一種木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法與流程

2023-10-06 19:55:09 1

本發明屬於脆性胚性愈傷組織培養技術領域，具體涉及一種木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法。

背景技術：

木薯(manihotesculentacrantz)是大戟科木薯屬植物，是一種重要的糧食與能源植物。人們通常採用傳統育種方式來改良其品質，但是有些性狀如抗病蟲、降低氰化物含量等只有通過基因工程手段才能改良。而一個有效的再生體系是基因工程手段成功實施的先決條件。脆性胚性愈傷組織是一種直徑≤1mm的組織，在液體培養過程中易分散，增殖快，絕大多數細胞具有全能性，由此可以獲得的高質量的胚性懸浮培養物。因為其可以增大外源基因插入整合產生大量轉化細胞的機率，所以是一種非常理想的基因轉化目標組織。脆性胚性愈傷組織已被用來通過基因槍法，電轉化法和農桿菌介導法獲得轉基因木薯植株。木薯胚性愈傷組織的誘導比較複雜。脆性胚性組織的誘導受基因型影響很大，而且發生頻率很低，且誘導時間長。因此建立一種快速高效的木薯脆性胚性愈傷組織的誘導培養方法，對木薯轉基因育種意義重大。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法，該方法快速高效。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法，包括以下步驟：

(一)脆性胚性愈傷組織誘導

(1.1)選取木薯體胚塊，經預處理後，置於脆性胚性愈傷組織誘導培養基上黑暗培養，誘導產生初生脆性胚性愈傷組織；

(1.2)將初生脆性胚性愈傷組織轉接到新鮮的脆性胚性愈傷組織誘導培養基上增殖擴大培養，獲得脆性胚性愈傷組織；

(二)脆性胚性愈傷組織再生

(2.1)將脆性胚性愈傷組織收集到液體體胚誘導培養基中，震蕩培養後，去除多餘的鬆軟非胚性組織，然後倒掉液體體胚誘導培養基，再將脆性胚性愈傷組織置於體胚誘導培養基中繼續誘導培養產生體胚；

(2.2)將體胚轉接到新鮮體胚誘導培養基上，黑暗條件下對體胚進行擴繁培養，獲得擴繁培養後體胚；

(2.3)將擴繁培養後體胚轉接到體胚成熟培養基上培養，促進體胚成熟為綠色子葉型胚；

(2.4)將綠色子葉型胚轉接到體胚萌發培養基中培養，促進綠色子葉型胚萌發，進而再生成苗，獲得木薯植株。

在上述木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法中：

本發明步驟(1.1)中所述預處理包括將木薯體胚塊置於含有甘露醇的容器中，用透氣封口膜封口，然後將容器置於真空泵中，調節氣壓下降至0.08mpa時開始計時，15～20min後取出，在滅菌過的工作檯中，將上述處理過的木薯體胚塊取出，用滅菌濾紙吸乾水分後，放置在脆性胚性愈傷組織誘導培養基上黑暗培養20～30天，誘導產生初生脆性胚性愈傷組織，其中甘露醇的濃度為250～300mmol/l。

優選的，本發明步驟(1.1)中所述預處理包括將木薯體胚塊置於含有甘露醇的容器中，用透氣封口膜封口，然後將容器置於真空泵中，調節氣壓下降至0.08mpa時開始計時，15min後取出，在滅菌過的工作檯中，將上述處理過的體胚塊取出，用滅菌濾紙吸乾水分後，放置在脆性胚性愈傷組織誘導培養基上黑暗培養30天，誘導產生初生脆性胚性愈傷組織，其中甘露醇的濃度為300mmol/l。

本發明木薯體胚塊先經純化處理，純化是將體胚塊周圍的非胚性愈傷組織儘量清除乾淨。將木薯體胚塊置於甘露醇中具有調節體胚塊滲透勢的作用，調節氣壓抽真空可以將體胚塊與甘露醇充分接觸。

本發明中的木薯體胚塊優選來源於華南6號木薯，也可以採用華南8號木薯等其它品種的木薯。

本發明步驟(1.1)～(1.2)中脆性胚性愈傷組織誘導培養基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括以下成分：gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)、蔗糖和瓊脂粉，其中1lgd中加入2,4-d8～12mg、蔗糖15～20g、瓊脂粉10～15g。

優選的，本發明步驟(1.1)～(1.2)中1l脆性胚性愈傷組織誘導培養基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括以下成分：gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lgd中加入2,4-d8mg、蔗糖15g、瓊脂粉10g。

本發明脆性胚性愈傷組織誘導培養基作用是誘導體胚脫分化產生脆性胚性愈傷組織。胚性愈傷組織是鬆散的，球狀，有胚活性的細胞團組織。脆性胚性愈傷組織誘導培養基中gd是為組織生長提供基本的氮磷鉀鈣、鐵鹽、微量元素和有機物等營養成分，2,4-d是促進體胚脫分化的類生長素物質。蔗糖為組織的生長提供碳源。瓊脂粉是起將培養基固化的作用。

本發明步驟(1.2)中將初生脆性胚性愈傷組織轉接到脆性胚性愈傷組織誘導培養基上增殖擴大培養，2～3周(更佳為2周)繼代一次可獲得大量脆性胚性愈傷組織。

進一步的，該脆性胚性愈傷組織可用於轉基因、原生質體提取等。

本發明步驟(2.1)中體胚誘導培養基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括以下成分：nms培養基(newmurashigeandskoog)、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lnms培養基中加入有2,4-d8～10mg、蔗糖20～30g、瓊脂粉7.5～8.5g。

優選的，本發明步驟(2.1)中1l體胚誘導培養基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括以下成分：nms培養基(newmurashigeandskoog)、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lnms培養基中加入有2,4-d8mg、蔗糖25g、瓊脂粉7.5g。

其中nms培養基是將ms(murashigeandskoog)培養基中cacl2用量擴大為原來的5倍，其它ms培養基成分不變獲得的，使用前調節ph到6.0～6.2，高溫高壓滅菌20min；液體體胚誘導培養基不包括瓊脂粉。

本發明中nms為組織生長提供基本的氮磷鉀鈣、鐵鹽、微量元素和有機物等營養成分，2,4-d是促進脆性胚性愈傷組織分化的類生長素物質。蔗糖為組織的生長提供碳源。瓊脂粉是起將培養基固化的作用。

本發明步驟(2.1)中將脆性胚性愈傷組織收集到液體體胚誘導培養基中，震蕩培養1～2h後(1h更佳)，去除多餘的鬆軟非胚性組織，然後倒掉液體體胚誘導培養基，再將脆性胚性愈傷組織置於體胚誘導培養基中繼續誘導培養3～4周(更佳為3周)產生體胚，培養溫度為25～27℃，黑暗培養。

本發明步驟(2.2)中將體胚轉接到新鮮體胚誘導培養基上，調節溫度為25～27℃，黑暗條件下對體胚進行擴繁培養，每隔1個月繼代一次，獲得擴繁培養後的體胚。

擴繁培養時可以根據需求進行，如需要的體胚多，可多繼代幾次。

本發明步驟(2.3)中體胚成熟培養基包括以下成分：ms、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中加入有蔗糖20～30g、瓊脂粉7.5～8.5g。

優選的，本發明步驟(2.3)中體胚成熟培養基包括以下成分：ms、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中加入有蔗糖25g、瓊脂粉7.5g。

其中體胚成熟培養基作用是將體胚誘導成帶綠色子葉型體胚。ms為組織生長提供基本的氮磷鉀鈣、鐵鹽、微量元素和有機物等營養成分。蔗糖為組織的生長提供碳源。瓊脂粉是起將培養基固化的作用。

本發明步驟(2.3)中將擴繁培養後的體胚轉接到體胚成熟培養基上培養，培養溫度為25～27℃，光照時間為15～17h/天，光照強度為3000～4000lx，培養7～15d，促進體胚成熟為綠色子葉型胚。

優選的，本發明步驟(2.3)中將擴繁培養後的體胚轉接到體胚成熟培養基上培養，培養溫度為25～27℃，光照時間為16h/天，光照強度為4000lx，光照時間為10d，促進體胚成熟為綠色子葉型胚。

本發明步驟(2.4)中體胚萌發培養基中包括以下組分：ms、6-ba、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中加入6-ba0.7～0.9mg、蔗糖20～30g、瓊脂粉7.5～8.5g。

優選的，本發明步驟(2.4)中1l體胚萌發培養基中包括以下組分：ms、6-ba、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中加入6-ba0.8mg、蔗糖25g、瓊脂粉7.5g。

本發明中體胚萌發培養基作用是誘導子葉型胚發芽再生成植株。其中ms為組織生長提供基本的氮磷鉀鈣、鐵鹽、微量元素和有機物等營養成分。6-ba是促進芽萌發的細胞分裂素，蔗糖為組織的生長提供碳源。瓊脂粉是起將培養基固化的作用。

本發明步驟(2.4)中將綠色子葉型胚轉接到體胚萌發培養基中培養，培養溫度為25～27℃，光照時間為15～17h/天，光照強度為3000～4000lx，培養25～35d，促進綠色子葉型胚萌發，進而再生成苗，獲得木薯植株。

優選的，本發明步驟(2.4)中將綠色子葉型胚轉接到體胚萌發培養基中培養，培養溫度為25～27℃，光照時間為16h/天，光照強度為4000lx，培養30d，促進綠色子葉型胚萌發，進而再生成苗，獲得木薯植株。

與現有技術相比，本發明具有如下優點：本發明木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法具有脆性胚性愈傷組織誘導產生時間短，產生率高的優點，且木薯優選為華南8號和華南6號等常規栽培品種。

附圖說明

圖1為實施例1中木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法中獲得各組織的圖片，其中a體胚塊；b：初生脆性胚性愈傷組織；c：脆性胚性愈傷組織；d：脆性胚性愈傷組織誘導產生體胚；e：體胚成熟為子葉型胚；f：子葉型胚萌發成植株。

具體實施方式

下面結合附圖以及具體實施方式，對本發明做進一步描述：

實施例1

本實施例提供的木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法，包括以下步驟：

(一)、脆性胚性愈傷組織誘導

(1.1)將純化的木薯體胚塊置於裝有300mmol/l甘露醇的三角瓶中，用透氣封口膜封口；將上述三角瓶放入真空泵，打開開關，關閉進氣閥，當氣壓下降至0.08mpa時開始計時，15min後，取出；在滅菌過的超淨工作檯中，將上述處理過的體胚塊取出，用滅菌濾紙吸乾水分後，放置在fecim上黑暗培養20d，誘導產生初生脆性胚性愈傷組織；

(1.2)在體視顯微鏡下，將初生脆性胚性愈傷組織轉接到新鮮的fecim上增殖擴大培養，2周繼代一次獲得大量脆性胚性愈傷組織，可用於轉基因、原生質體提取等。

(二)脆性胚性愈傷組織再生

(2.1)將脆性胚性愈傷組織收集到液體seim(就是seim不加瓊脂粉)中，震蕩培養1h，去除多於的鬆軟非胚性組織，然後倒掉液體seim培養基，將脆性胚性愈傷組織放到seim培養基上，25～27℃，黑暗培養約3周誘導產生體胚；

(2.2)將體胚轉接到新鮮seim培養基上，25～27℃，黑暗培養，可對體胚進行擴繁培養，可每隔1個月繼代一次；

(2.3)將體胚轉接到semm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，約10d，促進體胚成熟為綠色子葉型胚；

(2.4)將綠色子葉型胚轉接到segm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，約1個月，促進綠色子葉型胚萌發，進而再生成苗。

在上述木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法中：

脆性胚性愈傷組織誘導培養基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lgd中包括10mg2,4-d、蔗糖15g、瓊脂粉10g。

體胚誘導培養基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括nms、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lnms中加入2,4-d8mg、蔗糖30g、瓊脂粉8g，nms為(murashigeandskoog)ms培養基，其中cacl2工作濃度為15mmol/l。

體胚成熟培養基(somaticembryomaturationmedium,semm)包括ms、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中包括蔗糖25g、瓊脂粉7.5g。

體胚萌發培養基(somaticembryogerminationmedium，segm)包括ms、6-ba、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中包括6-ba0.9mg、蔗糖25g、瓊脂粉7.5g。

上述培養基，滅菌前調ph到6.0，高溫高壓滅菌20min。

通過該方法，脆性胚性愈傷組織的初始誘導率達90％以上，且獲得的脆性胚性愈傷組織可以再被誘導形成體胚，並萌發再生成植株(如圖1中所示)。

實施例2

本實施例提供的木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法，包括以下步驟：

(一)、脆性胚性愈傷組織誘導

(1.1)將純化的木薯體胚塊置於裝有300mmol/l甘露醇的三角瓶中，用透氣封口膜封口；

將上述三角瓶放入真空泵，打開開關，關閉進氣閥，當氣壓下降至0.08mpa時開始計時，20min後，取出；

在滅菌過的超淨工作檯中，將上述處理過的體胚塊取出，用滅菌濾紙吸乾水分後，放置在fecim上黑暗培養25d，誘導產生初生脆性胚性愈傷組織；

(1.2)在體視顯微鏡下，將初生脆性胚性愈傷組織轉接到新鮮的fecim上增殖擴大培養，3周繼代一次獲得大量脆性胚性愈傷組織，可用於轉基因、原生質體提取等。

(二)脆性胚性愈傷組織再生

(2.1)將脆性胚性愈傷組織收集到液體seim(就是seim不加瓊脂粉)中，震蕩培養1h，去除多於的鬆軟非胚性組織，然後倒掉液體seim培養基，將脆性胚性愈傷組織放到seim培養基上，約3周誘導產生體胚，25～27℃，黑暗培養；

(2.2)將體胚轉接到新鮮seim培養基上，25～27℃，黑暗培養，可對體胚進行擴繁培養，可每隔1個月繼代一次；

(2.3)將體胚轉接到semm上，25～27℃，16h，3000～4000lx光照，培養約7d，促進體胚成熟為綠色子葉型胚；

(2.4)將綠色子葉型胚轉接到segm上，25～27℃，16h，3000～4000lx光照，約35d，促進綠色子葉型胚萌發，進而再生成苗。

在上述木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法中：

脆性胚性愈傷組織誘導培養基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lgd中包括8mg2,4-d、蔗糖18g、瓊脂粉12.5g。

體胚誘導培養基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括nms、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lnms中加入2,4-d10mg、蔗糖25g、瓊脂粉7.5g，nms為ms(murashigeandskoog)培養基，其中cacl2工作濃度為15mmol/l。

體胚成熟培養基(somaticembryomaturationmedium,semm)包括ms、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中包括蔗糖30g、瓊脂粉8g。

體胚萌發培養基(somaticembryogerminationmedium，segm)包括ms、6-ba、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中包括6-ba0.8mg、蔗糖25g、瓊脂粉8g。

上述培養基，滅菌前調ph到6.1，高溫高壓滅菌20min。

通過該方法，脆性胚性愈傷組織的初始誘導率達90％以上，且獲得的脆性胚性愈傷組織可以再被誘導形成體胚，並萌發再生成植株。

實施例3

本實施例提供的木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法，包括以下步驟：

(一)、脆性胚性愈傷組織誘導

(1)將純化的華南8號木薯體胚塊置於裝有250mmol/l甘露醇的三角瓶中，用透氣封口膜封口；

(2)將上述三角瓶放入真空泵，打開開關，關閉進氣閥，當氣壓下降至0.08mpa時開始計時。20min後，取出；

(3)在滅菌過的超淨工作檯中，將上述處理過的體胚塊取出，用滅菌濾紙吸乾水分後，放置在fecim上黑暗培養30d，誘導產生初生脆性胚性愈傷組織；

(4)在體視顯微鏡下，將初生脆性胚性愈傷組織轉接到新鮮的fecim上增殖擴大培養，2周繼代一次獲得大量脆性胚性愈傷組織，可用於轉基因、原生質體提取等。

(二)脆性胚性愈傷組織再生

(1)將脆性胚性愈傷組織收集到液體seim(就是seim不加瓊脂粉)中，震蕩培養1h，去除多於的鬆軟非胚性組織，然後倒掉液體seim培養基，將脆性胚性愈傷組織放到seim培養基上，，25～27℃，黑暗培養，約3周誘導產生出體胚；

(2)將體胚轉接到新鮮seim培養基上，25～27℃，黑暗培養，可對體胚進行擴繁培養，可每隔1個月繼代一次；

(3)將體胚轉接到semm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，約15d，促進體胚成熟為綠色子葉型胚；

(4)將綠色子葉型胚轉接到segm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，約25d，促進綠色子葉型胚萌發，進而再生成苗。

在上述木薯脆性胚性愈傷組織的培養方法中：

脆性胚性愈傷組織誘導培養基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lgd中包括2,4-d12mg、蔗糖20g、瓊脂粉15g。

體胚誘導培養基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括nms、2,4-d、蔗糖和瓊脂粉，其中1lnms中加入2,4-d9mg、蔗糖20g、瓊脂粉8.5g，nms為(murashigeandskoog)ms培養基，其中cacl2工作濃度為15mmol/l。

體胚成熟培養基(somaticembryomaturationmedium,semm)包括ms、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中包括蔗糖30g、瓊脂粉7.5g。

體胚萌發培養基(somaticembryogerminationmedium，segm)包括ms、6-ba、蔗糖和瓊脂粉，其中1lms中包括6-ba0.7mg、蔗糖25g、瓊脂粉8g。

上述培養基，滅菌前調ph到6.2，高溫高壓滅菌20min。

通過該方法，脆性胚性愈傷組織的初始誘導率達90％以上，且獲得的脆性胚性愈傷組織可以再被誘導形成體胚，並萌發再生成植株。

對本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應該屬於本發明權利要求的保護範圍之內。