單體衣康酸的一種製備方法
2023-06-11 16:37:46
單體衣康酸的一種製備方法
【專利摘要】本發明公開了單體衣康酸的一種製備方法，其具體步驟如下：以土麴黴(Aspergillus?terreus)ZS01為出發菌株，微波誘變獲得高產衣康酸菌株，採用氣升式發酵罐發酵，過濾發酵液，經陰離子交換，真空濃縮，乾燥，得到單體衣康酸，含量＝99.50％。本方法的衣康酸產酸達到100g/L以上，提高了衣康酸產率，減少了設備投資，節能效果明顯，降低了生產成本，適用於大規模工業化生產。
【專利說明】單體衣康酸的一種製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物【技術領域】，提供了一種單體衣康酸的製備方法。
【背景技術】
[0002]衣康酸(Itaconic acid)又名亞甲基丁二酸、亞甲基琥拍酸或分解烏頭酸,是一種不飽和的二元有機酸。常溫下為白色晶體，無毒，在酸性、中性和弱鹼性常溫條件下其性質穩定，但在強鹼性條件下，其3種異構體可以相互轉化，易溶於水、乙醇、丙酮，微溶於氯仿、苯和乙醚，有特殊的氣味，在真空下能升華。
[0003]衣康酸及其酯類是製造合成樹脂、合成纖維、塑料、橡膠、離子交換樹脂、表面活性劑和高分子螯合劑等的良好添加劑和單體原料。它作為交聯劑和乳化劑，含量在1%~5%時，生產的苯乙烯-丁二烯共聚物是質輕、易塑、絕緣、防水、抗蝕性能均好的塑料和塗料。用玻璃纖維填充則是一種高強度玻璃鋼，可用於製造車，船和飛機的外殼及各種容器。含衣康酸的丙烯酸乳膠可以作為非織造纖維的粘合劑。含衣康酸單體的聚氯乙烯顯示對紙張，賽璐玢和聚對苯二酸乙二醇薄膜的粘著性增強。聚丙烯腈纖維中含少量的衣康酸，就能大大改善其染色性能，使著色加深。加入多價金屬氧化物(如鋅和鎂的矽鋁酸鹽或氧化物)交聯的衣康酸-丙烯酸製成的牙科粘合劑具有良好的抗壓性能和粘結強度，並有很好的生理適應性。衣康酸聚合物有特殊光澤，透明，適合於製造人造寶石和特種透鏡，以及防水性能良好的抗化學劑和塗料等。衣康酸和丙烯酸的聚合物是一種高分子螯合物，用於作為水處理中的除垢劑，對防止鹼性鈣，鎂垢的形成特別有效。加到海水蒸發脫鹽體系中，有效成分為0.5~10mg/kg時就能有效的抑制水垢在蒸發器表面形成與附著。由衣康酸與芳香二胺生產的吡咯烷酮衍生物是潤滑油的增稠劑，與其他各種胺生成的吡咯烷酮衍生物可用於洗滌劑、醫藥、除草劑之中。隨著科學技術的發展和各個行業之間的交叉滲透，衣康酸的應用領域將會越來越多。
[0004]衣康酸自然界存在 較少，最早是由Baup等人於1836年在蒸餾分解檸檬酸時發現的。1929年，日本學者木下廣野首次發現了可分泌衣康酸的微生物，並命名為衣康酸麴黴(Asp.1taconicus)。Raistrick在研究黴菌代謝產物時,發現土麴黴(Asp.terreus)也能分泌衣康酸，由此揭開了微生物發酵法生產衣康酸的研究歷史。
[0005]衣康酸的生產方法主要有發酵法和化學合成法兩種。化學合成法以原料的來源可以分為農產品和石油化工產品兩種方法，農產品原料主要有檸檬酸、異檸檬酸、烏頭酸及其酸酐等，石油化工產品原料主要有丁二酸酐、丁二酸二甲酯或丁二酸酯等。發酵法是目前工業上生產衣康酸的主要方法，國內外大多數生產廠家都採用這種方法來生產衣康酸。衣康酸的工業生產菌種主要是衣康酸麴黴(Asp.1taconicus)和土麴黴(Asp.terreus)。所用的原料主要有葡萄糖、蔗糖以及澱粉水解糖、糖蜜等。發酵工藝主要有表面發酵工藝、深層發酵工藝以及固定化細胞生產工藝等。衣康酸表面發酵工藝具有設備簡單，投資少，上馬快，操作技術簡單，能耗低以及原料粗放等優點，不足之處是設備佔地面積大，勞動強度高，增大產量有困難，目前此方法在衣康酸的生產中已經很少使用。深層發酵工藝是現行工業上最流行、最經濟的衣康酸生產方法，整個工藝過程的連續性強，自動化程度高，產品成本低。近幾年，固定化全細胞生產衣康酸的研究比較活躍，使用的載體多為聚丙烯醯胺凝膠，利用包埋法固定衣康酸生產菌的全細胞，目前存在的問題是固定化細胞製備技術不過關，產率太低以及生產速度慢等，還有待於進一步的研究開發。因此，發酵技術仍然是衣康酸生產的研究點。
[0006]採用發酵法生產單體衣康酸，菌種保存過程中由於經過多次傳代，衣康酸的產量都有不同程度降低，同時許多學者試圖通過提高衣康酸的產酸率來降低衣康酸生產成本，例如採用固定化技術，但由於衣康酸的發酵與供氧關係甚密，採用固定化技術後，無論是發酵產酸，還是轉化率均難以與以游離細胞的方式進行的工業化生產水平相比。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是要尋找一種誘變方法使菌株具有較高產量，同時，採用新的生化反應器代替機械攪拌罐，以提高衣康酸產酸率。
[0008]本發明的整體技術構思是:以土麴黴為出發菌株，微波誘變獲得高產衣康酸菌株，採用氣升式發酵罐發酵，分離純化單體衣康酸，其特徵在於具體包括以下步驟:
[0009]I)微波誘變
[0010]土麴黴ZSOl出發菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無菌氯化鈉洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，製備單孢子懸液。微波照射15s，將處理過的孢子懸液進行梯度稀釋，塗布於平板。挑平板上透明圈大的單圈落，35°C，上搖瓶發酵72h，獲得衣康酸高產菌株，產酸91.3g/L ；
[0011]2)種子培養
[0012]取一環經活化的高產菌種，接種於500ml三角瓶中，於35°C 200r/min往復搖床上培養2天；
[0013]3)氣升式發酵罐發酵
[0014]以10%接種量轉接至裝有發酵培養基的氣升式發酵罐中，通風量1.5vvm,35°C,發酵3天，產酸103.8g/L ；
[0015]4)紗布過濾
[0016]用潔淨紗布過濾除去衣康酸發酵液中的菌絲體；
[0017]5)活性炭脫色
[0018]添加I~2 %的活性炭，吸附脫色Ih ；
[0019]6)過濾
[0020]將經脫色處理的發酵液泵入過濾器中，去除活性炭及其它不溶物；
[0021]7)離子交換樹脂
[0022]用溼法將處理好的D311陰離子交換樹脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNa0H溶液，流速為2Bv/h (Bv表示樹脂床體積)，時間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發酵液，上柱流速為4.0mL/min,最佳洗脫條件為以2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑，洗脫流速為6.0mL/min，其回收率達86%以上；
[0023]8)濃縮
[0024]洗脫液於真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；[0025]9)真空乾燥
[0026]真空度低至0.08Mpa，升溫至50°C乾燥時間lh，得到單體衣康酸，含量=99.50%。
[0027]本發明提供的上述一種單體衣康酸的製備方法，其特點在於:
[0028]I)採用微波誘變獲得高產菌株
[0029]微波在生物學上主要用於殺菌、刺激植物種子發芽生長。隨著人們對微波的生物學效應及微生物特點認識的深入，微波在工業微生物誘變育種中也應用得越來越廣泛，與紫外線、離子注入、抗癌藥物、染料等方法處理菌種相比較，微波處理法具有操作簡單、費用低、安全性高、對環境汙染小、正變率較高等特點。本項目採用微波育種方法得到高產菌株，可有效提高衣康酸的產量。
[0030]2)採用氣升式發酵罐發酵衣康酸
[0031]發酵採用氣升式發酵罐，該設備最主要的特徵是以靜態攪拌裝置代替了傳統的動態攪拌裝置，並結合了氣升原理，因而對發酵工藝的改善具有下列特點:
[0032]a、與機械攪拌式發酵罐相比節電70% _80%，能耗成本降低。
[0033]b、本設備具有工作噪音小，裝料係數高，基本不用維修等特點，設備投資比攪拌罐降低20%左右。
[0034]C、傳熱和傳氧效率高，可滿足好氧性微生物的發酵生產。研究適合衣康酸發酵的通風比,可提高衣康酸產酸18%。
[0035]3)採用陰離子交換樹脂法提取衣康酸
[0036]對於含雜質較多的發酵液，採用濃縮結晶法易出現不合格產品，且造成衣康酸回收率無法提高，而用離子交換來完成的分離較單純的結晶蒸發有更理想的效果。採用離子交換樹脂進行衣康酸的分離提取，衣康酸的粗品回收率達到86%以上。
[0037]本發明接種高產衣康酸菌株於氣升式發酵罐中進行發酵，產酸達到100g/L以上，衣康酸含量= 99.50%，提高了衣康酸產率，減少了設備投資，節能效果明顯，降低了生產成本，更能適應市場需求(注:土麴黴(Aspergillus terreus)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2012年10 月 15 日，保藏編號:CGMCCN0.6413)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]附圖1是以土麴黴為原料，微波誘變獲得高產衣康酸菌株，種子培養，採用氣升式發酵罐發酵，過濾發酵液，經陰離子交換，真空濃縮，乾燥，得到單體衣康酸的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0039]提出以下實例來具體說明，以更好地理解本發明，但本發明的內容並不局限於此。
[0040]實施例1
[0041]土麴黴出發菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，製備單孢子懸液。微波照射15s，將處理過的孢子懸液進行梯度稀釋，塗布於平板。挑平板上透明圈大的單圈落，350C，上搖瓶發酵72h，獲得衣康酸高產菌株，產酸91.6g/L。
[0042]取一環經活化的高產菌種,接種於500ml三角瓶中，於35°C 200r/min往復搖床上、培養2天；以10%接種量轉接至裝有發酵培養基的氣升式發酵罐中，通風量1.5VVm，35°C，發酵3天，產酸104.5g/L。
[0043]用潔淨紗布過濾除去衣康酸發酵液中的菌絲體；添加I %的活性炭，吸附脫色Ih ；將經脫色處理的發酵液泵入過濾器中，去除活性炭及其它不溶物；用溼法將處理好的D311陰離子交換樹脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNa0H溶液，流速為2Bv/h，時間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發酵液,上柱流速為4.0mL/min,最佳洗脫條件為以2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑，洗脫流速為6.0mL/min，其回收率為86.6% ;洗脫液於真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；真空度低至0.08Mpa，升溫至50°C乾燥時間lh，得到單體衣康酸，含量99.68%。
[0044]實施例2
[0045]土麴黴出發菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，製備單孢子懸液。微波照射10s，將處理過的孢子懸液進行梯度稀釋，塗布於平板。挑平板上透明圈大的單圈落，350C，上搖瓶發酵72h，獲得衣康酸高產菌株，產酸92.2g/L。
[0046]取一環經活化的高產菌種,接種於500ml三角瓶中，於35? 250r/min往復搖床上培養2天；以10%接種量轉接至裝有發酵培養基的氣升式發酵罐中，通風量1.0VVm，35°C，發酵3天，產酸105.lg/L。
[0047]用潔淨紗布過濾除去衣康酸發酵液中的菌絲體；添加I %的活性炭，吸附脫色Ih ；將經脫色處理的發酵液泵入過濾器中，去除活性炭及其它不溶物；用溼法將處理好的D311陰離子交換樹脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速為2Bv/h，時間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發酵液,上柱流速為4.5mL/min,最佳洗脫條件為以1.5mol/L的NaOH溶液為 洗脫劑，洗脫流速為6.0mL/min，其回收率為86.3% ;洗脫液於真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；真空度低至0.08Mpa，升溫至50°C乾燥時間lh，得到單體衣康酸，含量99.75%。
[0048]實施例3
[0049]土麴黴出發菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，製備單孢子懸液。微波照射20s，將處理過的孢子懸液進行梯度稀釋，塗布於平板。挑平板上透明圈大的單圈落，350C，上搖瓶發酵72h，獲得衣康酸高產菌株，產酸91.5g/L。
[0050]取一環經活化的高產菌種,接種於500ml三角瓶中，於35? 200r/min往復搖床上培養2天；以12%接種量轉接至裝有發酵培養基的氣升式發酵罐中，通風量1.5VVm，35°C，發酵3天，產酸105.8g/L。
[0051]用潔淨紗布過濾除去衣康酸發酵液中的菌絲體；添加2%的活性炭，吸附脫色Ih ；將經脫色處理的發酵液泵入過濾器中，去除活性炭及其它不溶物；用溼法將處理好的D311陰離子交換樹脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速為2Bv/h，時間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發酵液,上柱流速為4.5mL/min,最佳洗脫條件為以2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑，洗脫流速為5.0mL/min，其回收率為86.9% ;洗脫液於真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；真空度低至0.08Mpa,升溫至50°C乾燥時間lh，得到單體衣康酸，含量99.73%。
【權利要求】
1.一種以土麴黴(Aspergillus terreus)ZSOl為出發菌株,發酵製備單體衣康酸的方法，其特徵在於: 1)微波誘變:土麴黴ZSOl為出發菌株，斜面活化，將孢子用無菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，350C，搖床振蕩活化，製備單孢子懸液。微波照射，將處理過的孢子懸液進行梯度稀釋，塗布於平板。挑平板上透明圈大的單圈落，上搖瓶發酵，獲得衣康酸高產菌株； 2)種子培養:取一環經活化的高產菌種，接種於500ml三角瓶中，於搖床上培養2天； 3)氣升式發酵罐發酵:接種至裝有發酵培養基的氣升式發酵罐中發酵培養； 4)紗布過濾:用潔淨紗布過濾除去衣康酸發酵液中的菌絲體； 5)活性炭脫色:添加I~2%的活性炭，吸附脫色Ih； 6)過濾:將經脫色處理的發酵液泵入過濾器中，去除活性炭及其它不溶物； 7)離子交換樹脂:用溼法將處理好的陰離子交換樹脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速為2Bv/h (Bv表示樹脂床體積)，時間為I~2h，再用去離子水洗至pH8~9，通入衣康酸發酵液， NaOH溶液洗脫； 8)濃縮:洗脫液於真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮； 9)真空乾燥:真空度低至0.08Mpa,升溫乾燥,得到單體衣康酸,含量=99.60%。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟I)所述的斜面培養基(g/L):玉米澱粉 7 ~10、(NH4) 2S043 ~6、MgSO4.7Η200.4、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5、瓊月旨 10 ~16 ;平板培養基(g/L):玉米澱粉 7 ~10、(NH4) 2S044 ~8、MgSO4.7Η200.4、LiCl0.05 ~0.2、溴甲酚綠0.2、ρΗ4.0~4.5、瓊脂10~16 ;發酵培養基(g/L):玉米澱粉8~15、NH4N034~8、MgSO4.7Η200.4、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟I)所述的無菌生理鹽水為0.85%氯化鈉；搖床振蕩活化溫度為30~40°C，時間為0.5~1.5h ;微波照射處理時間為10~25s ；經篩選菌落搖瓶發酵的溫度為30~40°C，時間為48~72h。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述的種子培養基(g/L):玉米澱粉 50 ~60、NH4N035 ~8、MgSO4.7H202、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5 ;種子培養溫度為30~40°C，搖床轉速為150~250r/min。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述的發酵培養基(g/L):玉米澱粉 120 ~150、NH4N036 ~10、MgS04.7H202、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述的接種量為8%~10%，通風量I~1.5vvm,發酵溫度30~40°C。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟7)所述的陰離子交換樹脂為D311。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟7)所述的發酵液上柱流速為3~6mL/min,以I~2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑,洗脫流速為5~8mL/min。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟9)所述的真空乾燥溫度為50°C以上，乾燥時間I~2h。
【文檔編號】C07C51/47GK103468752SQ201310143806
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年4月24日 優先權日:2013年4月24日
【發明者】許波, 賀玉榮 申請人:北京貫虹科技集團有限公司