檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法及裝置的製作方法

2023-10-24 14:53:52

專利名稱：檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法及裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種離體鼠脛骨骨細胞實時鈣信號檢測技術，用於研究骨力學信號轉導和骨適應的相關機理，為臨床骨質疏鬆症的病因學和治療學的研究提供更深入而科學的理論依據。
背景技術：
骨質疏鬆症(OP)是臨床上最為常見的疾病之一，表現為骨量的降低、骨組織的微結構衰退以及骨脆性的增加，常導致骨折的發生及肢體功能永久性喪失。隨著我國人口老齡化速度的加劇，OP給我國帶來的經濟和社會負擔也逐年加重。19世紀著名的WolfT定律提出:骨骼作為機體的應力承載系統，其能夠通過改變自身的結構以對外界應力刺激作出適應性改變，而OP發生的主要原因之一就是骨骼上的應力負荷不足或骨骼自身應力響應能力衰退，造成骨鈣大量丟失，進而誘發0P。但是，這種骨適應原理的具體發生機制目前仍未徹底闡明，骨組織是如何響應、轉導外界應力刺激的，目前仍不得而知。骨細胞(OCY)是成骨細胞(OB)的終端分化細胞,約佔骨中細胞總數的95%，它們沉積在骨礦化基質中，彼此相連形成OCY細胞網絡。OCY細胞網絡是響應外界力學刺激的主要組件，OCY能響應外界的應力刺激從而調控OB和破骨細胞(OC)的生物活性和功能。因此，深入研究OCY力學信號響應及轉導的機制，對於進一步揭示骨適應的機制，深入了解OP的發生機理具有重要的意義。鈣信號是機體中最重要的第二信使分子 ，它可以將細胞外的信號傳導入細胞內，從而調控細胞的各種生理功能，包括增殖、分化及凋亡等。同時，鈣信號也是最重要的力學信號轉導分子，已被發現是多個機體組織內在應力刺激下最早發生變化的信號轉導分子。目前，國際上研究應力刺激對於骨細胞鈣信號響應的方法主要採用體外實驗的方法，即在細胞表面施加應力的刺激，包括流體剪切力、細胞壓痕、基底拉伸等。但是，體外細胞實驗無法真實的模擬骨細胞的原位生長環境，同時體外骨細胞分離培養也很難保持其生物學特性與其在體環境中的完全一致。因此，能夠實時的監測原位細胞內鈣信號並深入研究其特徵對於研究細胞力學信號轉導有著十分重要的意義，它相比於體外細胞鈣信號研究具有更加明顯的優勢。目前國內外尚未見研究報導。在動態的應力載荷作用下，會引起組織發生壓縮和彎曲形變，而即使極其細微的形變也會引起雷射共聚焦焦距的顯著偏移。因此，原位骨細胞鈣信號應力轉導的主要技術挑戰在於如何在周期載荷的作用下克服組織在顯微鏡下的焦點偏移。

發明內容
本發明針對上述周期載荷作用下原位骨細胞鈣信號研究存在的技術挑戰，提出了一種離體鼠脛骨骨細胞鈣信號實時檢測的方法及裝置，該方法採用雷射共聚焦採集和應力加載同步的技術，能夠顯著抑制周期載荷作用引起的雷射共聚焦顯微鏡焦點偏移，從而能夠精確採集和測量原位骨細胞鈣信號響應。
為達到以上目的，本發明是採取如下技術方案予以實現的:—種檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法，其特徵在於，包括下述步驟:(I)將標記有Fluo-SAM鈣螢光探針的鼠脛骨固定於一個腔室中的組織固定器中間，腔室內填充以37°C細胞培養液淹沒該鼠脛骨，將一個雷射共聚焦顯微鏡鏡頭對著於腔室下面的石英晶片，使脛骨前內側平坦區域的鈣離子在雷射共聚焦顯微鏡中成像，組織固定器的一端固定，另外一端施以應力加載作用於鼠脛骨產生軸向的壓縮載荷，使脛骨前內側的鈣成像表面同時產生軸向的壓縮形變和垂直於軸向的彎曲形變；(2)雷射掃描共焦顯微鏡每5秒進行一次面掃描,共進行180巾貞的圖像掃描,其中前5幀的採樣作為基線控制；(3)應力加載開始於第5巾貞和第6巾貞掃描的間歇,米用周期動態加載方式,基本波形為斜坡加載，包括2-N的預加載，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通過控制加載的速率分別產生斜坡尖峰為8-N的加載波形，兩個加載周期之間的滯留時間為4秒，共加載175周期。上述方法中，所述的雷射掃描共焦顯微鏡每5秒進行一次面掃描包括1.1秒的掃描時間以及3.9秒的間歇時間。所述每個加載周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相
坐寸ο一種檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載裝置，其特徵在於，包括依次軸向連接的線性促動器、壓力傳感器、組織固定器、信號採集和處理模塊，其中，組織固定器用於夾持鼠脛骨試樣並置於一個盛 有細胞培養液的腔室中，腔室的底部為石英晶片，組織固定器的一端固定，另一端通過線性促動器在鼠脛骨試樣上產生軸向的壓縮載荷；石英晶片下方設有雷射共聚焦顯微鏡鏡頭，雷射共聚焦顯微鏡發射的螢光通過石英晶片到達鼠脛骨試樣組織中的任意層面，通過捕獲反射光從而觀測骨細胞的原位鈣信號；所述信號採集和處理模塊將離體鼠脛骨應力、位移和應變電信號進行調製放大後進行轉換，再通過PC中的Labview控制程序通過運動控制器控制線性促動器的動作。上述方案中，所述的組織固定器固定端通過線性軸承固定。本發明應力加載裝置以及雷射掃描共聚焦採集與應力加載同步方法可以顯著地克服在動態載荷作用下所產生的焦點偏移，從而能夠進行精確的實時原位骨細胞鈣信號的採集和分析。本發明方法使研究原位的骨細胞力學信號轉導成為可能，而原位骨細胞鈣信號響應的研究具有體外細胞實驗所無法比擬的優勢。該研究代表著骨力學信號轉導研究領域的一個重要的技術突破，為我們深入的探究骨適應和骨力學信號轉導的相關機制提供了重要的方法學上的支撐。
以下結合附圖及具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。

圖1為本發明的與雷射共聚焦顯微鏡整合的離體鼠脛骨應力加載裝置的結構示意圖。圖2為圖1加載裝置中離體鼠脛骨應力加載信號採集、處理及控制的原理框圖。圖3為本發明雷射共聚焦採集和應力加載同步的方法示意圖。其中A圖為圖1加載裝置中被測式樣及裝載部分；B圖為小鼠脛骨試樣示意圖；C圖為雷射共聚焦採集和應力加載同步示意圖。圖1至圖3中:1、線性促動器；2、壓力傳感器；3、線性軸承；4、組織固定器；5、腔室；6、石英晶片；7細胞培養液；8、應力加載；9、雷射共聚焦顯微鏡鏡頭；10、平坦區域。圖4為圖1加載裝置與液壓式萬能材料試驗機的楊氏模量比較圖。圖5為使用本發明方法進行動態應力載荷作用下的小鼠脛骨原位骨細胞和成骨細胞鈣信號採集示意圖。其中:A圖為成骨細胞在Fluo-SAM鈣螢光探針染色後使用雷射共聚焦顯微鏡採集的照片圖為骨細胞在Fluo-SAM鈣螢光探針染色後使用雷射共聚焦顯微鏡採集的照片；C圖的六個信號曲線分別為A圖中所標記的六個成骨細胞所對應的標準化的細胞鈣螢光信號；D圖的六個信號曲線分別為B圖中所標記的六個骨細胞所對應的標準化的細胞鈣螢光信號。
具體實施例方式如圖1所示，一種可與雷射共聚焦顯微鏡整合的離體鼠脛骨應力加載裝置，包括線性促動器1、壓力傳感器2、線性軸承3、組織固定器4、腔室5。腔室為一個直徑為10cm，深度為2cm的圓形腔室，用以填充細胞培養液7以維持實驗小(大)鼠的脛骨中骨細胞的活性。腔室的底部是厚度為Imm的圓形石英晶片6。組織固定器4置於腔室中，組織固定器底端具有圓形的孔洞，用以固定鼠脛骨並防止加載中的滑動。組織固定器固定端通過線性軸承固定，以防止側向位移的發生。組織固定器與線性促動器之間由壓力傳感器連接，以測量脛骨所承受的壓縮應力。該應力加載裝置可以與雷射掃描共聚焦顯微鏡相整合，即在石英晶片下方設有雷射共聚焦顯微鏡鏡頭(圖3A)，雷射共聚焦顯微鏡發射的螢光通過石英晶片6到達鼠脛骨試樣組織中的任意層面，通過捕獲反射光從而觀測骨細胞的原位鈣信號；並同步在鼠脛骨兩端產生動態的生理水平的壓縮載荷(應力為0-20N，應變為0-2000 μ ε )，參見圖2，應力加載裝置採集的應力(壓力傳感器)、位移(線性促動器)和應變(骨試樣上粘附微應變片測量獲得)電信號通過信號採集和處理模塊中的調製放大器進行信號的濾波和放大，放大後的三路模擬信號信送入數據採集卡DAQ進行信號的轉換和數據採集。通過PC端的Labview控制程序可以通過人機互動界面實時的顯示採集的應力、位移和應變信息，並可以通過Labview控制端發送命令至線性促動器的運動控制器從而可以控制線性促動器的動作。如圖3所示，本發明雷射共聚焦採集和應力加載同步方法如下:三月齡雌性C57BL/6J小鼠購於第四軍醫大學實驗動物中心，採用CO2吸入法至小鼠死亡，立即採用無菌醫用外科手術剪刀和鑷子迅速提取小鼠脛骨組織。在無菌條件下，使用a-MEM細胞培養液浸溼的無菌醫用紗布剝離包繞脛骨的肌肉和其表面的骨膜。使用a-MEM細胞培養液反覆清洗脛骨5分鐘，清洗完畢後立即將脛骨浸入a -MEM細胞培養液中，於37°C、5%C02環境培養2小時。將小鼠脛骨浸於15 μ M的Fluo-8AM鈣螢光探針的a -MEM細胞培養液中30分鐘，反覆清洗3遍後將脛骨樣本固定於組織固定器4中間。

如圖3Α所示，腔室5中填充以37°C的a -MEM細胞培養液7以維持細胞的正常生物學活性。組織固定器4的一端固定，另一端施以應力加載8作用於小鼠脛骨遠端產生軸向的壓縮載荷，將一個雷射共聚焦顯微鏡鏡頭9對著於腔室下面的石英晶片6，脛骨前中側的平坦區域10面向雷射共聚焦顯微鏡鏡頭。從而在脛骨前內側的鈣成像表面同時產生軸向的壓縮形變和垂直於軸向的彎曲形變。調節雷射共聚焦顯微鏡鏡頭9的焦點，大量的成骨細胞可以在位於骨膜下方 ο μ M位置發現，而大量的骨細胞則位於骨膜下方>40 μ M的位置。雷射掃描共焦顯微鏡每5秒進行一次面掃描(包括1.1秒的掃描時間以及3.9秒的間歇時間)，每幀圖像大小為512X512像素。雷射掃描共焦顯微鏡共進行180幀(共900秒)的圖像掃描，其中前5幀的採樣作為基線控制。應力加載開始於第5幀和第6幀雷射共聚焦掃描的間歇。應力加載8採用周期動態加載方式，基本加載的波形為斜坡加載，包括2-Ν的預加載，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通過控制加載的速率分別產生斜坡尖峰為8-Ν的加載波形，兩個加載周期之間的滯留時間為4秒，共加載175周期。在進行雷射掃描共聚焦的過程中，整個系統嚴格地工作在位移控制模式，即每個加載周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相等。該套應力加載裝置以及雷射掃描共聚焦採集與應力加載同步方法可以明顯克服在動態載荷作用下所產生的焦點偏移。為了評價該應力加載系統的測量精度，我們通過使用長為15mm、直徑為3mm超高分子量的聚乙烯(UHMWPE)材料的圓柱體樣本對該應力加載系統進行校驗。其方法包括，使用本發明中的可與雷射共聚焦顯微鏡整合的離體鼠脛骨應力加載系統對該UHMWPE小圓柱體樣本進行軸向壓縮實驗，將該樣本固定於組織固定器4中間，預加載大小為0.5N，確保該樣本的軸向保持完全的水平，通過Labview控制端向線性促動器I發送命令，令其施加5 μ m/sec的軸向壓縮載荷，直至樣本所承受的載荷達到12N，立刻停止線性促動器的動作，實時的記錄位移和應力隨時間的變化關係，通過以下公式計算該樣本的楊氏模量(Young’sModulus):
權利要求
1.一種檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法，其特徵在於，包括下述步驟: (1)將標記有F1U0-8AM鈣螢光探針的鼠脛骨固定於一個腔室中的組織固定器中間，腔室內填充以37°C細胞培養液淹沒該鼠脛骨，將一個雷射共聚焦顯微鏡鏡頭對著於腔室下面的石英晶片，使脛骨前內側平坦區域的鈣離子在雷射共聚焦顯微鏡中成像，組織固定器的一端固定，另外一端施以應力加載作用於鼠脛骨產生軸向的壓縮載荷，使脛骨前內側的鈣成像表面同時產生軸向的壓縮形變和垂直於軸向的彎曲形變； (2)雷射掃描共焦顯微鏡每5秒進行一次面掃描，共進行180幀的圖像掃描，其中前5幀的採樣作為基線控制； (3)應力加載開始於第5幀和第6幀掃描的間歇，採用周期動態加載方式，基本波形為斜坡加載，包括2-N的預加載，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通過控制加載的速率分別產生斜坡尖峰為8-N的加載波形，兩個加載周期之間的滯留時間為4秒，共加載175周期。
2.如權利要求1所述的檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法，其特徵在於，所述雷射掃描共焦顯微鏡每5秒進行一次面掃描包括1.1秒的掃描時間以及3.9秒的間歇時間。
3.如權利要求1所述的檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法，其特徵在於，所述每個加載周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相等。
4.一種檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載裝置，其特徵在於，包括依次軸向連接的線性促動器、壓力傳感器、組織固定器、信號採集和處理模塊，其中，組織固定器用於夾持鼠脛骨試樣並置於一個盛有細胞培養液的腔室中，腔室的底部為石英晶片，組織固定器的一端固定，另一端通過線性促動器在鼠脛骨試樣上產生軸向的壓縮載荷；石英晶片下方設有雷射共聚焦顯微鏡鏡頭，雷射共聚焦顯微鏡發射的螢光通過石英晶片到達鼠脛骨試樣組織中的任意層面，通過捕獲反射光從而觀測骨細胞的原位鈣信號；所述信號採集和處理模塊將離體鼠脛骨應力、位移和應變電信號進行調製放大後進行轉換，再通過PC中的Labview控制程序通過運動控制器控制線性促動器的動作。
5.如權利要 求4所述的檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載裝置，其特徵在於，所述的組織固定器固定端通過線性軸承固定。
全文摘要
本發明公開了一種檢測離體鼠脛骨鈣的雷射共聚焦同步應力加載方法及裝置，其特徵在於，將鼠脛骨固定於一個腔室中的組織固定器中間，腔室內充以細胞培養液，一個雷射共聚焦顯微鏡鏡頭通過腔室下面的石英晶片，每5秒進行一次面掃描，將脛骨前內側平坦區域的鈣在顯微鏡中成像；組織固定器的一端固定，另外一端施以動態、周期的應力加載方式作用於鼠脛骨產生軸向的壓縮載荷，使脛骨前內側的鈣成像表面同時產生軸向的壓縮形變和垂直於軸向的彎曲形變。本發明能夠顯著抑制周期載荷作用引起的雷射共聚焦顯微鏡焦點偏移，使精確的採集和測量應力誘發的原位骨細胞鈣信號響應成為可能，從而有利於揭示骨力學信號轉導、骨適應及骨質酥鬆症發生的相關機理。
文檔編號G01N21/64GK103245645SQ201310132379
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者景達, 羅二平, 郭向東, 申廣浩, 姜茂剛, 李飛江, 謝康寧, 吳小明, 湯池, 郭偉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學