一種脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑及工藝的製作方法
2023-09-23 02:01:35 4
一種脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑及工藝的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑及工藝。彎曲芽孢桿菌NJNpd41，2012年12月31日保存於中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心，保藏編號CGMCC?NO.7072。一種用NJNpd41水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的方法，包括將菜籽餅調含水量至50%，將NJNpd41菌液接入菜籽餅進行固體發酵，得農業胺基酸肥。使用該發明生產的農業胺基酸肥能夠降解菜餅中所含的毒素的含量，顯著促進茄子植株的生長、增加茄子的產量和提高茄子的品質。
【專利說明】一種脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑及工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑及工藝。
【背景技術】
[0002]菜籽餅資源豐富，其粗蛋白質含量約為37-42%，是一種寶貴的蛋白質資源。菜籽餅中的粗蛋白質80%以蛋白質形式存在，其餘20%為游離胺基酸、芥酸、核酸等。其蛋白質絕大部分為球蛋白，胺基酸含量比較平衡(劉振中用菜籽餅製取胺基酸水解液的試驗研究)。目前比較多方法是利用酸水解法利用菜籽餅中的胺基酸資源，但是工業費用較高且有較大的二次汙染。本發明旨在篩選產蛋白酶微生物，利用其分解菜餅蛋白成農用胺基酸肥供植物利用。
[0003]菜籽餅中含有抗營養因子和有毒成份，對菜籽餅的利用造成很大的障礙。目前對菜籽餅脫毒主要有物理、化學和微生物脫毒法。物理脫毒法作用機理是鈍化芥子酶活性，避免芥子酶將硫甙葡萄糖苷分解產生有毒物質。這種方法具有操作簡單的優點，但它只能鈍化芥子酶，硫甙、單寧、芥子鹼和植酸等物質依然存在，沒有根本解決菜籽餅的無毒化。化學脫毒方法是根據菜籽餅中的硫甙葡萄糖苷的結構和性質，用一定的化學試劑進行處理，使其失去原有毒性的方法。主要有水洗，醇類處理和雙液相萃取法。化學脫毒法有一定的效果，但不能完全清除有毒物質，在工業利用還是存在一定的困難。微生物脫毒法主要利用龐雜的微生物區系和複雜的微生物酶系對菜籽餅中的有毒物質和抗營養因子進行降解。接種微生物後，利用微生物本身分泌出的芥子酶等酶系將硫甙分解成多種具有揮發性的異硫氰酸鹽，主要有3- 丁烯基硫氰酸鹽、4-戊烯基硫氰酸鹽、2-羥基-3- 丁烯基異硫氰酸鹽，還有少量的苯乙基異硫氰酸鹽(孟憲金脫毒方法的研究進展)。微生物種類多，數量大、適應性強、生長快、易培養、代謝產酶系複雜，幾乎可以分解一切天然物質。無論規模和數量，還是發酵作用、分解作用的徹底性，微生物的作用遠遠超過物理化學法。第一，酶系繁雜，分解硫甙的芥子酶多，能夠水解複雜多變的硫甙；第二，`分解中間產物的酶系較複雜，能將其徹底分解，併合成自身物質；第三，菜籽餅的其它抗營養因子也能被微生物分解，如植酸、單寧、纖維素等，提高菜籽餅營養成分的利用率。因此，研究菜餅的脫毒生物酶解工藝，對於推進菜餅源農用胺基酸肥產業，意義重大。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於針對生產實踐中的實際問題和需求，提供一種用於脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑。
[0005]本發明的另一目的是提供脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的工藝。
[0006]本發明的目的可通過以下技術方案實現:
[0007]彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)NJNpd41，2012年12月31日保存於中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.7072。
[0008]彎曲芽孢桿菌NJNpd41為革蘭氏陽性細菌，菌落形態為不規則，表面溼潤，呈淡黃色，鋸齒狀邊緣。
[0009]一種用所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41生產的功能菌液，是將彎曲芽孢桿菌NJNpd41接種到發酵培養液，進行液體發酵生產所得，發酵生產的條件為:pH6.0~7.5，發酵溫度範圍30~35°C，攪拌速度為180~200轉/分鐘，發酵時間為20~24h，使發酵液中含菌IX IOltl個/ml ;所用發酵培養液配方為:葡萄糖10g/L，酵母膏lg，(NH4)2SO4L Og/L,NaCl0.5g/L，其餘為水，ρΗ7.2-7.5。
[0010]本發明所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41在水解菜籽餅生產農用胺基酸肥中的應用。
[0011]一種用所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的方法，包括將菜籽餅調含水量至40%~50%，優選50% ;將所述的功能菌液接入菜籽餅進行固體發酵，每噸菜籽餅中加入功能菌液50L~60L,優選50L ;固體發酵過程中每天翻堆I~2次,記錄堆體溫度，待溫度回降至室溫發酵結束，最後在溫度不超過60°C的條件下將胺基酸有機肥的含水量蒸發至30%以下得農用胺基酸肥。
[0012]按照本發明所述的方法製備的農用胺基酸肥。
[0013]作為本發明的一種優選，所製備的農用胺基酸肥產品，菜籽餅毒素異硫氰酸酯含量0.73mg/g,惡唑烷硫酮含量1.71mg/g,分別比對照(直接添加清水發酵)降低了 64.6%和70.3%。產品中多肽及游離胺基酸總含量為15.05%，全氮含量為7.16%，總氮磷鉀養分為
10.89%、有機質含量61.94%、發芽指數為80%以上、含水量質量比為25_30%。
[0014]本發明所述的農用胺基酸肥在促進茄子生長中的應用。
[0015]有益效果本發明提供一株用於脫毒水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的菌劑及其農用胺基酸肥的生產工藝。
`[0016]使用該發明生產的農業胺基酸肥成本低於傳統工藝，堆肥過程簡化，使用方便，同時發酵過程中彎曲芽孢桿菌NJNpd41菌株能夠降解菜餅中所含的毒素的含量，增加的生物也能改善土壤品質。本發明對於保護生態環境，保護人民的身體健康，提高農產品的附加值具有重要的意義。
[0017]產品與目前市場上的產品相比具有如下優點:
[0018]I)利用彎曲芽孢桿菌NJNpd41對菜籽餅蛋白進行降解生產農用胺基酸肥料，操作簡單，效率較高，肥料中龐大的微生物系統對土壤的改善有一定的作用。
[0019]2)彎曲芽孢桿菌NJNpd41利用複雜的酶系對菜籽餅中的有毒物質和抗營養因子進行降解。接種菌株NJNpd41後，能夠將異硫氰酸酯和惡唑烷硫酮的含量降到安全值以下。國外有報導少孢根黴在堆肥過程中可以將異硫氰酸脂和惡唑烷硫酮含量分別降低43.1%和34%，而在菌株NJNpd41作用下，異硫氰酸脂和惡唑烷硫酮含量分別降低64.6%和70.3%。
[0020]3)試驗結果表明，在茄子幼苗期和茄子大田種植施用本產品後，能顯著促進茄子植株的生長、增加茄子的產量和提高茄子的品質。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1.不同菌種轉化菜餅產生多肽及游離胺基酸含量
[0022]圖2.依據16S rDNA序列構建的NJNpd41號菌株與相關模式菌種的系統發育樹
[0023]圖3.不同接種量產生多肽及游離胺基酸含量
[0024]圖4.41-C、CK-C堆肥過程中溫度變化[0025]圖5. 41C、CKC堆肥過程中多肽及游離胺基酸含量變化
[0026]生物材料保藏信息
[0027]NJNpd41，彎曲芽孢桿菌Bacillus flexus，2012年12月31日保存於中國微生物 菌種保藏管理委員普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科 學院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0. 7072。
【具體實施方式】
[0028]實施例1菌種篩選
[0029]1、菜籽餅的獲得
[0030]由江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司提供。
[0031]2、菌株的分離及鑑定
[0032]將海南採集回的土壤樣品按1 :10(g/v)的比例加入無菌蒸餾水中，充分振蕩後靜 置30分鐘，取3ml上清液加入菜籽餅培養基（10g菜籽餅加入到1L去離子水中），30°C震 蕩培養5天後獲得富集液。取0. 5ml富集液塗布LB酪蛋白平板，30°C培養24h。挑單個 菌苔，點接於LB酪蛋白培養基平板上，培養24h後觀察透明圈的有無，若產生透明圈，分別 測量透明圈和菌落的直徑，並計算其比值，選擇比值較大的菌株進行進一步研究。按5%的 接種量接種菌株於200g生菜籽餅中，調含水量至50%，放入30°C培養箱固體發酵，每天調 含水量保持溼潤，6天後取樣茚三酮比色法測定多肽及游離胺基酸總含量（圖1)。挑選出 轉化胺基酸含量最高的41號菌株進行16s rDNA鑑定並送中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心保存，16S rDNA的PCR反應的5』端引物5』 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』 (Escherichia coli bases8to 27)，3，端引物 5，-TACCTTGTTACGACT T_3，(Escherichia coli basesl507tol492)。擴增反應體系如下：10XTaq聚合酶反應緩衝液5 ii L， dNTP (20mmol ? u L 0 4 u L,引物(25pmol ? u L :)各 2 u L, Mg2+ (25mmol ? u L :) 4 u L,菌體少 許，TaqDNA 聚合酶(5U ? u I71) 0. 5 u L,加水至 50 u L。反應條件：95°C變性 5min, 94。。30s， 55°C 30s，72°C lmin，30個循環；最後72°C延伸lOmin。PCR產物與0. 75%的瓊脂糖凝膠上 電泳檢測。挑選正確大小片段的PCR產物送上海美吉公司測序，根據測定完成的16S rDNA 序列，在RDP資料庫（http ：//rdp. cme. msu. edu/index, jsp)中下載與轉化菌株16S rDNA序 列同源的序列，同時在NCBI資料庫（http ：//www. ncbi. nlm. nih. gov)在線查詢分析，採用 MEGA3. 1軟體構建16S rDNA系統進化樹（圖2)，41號菌株被確認為彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus)，送交中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心，保藏日期為2012年12月31 日，保藏號為CGMCC N0. 7072。
[0033]實施例2、功能菌菌劑的生產
[0034]將菌種保藏號為CGMCC N0. 7072的Bacillus flexus NJNpd41接種至發酵培養液 進行液體發酵生產，發酵條件為：pH7. 0，發酵溫度範圍30-35°C，攪拌速度為180-200轉/ 分鐘，發酵時間為24小時，得功能菌菌液，菌液的含菌或芽孢量> 101(1個/ml。所用發酵培 養液配製方法為，以配製1L培養基為例：葡萄糖10g,酵母膏lg, (NH4)2S041. 0g, NaClO. 5g, 其餘為水，pH7. 2-7. 5 ;121°C滅菌 20min。
[0035]實施例3、固體發酵生 產農用胺基酸肥
[0036]3. 1固體發酵工藝的獲得[0037]利用遞進法獲得固體發酵的工藝，首先將菌液以不同濃度加入菜籽餅堆肥中，發酵堆總重2kg(乾重)，發酵5天，獲得最佳菌液添加量(圖3)，測定每天胺基酸變化得到最佳堆肥天數，獲得最終固體發酵工藝。發酵方式如下:每噸固體有機物料中加入功能菌菌液50L，固體發酵過程中每天翻堆I次，記錄堆體溫度(圖4)，待溫度回降至室溫發酵結束(不同室溫時間不等)，最後在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為成品胺基酸有機肥。發酵完後測定各處理中的胺基酸的含量，結果如圖，5%，16天接種堆肥為最佳配方，多肽及游離胺基酸達到乾重15.05%以上(圖5)。
[0038]3.2固體大堆發酵生產農用胺基酸肥
[0039]根據上述配方和工藝，將菜籽餅按含水量調至50%，發酵堆總重(乾重)20kg，將蛋白酶降解菌NJNpd41接入混合堆，每噸固體有機物料中加入功能菌菌液IL進行條剁式固體發酵，每天翻堆I次，記錄堆體溫度，待溫度回降至室溫發酵結束；設計未加蛋白酶降解菌菜籽餅有機肥作為對照(CK)。發酵結束後新型胺基酸有機肥中多肽及游離胺基酸總含量為15.05% (乾重)，比CK增加了 151.7%。最後再對農用胺基酸肥中殘留菜籽餅毒素異硫氰酸酯及惡唑烷硫酮的含量進行檢測，檢測方法分別參考GB13087-91和GB13089-9，原料菜餅中異硫氰酸脂含量為2.06mg/g，惡唑烷硫酮為5.76mg/g。經過堆肥之後，CK處理中異硫氰酸脂含量為1.66mg/g,惡唑烷硫酮為4.28mg/g。41號菌處理後異硫氰酸酯含量最終為
0.73mg/g, 口惡唑烷硫酮含量最終為1.71mg/g。
[0040]研製成的胺基酸有機肥多肽及游離胺基酸總含量為15.05%、全氮含量為7.16%、總氮磷鉀養分為10.89%、有機質含量61.94%。以上結果表明所研製配方和工藝完全能夠最大化的發酵生產新型胺基酸有機肥，且該胺基酸有機肥完全能夠符合國家標準。
[0041]實施例4、溫室試驗
[0042]I)促生盆栽試驗在江蘇新天地生物有機肥工程中心有限公司溫室(江蘇宜興)裡進行，共設2個對照一個處理，處理組為實施例3中3.2生產的新型胺基酸有機肥41C處理，對照組分別為菜籽餅不加入蛋白酶降`解菌處理(CKC)和化肥對照處理(化肥處理與41C等養分)。作物為茄子，每個處理9盆，每盆裝2 kg土，肥料的添加量為1% (Dff)0肥料與土充分混合均勻，常規管理。定期測定爺子生長指數。結果見表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。I)株高:與兩個對照相比，本專利研製的41C農用胺基酸肥能夠增加植株的株高，較CKC比較移苗後二十天呈現出顯著性差異，一直保持到移苗後50天。2)莖粗:與CKC處理相比，本專利研製的41C農用胺基酸肥能夠增加植株的莖粗，移苗後二十天即表現出顯著性差異。與化肥處理相比，30天以後同樣達到顯著性差異。3)倒三片長:與CKC和化肥對照相比，本專利研製的41C農用胺基酸肥能夠增加植株的倒三片長，移苗後二十天即均表現出顯著性差異。4)倒三葉寬:與CKC處理相比，本專利研製的41C農用胺基酸肥能夠增加植株的倒三葉寬，移苗後二十天即表現出顯著性差異。與化肥處理相比，30天以後達到顯著性差異。5)葉綠素含量:與CKC處理相比，本專利研製的41C處理能夠增加植株的葉綠素含量，移苗後二十天即表現出顯著性差異。6)葉片數量:與CKC處理相比，本專利研製的41C處理能夠增加植株的葉片數量，移苗後二十天即表現出顯著性差異。7)地上部鮮重和乾重:與CKC和化肥處理相比，本專利研製的41C處理能夠增加植株的地上部鮮重和乾重，移苗後20天即均表現出顯著性差異。8)地下部鮮重和乾重:與CKC和化肥處理相比，本專利研製的41C處理能夠增加植株的地下部鮮重和乾重，移苗後20即均表現出顯著性差異。[0043]試驗結果整體表明，本專利研製的胺基酸有機肥能夠促進茄子植株的生長，本發明的配方和工藝能夠顯著促進功能菌的固體發酵效率，增加肥料的養分和去除原料中的毒素，最終促進茄子植株的生長。
[0044]2)促生大田試驗在江蘇宜興某農業園裡進行，共設5個對照一個處理，處理為本專利研製的新型胺基酸有機肥處理41C，對照分別為空白對照(BLK)，原料菜籽餅對照(C)、菜籽餅不加入蛋白酶降解菌發酵對照(CKC)、普通有機肥對照(OOF)和化肥對照(CF)。作物為茄子，每個處理3個小區，每個小區8m2，每小區種21棵苗，肥料的添加量為41C處理160Kg/畝，其他除BLK處理以外，均與41C等養分(養分不足用化肥補齊)，常規管理。測定各處理生產果實的產量及品質，結果見表8:41C較5個對照處理，硝酸鹽含量最低，差異顯著；可溶性糖含量，維生素C及蛋白質含量最高，並且差異顯著，可見41C能夠明顯提高果實的品質。另外，果實產量方面，41C較5個對照處理也最高，並且也差異顯著，可見41C能夠提高作物的產量。不加菌發酵的CKC處理，相比化肥處理，除了維生素C比化肥顯著性高以外，硝酸鹽，可溶性糖，蛋白質以及產量均無顯著性差異，而41C相比CF處理，硝酸鹽顯著降低，可溶性糖，維生素C，蛋白質以及果實產量均顯著性提高，硝酸鹽顯著降低27%，可溶性糖，維生素C，蛋白質以及果實產量分別提高54%，24%，53%和25%。不發酵的菜餅C處理的產量僅僅比空白高，顯著低於其他施肥處理。
[0045]大田試驗最終表明,Bacillus flexus41能夠有效的促進菜餅的酶解,增加其中游離胺基酸和寡肽的含量，發酵研製成的胺基酸有機肥，能夠顯著促進大田茄子的產量和提聞爺子的品質。
[0046]表1不同處理對爺子株高的影響(單位:cm)
[0047]
【權利要求】
1.彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)NJNpd41，2012年12月31日保存於中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.7072。
2.一種用權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41生產的功能菌液，其特徵在於是將彎曲芽孢桿菌NJNpd41接種到發酵培養液，進行液體發酵生產所得，發酵生產的條件為:PH6.0~7.5，發酵溫度範圍30~35°C，攪拌速度為180~200轉/分鐘，發酵時間為20~24h，使發酵液中含菌I X IOltl個/ml ;所用發酵培養液配方為:葡萄糖10g/L，酵母膏lg，(NH4)2SO4L Og/L, NaCl0.5g/L，其餘為水，ρΗ7.2-7.5。
3.權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41在水解菜籽餅生產農用胺基酸肥中的應用。
4.一種用權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的方法，其特徵在於包括將菜籽餅調含水量至40%~50%，將權利要求2所述的功能菌液接入菜籽餅進行固體發酵，每噸菜籽餅中加入菌液50L~60L，固體發酵過程中每天翻堆I~2次，記錄堆體溫度，待溫度回降至室溫發酵結束，最後在溫度不超過60°C的條件下將胺基酸有機肥的含水量蒸發至30%以下得農用胺基酸肥。
5.根據權利要求4所述的用權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌NJNpd41水解菜籽餅生產農用胺基酸肥的方法，其特徵在於包括將菜籽餅調含水量至50%，將權利要求2所述的功能菌液接入菜籽餅進行固體發酵，每噸菜籽餅中加入菌液50L，固體發酵過程中每天翻堆I~2次，記錄堆體溫度，待溫度回降至室溫發酵結束，最後在溫度不超過60°C的條件下將胺基酸有機肥的含水量蒸發至30%以下得農用胺基酸肥。
6.按照權利要求4所述的方法製備的農用胺基酸肥。
7.權利要求6所述的農用胺基酸`肥在促進茄子生長中的應用。
【文檔編號】C12R1/07GK103881948SQ201410089043
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】沈其榮, 李 榮, 劉紅軍, 黃蓉, 文春燕, 張瑞福, 喬策策, 邵鋮 申請人:南京農業大學