一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽與疫苗的製作方法

2023-10-07 07:13:19 3

一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽與疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明涉及豬圓環病毒【技術領域】，特別涉及一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，胺基酸序列見序列表中序列1-4。含有豬圓環病毒2型免疫保護多肽的疫苗。P5013和P1300疫苗首免後42-63d時ELISA抗體滴度和中和抗體滴度明顯升高；淋巴細胞增殖應答以及IL-4和IFN-γ細胞因子顯著高於對照組，P5013疫苗免疫組抗體水平和細胞免疫水平最高；小鼠試驗表明P5013合成肽疫苗誘導產生的PCV2免疫反應最強高。豬體試驗發現，P5013合成多肽疫苗可以誘導豬體產生PCV2特異免疫反應，並降低PCV2強毒攻擊後引起的病毒血症、減輕其臨床症狀和病理損傷，對PCV2具有免疫保護作用。
【專利說明】-種豬圓環病毒2型免疫保護多肽與疫苗
[0001]

【技術領域】 本發明涉及豬圓環病毒【技術領域】，特別涉及一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，還涉 及使用此豬圓環病毒2型免疫保護多肽製備的疫苗。
[0002]

【背景技術】 豬圓環病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2)屬於圓環病毒科圓環病毒屬成員，可 以引起斷奶仔豬多系統衰竭症候群（PMWS)和豬皮炎腎病症候群（PDNS)等多種疾病，給全 球養豬業帶來了巨大經濟損失。Cap蛋白是PCV2的型特異性抗原，具有良好的免疫原性，通 過免疫可以有效產生中和抗體，中和病毒感染，可有效誘導保護性免疫反應抵抗病毒攻擊。 目前，商品化疫苗有PCV2滅活疫苗和PCV2桿狀病毒滅活疫苗，但存在疫苗抗原純度不高和 疫苗價格昂貴等缺點。PCV2 Cap蛋白有多個抗原表位，但其多肽疫苗免疫保護作用尚無報 道。
[0003]


【發明內容】
為了解決以上現有技術中對PCV2 Cap蛋白抗原有無相關免疫保護作用的問題，本發明 提供了一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽。
[0004] 本發明還提供了一種合成肽疫苗誘導產生的PCV2免疫反應強、可以誘導豬體產 生PCV2特異免疫反應、降低PCV2強毒攻擊後引起的病毒血症、減輕其臨床症狀和病理損傷 的豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗。
[0005] 本發明是通過以下步驟得到的： 一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，胺基酸序列如序列表中序列1所示。
[0006] -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，胺基酸序列如序列表中序列2所示。
[0007] -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，胺基酸序列如序列表中序列3所示。
[0008] -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，胺基酸序列如序列表中序列4所示。
[0009] -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗，含有上述任一項所述的豬圓環病毒2型 免疫保護多肽。
[0010] 所述的豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗，優選多肽蛋白濃度為100μ g/mL。
[0011] 所述的豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗，優選將豬圓環病毒2型免疫保護多肽 用DMS0溶解後加入滅菌的PBS緩衝液，將多肽蛋白濃度調整為100 μ g/mL，與ISA50V佐劑 等體積混合，乳化呈油包水型即得。
[0012] 本發明的有益效果： (1) 根據PCV2基因序列，設計合成4種多肽P4101、P5013、P2914和P1300,採用ISA50V 佐劑配製P4101、P5013、P2914和P1300疫苗，小鼠免疫試驗結果顯示，P5013和P1300疫苗 首免後42-63d時ELISA抗體滴度和中和抗體滴度明顯升高，並顯著高於P4101和P2914免 疫組（P〈0. 05);淋巴細胞增殖應答以及IL-4和IFN-γ細胞因子顯著高於對照組相比差異 顯著（P〈0. 05)，而且，P5013疫苗免疫組抗體水平和細胞免疫水平最高； (2) 小鼠試驗發現，其中P5013合成肽疫苗誘導產生的PCV2免疫反應最強高。豬體試 驗發現，P5013合成多肽疫苗可以誘導豬體產生PCV2特異免疫反應、降低PCV2強毒攻擊後 引起的病毒血症、減輕其臨床症狀和病理損傷，首次證明本研究設計的P5013多肽對PCV2 具有免疫保護作用，可用於研製PCV2疫苗。
[0013]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1多肽疫苗免疫小鼠 PCV2 ELISA抗體（A)和中和抗體（B)水平測定結果， 圖2多肽疫苗免疫小鼠的淋巴細胞增殖應答， 圖3多肽疫苗免疫小鼠脾細胞體外誘導的IFN- γ (A)和IL-4 (B)應答， 圖4免疫豬體PCV2 ELISA抗體（A)和中和抗體（B)測定結果， 圖 5 Real-time PCR 標準曲線，X axis: Log copies of pT_SH; Y axis: Ct values, 圖6攻毒後各組豬病毒血症(A)和淋巴組織中病毒含量（B)檢測， 圖7試驗豬肺臟及淋巴結顯微病變（HE染色，400 X)，a- P1503疫苗組；b- Cap疫苗 組；c-攻毒對照組。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明： 實施例1 :多肽及疫苗製備 主要試劑和材料 豬圓環病毒2型（PCV2)SH株由本實驗室分離鑑定保存；ISA50V佐劑購自法國SEPPIC 公司；羊抗小鼠 IgG-HRP、SPA-HRP和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；其他 常規用試劑為國產或進口分析純。
[0015] 多肽序列與合成 根據PCV2 Cap蛋白抗原表位和T細胞表位胺基酸序列，設計如下4條多肽，由上海默 悉生物科技有限公司合成，純度90%以上。
[0016] :如序列表中序列1所示， P5013 :如序列表中序列2所示， P2914 :如序列表中序列3所不， P1300 :如序列表中序列4所示。
[0017] 1.3疫苗製備 將合成多肽用少量DMS0溶解後加入滅菌的PBS緩衝液，將蛋白濃度調整為100μ g/mL， 與ISA50V佐劑等體積混合，乳化呈油包水型即可，4°C保存。
[0018] 2. 1試驗動物和免疫程序 取5周齡清潔級ICR小鼠(揚州大學實驗動物中心）75隻，隨機分為5組，每組15隻。 第1-4組分別接種P4101、P5013、P2914和P1300四種多肽疫苗，首免每隻背部皮下多點注 射0. 2mL，於首免後21d進行加強免疫，每隻背部皮下多點注射0. 2mL。第5組不免疫作為 陰性對照(標記為control組)。於首免後21d、42d、63d每組分別隨機取5隻眼球採血分離 血清，用於ELISA抗體、中和抗體、細胞增殖應答及細胞因子分泌水平等檢測，評價兩種亞 單位疫苗的免疫效果。
[0019] 2. 2 ELISA抗體的檢測 用原核表達的重組Cap蛋白包被酶標板，用碳酸鹽包被緩衝液（pH9. 6)將蛋白濃度 調整為1〇μ g/mL，每孔加入100μ L，37°C放置2小時，4°C過夜，PBST洗滌3次；每孔加入 200 μ L 5%脫脂乳，37°C封閉2小時，PBST洗滌3次，拍幹。血清樣品從1:50開始進行2倍 稀釋，37°C作用1. 5h，棄去孔中樣品，PBST洗滌3次，拍幹；每孔加入1:20000稀釋的酶標 二抗HRP-SPA (檢測豬血清）或HRP-羊抗小鼠 IgG (檢測小鼠血清)，37°C作用lh，棄去孔 中樣品，PBST洗滌3次，拍幹；將TMB顯色液A、B液等體積混合，每孔加入100 μ L，反應 10-15min，加入50 μ L2M H2S04終止反應，在酶標儀上讀取0D450值。以Ρ/Ν > 2. 1的血清 最大稀釋度作為該血清的效價。
[0020] ELISA抗體結果（圖1Α)顯示，4個多肽免疫組在21d均有抗體產生；至42-63d時， P5013和P1300兩免疫組抗體水平已升至較高滴度（1:5000以上)，明顯高於其它各組，差異 顯著（Ρ〈〇· 01 )。
[0021] 2.3中和抗體的檢測 將ΡΚ-15細胞種植96孔細胞板，待檢血清56°C滅活30 min，10000 rpm離心5 min除 菌後，小心吸出上清，用維持液（2%DMEM)將血清按1 : 4、1 : 8、1 : 16、1 : 32，……，作 2的連續倍比稀釋；具體操作如下：取待檢血清及陰性對照血清150 μ L，56°C滅活30 min 後，10000 rpm離心5 min，小心吸出上清120 yL，加入到360 yL的DMEM中，將血清作 1 : 4稀釋，混勻後再從中取出240 yL加入到240 yL新的維持液中，作1 : 8稀釋，依 次類推；將病毒用維持液稀釋至含2000 TCID50/100 μ L，然後將稀釋的血清與等體積的病 毒液(含2000 TCID50/100 yL)混合，於37°C水浴作用lh。棄去已長滿單層ΡΚ-15細胞的 96孔培養板中的營養液，將血清病毒混合液加入到細胞孔中，100 μ L/孔，每個血清稀釋度 作4個重複孔，37°C培養3d。同時設定以下對照：（I )病毒-陰性血清對照，（II)陰性血清 對照，（III)空白對照。並進行間接免疫螢光試驗，結果判定，當病毒-陰性血清對照孔出現 螢光，而陰性血清及空白對照孔均未出現螢光時記錄每個血清稀釋度的螢光孔數。以能夠 完全抑制螢光的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價。
[0022] 中和試驗結果（圖1B)顯示，首免後21天可檢測到PCV2中和抗體，首免後42-63 天中和抗體滴度繼續升高，其中P5013和P1300多肽組中和抗體滴度可達1:16以上，明顯 高於其它兩個多肽組，但差異不顯著（P>〇. 05)。
[0023] 比較而言，P5013多肽能誘導產生更高的體液免疫應答，更好地刺激機體產生特異 性的ELISA和中和抗體。
[0024] 2.4淋巴細胞增殖試驗 將PCV2 SH株病毒液用含10%血清的RPMI-1640培養基調節至20 μ g/mL作為刺激抗 原，每孔加入100 μ L，對照孔加入100 μ L含10%血清的RPMI-1640培養基，各作3個重複 孔。37°C下培養66 h，然後每孔加入40yL MTT(5mg/mL)，37°C下繼續培養4 h。吸棄培養 液，每孔加入100 UL DMS0,振蕩融解結晶，測定0D570nm的值。計算刺激指數：刺激指數 SI =刺激孔的0D值/未刺激孔的0D值。
[0025] 分別在首免後42和63天分離鼠的淋巴細胞，進行PCV2特異性的淋巴細胞增殖試 驗，結果表明，首免後42天各組均沒有明顯淋巴細胞的特異性的增殖，首免後63天可檢測 到兩個免疫組的淋巴細胞增殖應答，其中，P5013和CB1230多肽免疫組的淋巴細胞增殖應 答高於其它多肽免疫組，但差異不顯著（P>〇. 05)，非免疫對照組即control組未產生淋巴 細胞的增殖（圖2)，表明P5013和CB1230多肽可以誘導小鼠產生淋巴細胞增殖應答。
[0026] 2. 5細胞因子的測定 收集免疫後63d時淋巴細胞增殖實驗中各組刺激孔72 h的細胞上清，混勻後測定其中 IL-4及IFN- γ含量，按美國R & D公司鼠 IL-4及IFN- γ說明書進行。
[0027] 分別在首免後6周和首免後9周，應用美國R&D公司的Mouse IL-4及Mouse IFN- γ ELISA檢測試劑盒，檢測免疫鼠的脾細胞體外經特異性PCV2抗原刺激後細胞因子 分泌水平。結果見圖3,表明首免後42天各組IL-4及IFN-γ細胞因子應答均較低，首免後 63天周，P5013免疫組均產生IL-4及IFN-γ細胞因子應答，其次為P1300組，相對對照組 差異顯著（P〈〇. 05)，結果表明，4個多肽均可以誘導小鼠產生細胞因子應答。
[0028] 比較小鼠試驗各項數據，P5013多肽的體液免疫應答及細胞免疫應答水平均高於 其它多肽，故選擇P5013多肽進行豬體免疫攻毒試驗。
[0029] 3. 1試驗動物和免疫程序 20頭25?30日齡斷奶仔豬，經PCR和RT-PCR檢測PCV2和PRRSV為陰性，ELISA檢測抗 體陰性。隨機分為4組，每組5頭。第一組肌肉注射P5013多肽疫苗，lmL/頭，第二組肌肉 注射商品PCV2桿狀病毒載體滅活疫苗(表達PCV2 Cap蛋白基因，全長234aa，德國勃林格 殷格翰公司生產，批號309-415A)，lmL/頭，第三、四組不接種分別作為攻毒對照（Control) 和空白對照（NC)，首次免疫後21天採用相同方法加強免疫。隔離飼養，觀察各組有無異常 表現(發熱、腹瀉、精神不好）以及注射部位有無紅腫反應。首免後第35天進行攻毒，每頭 豬攻毒2mL (PCV2 SH株，105. 5 TCID50/mL，滴鼻，每個鼻孔1 mL)，攻毒後第4、7天每頭豬 腋下和臀部四點注射經弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍蛋白（lmg/mL)，同時腹腔注射10 mL巰基乙酸培養基，第11、19天腹腔注射10 mL巰基乙酸培養基。所有豬在攻毒後25天 均剖殺。攻毒後，每天上午測量每頭豬直腸溫度，上下午兩次觀察有無異常臨床表現(精神 沉鬱、咳嗽、呼吸困難、皮膚被毛、食慾減退)，並進行病變等級判定。首免後21天、35天，攻 毒後25天採血分離血清用於抗體水平的檢測；攻毒後7、11、19天分別採血，分離血清，用於 病毒血症的檢測。攻毒當天和剖殺時每頭豬分別稱重，用於計算每頭豬相對日增重（RDWG= (剖殺時體重-攻毒時體重)/25/攻毒時體重)。剖殺時觀察每頭豬肺臟、淋巴結等臟器大體 病變，取淋巴結、肺臟於10%緩衝福馬林固定，用於組織切片製作和免疫組化實驗。
[0030] 3. 2 ELISA抗體的檢測 抗體檢測方法同小鼠血清抗體檢測方法，酶標記抗體改為1:20000稀釋的SPA-HRP。
[0031] 3.3中和抗體的檢測 分別於一免後21天、二免後14天採集血清，測定中和抗體，方法同2. 3。
[0032] 首免後21和35天血清ELISA抗體與中和抗體檢測結果見圖4,首免後21天 (21dpi)，P5013疫苗免疫組產生ELISA抗體1:800左右，中和抗體可達到1 :10左右；加強 免後14天（35dpi )免疫組血清ELISA抗體已達到較高水平（1:5000左右)，高於PCV2 Cap 蛋白亞單位疫苗組，中和抗體可達到1 :32,與PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗組相似，而對照組 均未檢測到ELISA抗體及中和抗體，表明該多肽疫苗能有效刺激機體產生體液免疫應答。
[0033] 3.4仔豬攻毒後體溫變化與臨床症狀 兩個疫苗免疫組豬臨床表現正常，未見異常反應。攻毒後10內，攻毒對照組有2頭豬 體溫超過了 40°C，攻毒後11天開始，1頭豬開始表現出精神沉鬱，不願走動，被毛粗亂。空 白對照組保持正常。 3. 5相對日增重 結果如表1。攻毒後第0和第25天每頭豬稱重，結果顯示，攻毒後25天攻毒對照組豬 體增重較低，有兩頭消瘦嚴重出現負增重，兩個疫苗免疫組及空白對照組的每頭豬均有明 顯增重。計算相對日增重，兩個疫苗免疫組RDWG與空白對照組相似（Ρ>0. 05)，但明顯高於 攻毒對照組（Ρ〈〇. 05)。
[0034] 表1攻毒後各實驗組豬相對日增重

【權利要求】
1. 一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，其特徵在於胺基酸序列如序列表中序列1所示。
2. -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，其特徵在於胺基酸序列如序列表中序列2所示。
3. -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，其特徵在於胺基酸序列如序列表中序列3所示。
4. 一種豬圓環病毒2型免疫保護多肽，其特徵在於胺基酸序列如序列表中序列4所示。
5. -種豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗，其特徵在於含有權利要求1-4中任一項所 述的豬圓環病毒2型免疫保護多肽。
6. 根據權利要求5所述的豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗，其特徵在於多肽蛋白濃 度為 100 μ g/mL。
7. 根據權利要求5所述的豬圓環病毒2型免疫保護多肽疫苗，其特徵在於將豬圓環 病毒2型免疫保護多肽用DMSO溶解後加入滅菌的PBS緩衝液，將多肽蛋白濃度調整為 100 μ g/mL，與ISA50V佐劑等體積混合，乳化呈油包水型即得。
【文檔編號】A61P31/20GK104098657SQ201410318980
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】姜平, 白娟 申請人:南京農業大學