進行，即向其中接種後約 48小時。然後製備純化Fab49的稀釋液，以達到最終濃度為1 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml 和20 μ g/ml。製備相應稀釋度的e509抗-HCV抗體，作為陰性對照。將不同濃度的Fab與 等體積的稀釋病毒懸液(M.0. I. :0.01)於37°C共孵育1小時。隨後，將250 μ 1病毒Fab 混合液加入到含有細胞的孔中。在病毒原液中只加入培養液，得到該感染的陽性對照。將 該板在37°C孵育1小時，以使未經中和的病毒吸附。然後，移除接種物，並用PBS洗細胞兩 次。向每孔分別加入含1 μ g/ml胰蛋白酶的無血清培養基1.5ml。在37°C孵育6小時後， 用PBS洗滌細胞單層，用冷甲醇-丙酮溶液(1 2比率，在-20°C存儲)在室溫下固定10 分鐘。洗滌固定的細胞，與250 μ 1市售單克隆抗Ml抗體(Argene)於潮溼箱中在37°C孵育 30分鐘。用PBS洗滌細胞，最後與螢光綴合的山羊抗小鼠抗體(稀釋於Evansblue中)於 潮溼箱中黑暗下37°C孵育30分鐘。經過三次PBS洗滌後，最後在螢光顯微鏡下檢查載玻 片。通過計數單陽性細胞，並計算與僅感染了病毒的陽性對照比較受感染細胞數下降的百 分比，確定Fab49的中和活性。對用於本中和試驗的每一分離株在三個獨立時段進行了中 和實驗(見

圖1-3)。在每個實驗中，不同稀釋度的Fab49被重複三次，所述感染的陰性對照 ((Fab e509抗E2/HCV)和陽性對照(病毒和無Fab的培養基)也是同樣進行的。
由克隆INF49產生的Fab表現出對人類和動物Hmi亞型甲型流感病毒分離株的 同型交叉中和活性。相反，沒有檢測到本研究中使用的兩個H3N2亞型病毒和乙型病毒的感 染能力的降低，證實了所觀察到的對Hmi亞型的同亞型中和活性的特異性。尤其是，由克 隆INF49產生的Fab (稱為Fab49)表現出對所試驗的每一 Hmi亞型分離株的IC5tl (對試驗 病毒分離株的感染抑制50%時的Fab濃度)都低於5 μ g/ml,即通過體外給藥所述分子很 容易獲得的濃度，即使在不考慮將Fab轉換為整個免疫球蛋白形式(包括在本發明範疇內 的可能藥物製劑中的一種)時觀察到的中和生物學活性的通常大大提高的情況下也是如 此。圖1至3總結了由克隆INF49產生的Fab 49在不同中和時段對本研究中使用的 各種Hmi亞型病毒流感分離株獲得的結果。具體地講，圖1圖示說明了不同濃度Fab 49對病毒A/PuertoRico/8/34的中和百 分比。用人類e509抗-HCV Fab獲得的結果作為陰性對照報告。圖2圖示說明了不同濃度!^ab 49對病毒A/Wilson-Smith/33分離株的中和百分 比。用人類e509抗-HCV Fab獲得的結果作為陰性對照報告。圖3說明了不同濃度Fab 49對用於本文的現場豬分離株SWl的中和百分比。用 人類e509抗-HCV Fab獲得結果作為陰性對照報告。MFab49 iPA丨的杭原的表ffi 來自感染細胞,的IM勒夜的蛋白質印跡將如前描述所製備的用A/Puerto Rico/8/34分離株感染的細胞裂解液10μ g，在 自然條件下於10%聚丙烯醯胺凝膠上電泳。為此，樣品在適當的冷藏箱(BIORAD)中於100V 電泳1小時。此後，將凝膠從電泳裝置中移出，在轉移緩衝液(Tris鹼3g，甘氨酸14.41g， dH20 800ml，甲醇200ml)中孵育10分鐘以消除任何去垢劑殘留物。然後，於30V和90mA過 夜轉移到硝酸纖維素膜(Hybond-ECL ；AmershamBiosciences)上。用溶解在IX PBS的5% 奶粉封閉膜1小時，其後，用IX PBS-0. 吐溫洗膜三次。在每次洗膜時，將膜留在擺動平 臺上搖晃10分鐘。此後，以5 μ g/ml的濃度加入不同的Fab (稀釋在含5%奶粉的PBS中)。 除Fab49外，加入以下對照作為陰性對照的e509、市售小鼠抗-HA整體IgGl (C0VANCE)、 市售小鼠抗-Ml整體IgGl (ARGENE)、小鼠抗-M2整體IgGl (ABCAM)、人血清(1 200稀 釋)。每一抗體在室溫振搖1小時。此後，再次如前所述用PBS洗膜。然後，加入與ELISA 試驗中所描述的相同的二級小鼠抗體(1 1000)或人抗體(1 2000)，這取決於待檢測 抗體的來源。為了檢測信號，以1 1的比例混合兩種底物(SuperSignal Wfest Pico ChemiIuminescentSubstrate Pierce)來製備工作液，需特別小心地不要將其暴露於光源。 用工作液孵育硝酸纖維素膜5分鐘，然後取出膜，並安裝在HyperCassette (AMERSHAM)。其 在暗房經必要的曝光時間後就顯影在柯達膠捲上。所描述的實驗在兩個不同時段進行，在 每一階段，與Fab49孵育的膜部分都顯示出存在一條分子量略小於SOkDa的帶，與病毒血凝 素(HAO)的未成熟形式的分子量一致。同一條帶也顯示在用抗血凝素對照抗體孵育的條 上，證實了這一點。在與人血清孵育的膜部分也檢測到類似條帶，比其它帶更強烈。本實驗 結果表明，該抗體針對流感病毒的血凝素，完全與中和數據相一致，因為已知血凝素是體液 中和應答的主要靶標。來自甲型流感亞型(HlNl)(豬流感)的HA的結合和中和實驗從受感染的MDCK細胞的上清分別擴增流感病毒A/PR/08/1934和A/California/04/2009 的 HA 蛋白質，或在體外合成(GenART，Ragensburg, Germany)所述 HA 蛋白質，並克隆到pcDNA3. 1表達載體(Invitrogen)中，從而獲得一種HlHA (A/PR/08/1934) 構建體和一種 H1HA(A/California/04/2009)構建體。上述兩個分離株的HA蛋白的cDNA序列和胺基酸序列顯示在序列表中，分別 為SEQ ID NO :6 (來自 A/PR/08/1934 的 HA 蛋白的 cDNA 序列)，SEQ ID NO :7 (來自 A/ PR/08/1934 的 HA 蛋白的胺基酸序列)，SEQ ID NO :8 (來自 A/California/04/2009 的 HA 蛋白的cDNA序列)和SEQ ID NO :9 (來自A/California/04/2009的HA蛋白的胺基酸序 列)。用3 μ g 含 HlHA(A/PR/08/1934)構建體或 HlHA(A/California/04/2009)構建 體的重組載體pcDNA3. 1轉染人類腎上皮(HEK093T細胞。離心和固定後，轉染細胞與 Fab49(10yg/ml)共孵育。進一步洗滌後，細胞與FITC綴合的人抗-Fab單克隆抗體共孵 育，用 FACS 分析。根據 Perotti 等(J Virology, 2008Jan ；82 (2) :1047-52)的描述對數據 進行分析。實驗表明，Fab49能識別用兩種重組載體的任一種所轉染的細胞。對於中和試驗，由細胞產生逆轉錄病毒載體，所述細胞被FuGene 6 (Roche)和以下質粒共轉染加有3yg Hl HA (A/PR/08/1934)構建體或HlHA (A/ California/04/2009)構建體的 Luc 系統(5 μ g pCMV Δ R8. 2 禾口 5· 5μ g pHR，CMV_Luc)，所述 逆轉錄病毒載體經過修飾以便在其衣殼周(pericapsid)表達流感HA蛋白(偽-類型)，包 括報告基因Luc。轉染後48小時收集上清，使用0. 45 μ m低蛋白結合濾器過濾，立即使用或 冷凍在_80°C。在和MDCK細胞上測量所述HA偽類型的滴度。簡要地講，在用100 μ 1 不同稀釋度的慢病毒LucHA偽類型載體(HA-Luc)感染細胞48小時後，根據生產商的指示， 用Luc試驗細胞裂解緩衝液(螢光素酶分析試劑，Promega)裂解96孔板中的細胞。偽類 型的滴度已表示為相對發光單位(RLU/ml)。用基於流感偽粒子的中和試驗來測試Fab49的中和活性。該方案顯示，Fab49對 用這兩種Hmi亞型分離株(A/PR/08/1934和HlHA (A/Califomia/04/2009)產生的所有流 感病毒偽顆粒皆具有強中和活性，其[IC50]為大約2yg/ml。
權利要求
1.針對甲型流感病毒的單克隆抗體，其特徵在於它能結合多種表達Hl亞型血凝素的 甲型流感病毒分離株。
2.權利要求1的單克隆抗體，其特徵在於它對多種表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒 分離株有中和活性。
3.權利要求1或2的單克隆抗體，其能夠識別作為抗原的、來自多種表達Hl亞型血凝 素的甲型流感病毒分離株的血凝素。
4.權利要求1至3中任一項的單克隆抗體，其中，所述多種表達Hl亞型血凝素的甲型 流感病毒分離株包括至少一種人源分離株和一種動物源分離株。
5.權利要求1至4中任一項的單克隆抗體，其中，所述多種表達Hl亞型血凝素的甲 型流感病毒分離株至少包括下述分離株A/PuertoRico/8/34、A/ffilson-Smith/33和A/ Malaya/302/54。
6.權利要求1至4中任一項的單克隆抗體，其中，所述多種表達Hl亞型血凝素的甲 型流感病毒分離株至少包括下述分離株A/PuertoRico/8/34、A/Wilson-Smith/33、A/ Malaya/302/54 和 A/California/04/2009。
7.權利要求1至6中任一項的單克隆抗體，其包括至少一個重鏈可變區和一個輕鏈可 變區，所述重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ IDNO :1，所述輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO :2。
8.權利要求7的單克隆抗體，其包括至少一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區，所述重 鏈可變區由核苷酸序列SEQ ID NO :3所編碼，所述輕鏈可變區由核苷酸序列SEQ ID NO 4 所編碼。
9.權利要求1至8中任一項的單克隆抗體，其選自整個免疫球蛋白和免疫球蛋白片 段，後者包括至少一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區。
10.權利要求9的單克隆抗體，其中，所述免疫球蛋白片段選自Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段、Fv片段、單鏈抗體(scFv)。
11.權利要求1至10中任一項的單克隆抗體，其是人抗體或人源化抗體。
12.多肽，其選自SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
13.權利要求12的分離的多肽，其對多種表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒分離株有 中和活性。
14.抗獨特型抗體，其特異性地針對權利要求1至11中任一項的單克隆抗體的獨特型。
15.分離的核苷酸序列，其選自SEQID NO :3和SEQ ID NO :4。
16.表達載體，其包含核苷酸序列SEQID NO :3，或核苷酸序列SEQ ID N0:4，或核苷 酸序歹丨J SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4兩者。
17.宿主細胞，其已被權利要求16的表達載體所轉化。
18.藥物組合物，其包括有效量的權利要求1至14中任一項的至少一種抗體或一種多 肽，以及藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。
19.權利要求1至14中任一項的抗體或多肽，其用作針對由表達Hl亞型血凝素的甲型 流感病毒感染所直接或間接引起的病理的預防或治療藥物。
20.權利要求1至14中任一項的抗體或多肽在製備針對由表達Hl亞型血凝素的甲型 流感病毒感染所引起的病理的預防或治療藥物中的應用。
21.權利要求20的應用，其中，由表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒的感染引起的所 述病理是流感綜合症。
22.權利要求21的應用，其中，所述病理由也稱為豬流感病毒或新流感病毒的Hmi甲 型流感病毒的感染引起。
23.分析方法，其用於在取自患者的生物樣本中檢測抗流感病毒抗體的存在情況，其中 所述抗流感病毒抗體對表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒有同亞型交叉中和特性，所述 方法包括用權利要求1至11中任一項的單克隆抗體作為特異性檢測試劑去接觸所述生物 樣品。
24.分析方法，其用於在免疫原性或疫苗組合物中檢測表位的存在情況，其中所述表位 來自表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒，其能夠在給予了所述組合物的受治療者中，誘發 對表達Hl亞型血凝素的甲型流感病毒有同亞型交叉中和特性的抗甲型流感病毒抗體，所 述方法包括用權利要求1至11中任一項的單克隆抗體作為特異性檢測試劑去接觸所述組 合物。
25.試劑盒，其包括權利要求1至11中任一項的單克隆抗體作為特異性試劑，用於在取 自患者的生物樣本中或免疫原性或疫苗組合物中檢測或定量對表達Hl亞型血凝素的甲型 流感病毒有同亞型交叉中和特性的抗甲型流感病毒抗體。
全文摘要
描述了針對甲型流感病毒的單克隆抗體，其能夠結合表達H1亞型血凝素的甲型流感病毒的人類分離株和動物分離株。優選的實施方案是命名為Fab49的抗體，其顯示出針對多種表達H1亞型血凝素的甲型流感病毒分離株(包括動物源性分離株)的中和活性。還介紹了針對本發明單克隆抗體的抗獨特型抗體、包含本發明單克隆抗體的免疫原性或疫苗組合物、以及本發明單克隆抗體在治療、預防和診斷方面的應用。本發明的單克隆抗體也可以被用於測試用作疫苗的抗體製劑。
文檔編號C07K16/10GK102124028SQ200980130479
公開日2011年7月13日 申請日期2009年5月27日 優先權日2008年5月27日
發明者M·克萊門蒂, R·布裡奧尼 申請人:波莫納·裡切爾卡有限公司